專利名稱：蛋白masp作為結(jié)腸直腸癌標(biāo)志的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)腸直腸癌的診斷。它公開了MASP(乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑(maspin)前體)蛋白在結(jié)腸直腸癌診斷中的用途。另外，它特別涉及從來自個(gè)體的液體樣品診斷結(jié)腸直腸癌的方法，該方法通過測(cè)量所述樣品中的MASP進(jìn)行診斷。MASP的測(cè)量可以用于例如結(jié)腸直腸癌的早期檢測(cè)或診斷。
盡管檢測(cè)和治療的進(jìn)展，癌癥仍然是主要的公共健康挑戰(zhàn)。在多種類型的癌癥中，結(jié)腸直腸癌(＝CRC)是西方世界最常見的癌癥之一。
癌癥能夠越早得到檢測(cè)/診斷，總生存率就越高。對(duì)于CRC，這一點(diǎn)尤其正確。晚期腫瘤的預(yù)后差。三分之一以上的患者將在診斷后五年內(nèi)死于進(jìn)行性疾病，相應(yīng)為約40％的五年生存率。目前的治療僅僅治愈一部分患者，而且對(duì)在疾病早期診斷的那些患者顯然具有最佳作用。
關(guān)于作為公共健康問題的CRC，有必要發(fā)展對(duì)結(jié)腸直腸癌更有效的篩選和預(yù)防措施。
目前，關(guān)于結(jié)腸直腸癌現(xiàn)有的最早檢測(cè)程序包括便血檢驗(yàn)或內(nèi)窺鏡檢查程序。然而，在檢測(cè)便血之前一般必須存在顯著的腫瘤大小。以愈創(chuàng)木脂為基礎(chǔ)的大便潛血試驗(yàn)的靈敏性約為26％，意味著74％具有惡性病變的患者將仍然未檢測(cè)到(Ahlquist，D.A.，Gastroenterol.Clin.North Am.26(1997)41-55)。癌變前和癌性病變的顯像代表早期檢測(cè)的最佳方法，但是結(jié)腸鏡檢查是昂貴、具有風(fēng)險(xiǎn)和并發(fā)癥的侵入性方法(Silvis，S.E.等人，JAMA 235(1976)928-930；Geenen，J.E.，等人，Am.J.Dig.Dis.20(1975)231-235；Anderson，W.F.等人，J.Natl.Cancer Institute 94(2002)1126-1133)。
近年來，巨大量的所謂結(jié)腸特異的或甚至所謂結(jié)腸直腸癌特異的基因得到報(bào)導(dǎo)。相應(yīng)研究論文或?qū)＠暾?qǐng)中的絕大多數(shù)，建立在通過RNA表達(dá)模式分析獲得的數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，所述分析為結(jié)腸(癌)組織分別相對(duì)于不同組織或鄰近的正常組織的RNA表達(dá)模式的分析。這些方法可以概括為示差mRNA展示技術(shù)。
作為可從mRNA展示技術(shù)得到的數(shù)據(jù)的實(shí)例，可以提及并討論WO01/96390。該申請(qǐng)對(duì)超過兩百個(gè)分離的多核苷酸和相應(yīng)的等量多肽、及其在CRC檢測(cè)中的用途進(jìn)行了說明并請(qǐng)求保護(hù)。然而，不能由相應(yīng)蛋白水平來反映mRNA水平的差異，這是常識(shí)。由稀有mRNA編碼的蛋白可能具有非常高的量，但是由豐富mRNA編碼的蛋白可能根本難以檢測(cè)和發(fā)現(xiàn)。mRNA水平和蛋白水平之間相關(guān)性的缺乏歸結(jié)于諸如mRNA穩(wěn)定性、翻譯效率、蛋白穩(wěn)定性等原因。
也有最近研究不同組織之間或健康和疾病組織之間的蛋白模式差異的方法，以鑒定可能用于CRC診斷的候選標(biāo)志分子。Brünagel，G.等人，Cancer Research 62(2002)2437-2442鑒定了7個(gè)核基質(zhì)蛋白，與鄰近的正常組織比較，它們?cè)贑RC組織中看來更為豐富。尚無從個(gè)體的液體樣品得到的數(shù)據(jù)報(bào)導(dǎo)。
WO02/078636報(bào)告了約9個(gè)經(jīng)表面增強(qiáng)激光解吸和電離(SELDI)發(fā)現(xiàn)的結(jié)腸直腸癌相關(guān)點(diǎn)。與從健康對(duì)照獲得的血清相比，在從CRC患者獲得的血清中更頻繁地見到這些點(diǎn)。然而，這些點(diǎn)中包括的分子的特性(例如其序列)還未知。
盡管CRC領(lǐng)域中候選蛋白標(biāo)志的名單巨大且不斷增長(zhǎng)，但到此為止，這些分子的臨床/診斷效用尚且未知。為了具有臨床效用，作為單獨(dú)標(biāo)志的新的診斷標(biāo)志應(yīng)當(dāng)至少與本領(lǐng)域已知的最佳單獨(dú)標(biāo)志一樣好?；蛘?，如果單獨(dú)或分別與一個(gè)或多個(gè)其他標(biāo)志聯(lián)合使用，一個(gè)新的診斷標(biāo)志應(yīng)當(dāng)引起診斷靈敏性和/或特異性的提高。通過檢驗(yàn)的承受操作特性(receiver-operating characterisitics)對(duì)其診斷靈敏性和/或特異性進(jìn)行最佳評(píng)價(jià)，所述承受操作特性將在下面詳細(xì)介紹。
目前，僅可利用建立在檢測(cè)腫瘤相關(guān)糖蛋白癌胚抗原(CEA)基礎(chǔ)上的診斷性血液檢驗(yàn)來輔助CRC領(lǐng)域的診斷。從結(jié)腸直腸癌、胃癌、胰腺癌和大部分乳腺癌、肺癌以及頭部和頸部癌癥患者得到的組織樣品中，95％的樣品中CEA升高(Goldenberg，D.M.等人，J.Natl.Cancer Inst.(Bethesda)57(1976)11-22)。在非惡性疾病患者中也有過CEA水平升高的報(bào)導(dǎo)，而且許多結(jié)腸直腸癌患者具有正常的血清CEA水平，特別是在疾病的早期階段(Carriquiry，L.A.，和Pineyro，A.，Dis.Colon Rectum 42(1999)921-929；Herrera，M.A.等人，Ann.Surg.183(1976)5-9；Wanebo，H.J.，等人，N.Engl.J.Med.299(1978)448-451)。從血清或血漿測(cè)量CEA在檢測(cè)復(fù)發(fā)中的效用據(jù)報(bào)導(dǎo)是有爭(zhēng)議的，也未得到廣泛應(yīng)用(Martell，R.E.，等人，Int.J.Biol.Markers 13(1998)145-149；Moertel，C.G.等人，JAMA 270(1993)943-947)。
根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，血清CEA測(cè)定既不具有靈敏性也不具有特異性來使其用于無癥狀人群中結(jié)腸直腸癌的篩選檢驗(yàn)(Reynoso，G.等人，JAMA 220(1972)361-365；Sturgeon，C.，Clinical Chemistry 48(2002)1151-1159)。
全血、血清或血漿是臨床常規(guī)中最廣泛使用的樣品來源。對(duì)允許可靠的癌癥檢測(cè)或提供早期預(yù)后信息的早期CRC腫瘤標(biāo)志的鑒定，可以產(chǎn)生將大大幫助該疾病診斷和治療的診斷性測(cè)定。因此，存在急迫的臨床需求來改進(jìn)CRC由血液的診斷。由于早期診斷的患者的存活機(jī)會(huì)大大高于在疾病進(jìn)展后期得到診斷的患者，所以改進(jìn)CRC的早期診斷尤其重要。
本發(fā)明的任務(wù)是研究是否可以鑒定能夠幫助CRC診斷的新的標(biāo)志。
令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)蛋白MASP的使用至少可以部分地克服從本領(lǐng)域技術(shù)水平已知的問題。
本發(fā)明因此涉及結(jié)腸直腸癌的診斷方法，該方法包括步驟a)提供從個(gè)體獲得的液體樣品，b)在適于MASP特異性結(jié)合試劑與MASP之間形成復(fù)合物的條件下，將所述樣品與所述結(jié)合試劑接觸，以及c)將(b)中形成的復(fù)合物的量與結(jié)腸直腸癌的診斷關(guān)聯(lián)。優(yōu)選的方法使用從個(gè)體獲得的液體樣品。。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是診斷結(jié)腸直腸癌的方法，該方法包括步驟a)在適于MASP特異性結(jié)合試劑與MASP之間形成復(fù)合物的條件下，將從個(gè)體獲得的液體樣品與所述結(jié)合試劑接觸，以及b)將(a)中形成的復(fù)合物的量與結(jié)腸直腸癌的診斷關(guān)聯(lián)。
技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，任何這樣的診斷都是在體外進(jìn)行的。其后將患者的樣品丟棄?；颊叩臉悠穬H僅用于本發(fā)明的體外診斷方法，且不將患者樣品材料轉(zhuǎn)移回患者體內(nèi)。一般地，所述樣品是液體樣品。
蛋白MASP(乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑前體；Swiss-PROTP36952)以SEQ ID NO1給出的序列為特征?？寺〉娜巳橄俳z氨酸蛋白酶抑制劑cDNA編碼42-kDa的蛋白，其與絲氨酸蛋白酶抑制劑的蛋白酶抑制劑超家族共有同源性。免疫染色研究證實(shí)乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞外基中和質(zhì)膜上(Zou，Z.等人，Science 263(1994)526-529)。
人MASP基因(PI5的SERPINB5)最初在其mRNA水平表達(dá)的基礎(chǔ)上通過扣除雜交分離自正常哺乳動(dòng)物上皮(Zou等人，同上)。乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑在正常哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞中表達(dá)，但不在大多數(shù)哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞系中表達(dá)。Zou等人(同上)顯示其表達(dá)降低了轉(zhuǎn)化的細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的能力，提示所述乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑基因編碼腫瘤抑制劑。
Bass，R.等人(J.Biol.Chem.277(2002)46845-46848)表征了真核的乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑，并發(fā)現(xiàn)它對(duì)任何測(cè)試的蛋白水解系統(tǒng)都沒有蛋白酶抑制作用。但是，它的確抑制腫瘤和血管平滑肌細(xì)胞的遷移。
Song，S.Y.等人(Digestive Diseases and Sciences 47(2002)1831-1835)通過對(duì)來自腺瘤、腺癌和轉(zhuǎn)移性腺癌的組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，研究了乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑在結(jié)腸癌中的表達(dá)。由Song等人(同上)發(fā)現(xiàn)的乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑的免疫反應(yīng)性是細(xì)胞質(zhì)的，同時(shí)在核中有一些染色。超過90％的腺瘤、75％的腺癌和47％的轉(zhuǎn)移性癌組織切片對(duì)乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑染色呈陽性。該研究具有沒有使用定量測(cè)定系統(tǒng)例如蛋白印跡分析的局限性。沒有估計(jì)與鄰近的正常結(jié)腸組織相比的表達(dá)水平。
對(duì)技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明不應(yīng)該解釋為局限于SEQ IDNO1的全長(zhǎng)蛋白MASP。MASP的生理或人工片段、MASP的二級(jí)修飾以及MASP的等位基因變體也包括在本發(fā)明中。人工片段優(yōu)選包括合成或由重組技術(shù)產(chǎn)生的肽，該肽至少包括一個(gè)診斷性目的的表位，該表位由至少6個(gè)鄰接的氨基酸組成，這6個(gè)氨基酸衍生自SEQID NO1公開的序列。這樣的片段可以有利地用于抗體的產(chǎn)生，或者作為免疫測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)物。人工片段更優(yōu)選包括至少兩個(gè)適于建立夾心免疫測(cè)定的目的表位。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，新標(biāo)志MASP可以用于監(jiān)控和篩選目的。
用于患者監(jiān)控時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的診斷方法有助于在患者隨訪中評(píng)價(jià)腫瘤負(fù)荷、治療功效和腫瘤復(fù)發(fā)。MASP水平的升高與腫瘤負(fù)擔(dān)直接相關(guān)。短期(數(shù)小時(shí)至14天)化學(xué)治療后，MASP的增加可以作為腫瘤細(xì)胞死亡的指示物。在患者的隨訪中(3個(gè)月至10年)，MASP的升高可以用作腫瘤復(fù)發(fā)的指示物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的診斷方法用于篩選目的。即，該方法通過測(cè)量MASP水平、并將測(cè)量的水平與是否存在CRC關(guān)聯(lián)，用于評(píng)價(jià)沒有先前CRC診斷的受試者。
結(jié)腸直腸癌最常由腺瘤(息肉)進(jìn)展為惡性癌癥。通常根據(jù)Dukes′氏病期A至D來分類CRC的不同病期。
癌癥的分期是疾病關(guān)于程度、進(jìn)展和嚴(yán)重性的分類。它將癌癥患者分組從而可以對(duì)預(yù)后和選擇治療作出概括。
TNM系統(tǒng)是當(dāng)前最廣泛使用的癌癥解剖學(xué)程度的分類。該系統(tǒng)代表國際接受的統(tǒng)一分期系統(tǒng)。它有三個(gè)基本變量T(原發(fā)腫瘤的程度)，N(局部淋巴結(jié)狀態(tài))以及M(是否出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)。TNM標(biāo)準(zhǔn)由UICC(International Union Against Cancer)出版(Sobin，L.H.，Wittekind，Ch.(編)，TNM Classification of MalignantTumours，第五版，1997)。
特別重要的是，CRC的早期診斷能轉(zhuǎn)化為好很多的預(yù)后。結(jié)腸直腸的惡性腫瘤起于良性腫瘤，即腺瘤。因此，在腺瘤病期診斷的患者具有最好的預(yù)后。在已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)診斷的患者僅有10％的五年生存率，與此相比，如果處理得當(dāng)，在早至Tis、N0、M0或T1-3；N0；M0病期診斷的患者，在診斷后具有90％以上的五年生存機(jī)會(huì)。
從本發(fā)明的理解，CRC的早期診斷指在癌前狀態(tài)(腺瘤)或在完全沒有轉(zhuǎn)移(既非鄰近的也非遠(yuǎn)處的)的腫瘤病期，即腺瘤、Tis、N0、M0或T1-4；N0；M0存在的病期進(jìn)行的診斷。Tis表示原位癌。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用MASP在早至腺瘤病期診斷CRC。
更優(yōu)選在CRC尚未完全生長(zhǎng)穿過腸壁時(shí)進(jìn)行診斷，這樣既沒有臟體腔膜穿孔也沒有其他器官或結(jié)構(gòu)受侵，即，在Tis；N0；M0至T3；N0；M0(＝Tis-3；N0；M0)的任一個(gè)病期中作出診斷。
根據(jù)本發(fā)明的診斷方法建立在得自個(gè)體的液體樣品的基礎(chǔ)上。與本領(lǐng)域已知的方法不同，使用特異性結(jié)合試劑從該液體樣品特異性地測(cè)量MASP。
特異性結(jié)合試劑為，例如，MASP受體、結(jié)合MASP的凝集素或MASP抗體。特異性結(jié)合試劑對(duì)其相應(yīng)的靶分子具有至少107l/mol的親和力。特異性結(jié)合試劑優(yōu)選對(duì)其靶分子具有108l/mol的親和力，或甚至更優(yōu)選109l/mol的親和力。技術(shù)人員將理解，使用術(shù)語“特異性的”表示樣品中存在的其他生物分子不與MASP的特異性結(jié)合試劑發(fā)生顯著的結(jié)合。優(yōu)選地，與靶分子之外的生物分子結(jié)合的水平導(dǎo)致與靶分子親和力的僅僅10％，更優(yōu)選僅僅5％或更低。最優(yōu)選的特異性結(jié)合試劑將同時(shí)滿足上述親和力和特異性的最小標(biāo)準(zhǔn)。
特異性結(jié)合試劑優(yōu)選是與MASP反應(yīng)的抗體。術(shù)語抗體指多克隆抗體、單克隆抗體、這類抗體的片段、以及包括抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的遺傳構(gòu)建體。
術(shù)語抗體指多克隆抗體、單克隆抗體、這類抗體的片段、以及包括抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的遺傳構(gòu)建體。可以使用任何保留了特異性結(jié)合試劑的上述標(biāo)準(zhǔn)的抗體。使用現(xiàn)有技術(shù)方法產(chǎn)生抗體，例如Tijssen(Tijssen，P.，Practice and theory of enzyme immunoassays 11(1990)全書，尤其43-78頁；Elsevier，Amsterdam)中所說明的。另外，熟練的技術(shù)人員充分認(rèn)識(shí)到以免疫吸附劑為基礎(chǔ)的方法可以用于抗體的特異性分離。使用這些方法，可以加強(qiáng)多克隆抗體的質(zhì)量以及其在免疫測(cè)定中的性能(Tijssen，P.，見上，108-115頁)。
為達(dá)到在本發(fā)明中公開的成績(jī)，使用在兔中產(chǎn)生的多克隆抗體。然而，顯然也可以使用來自不同物種，例如大鼠或豚鼠的多克隆抗體，以及單克隆抗體。由于具有恒定特征的單克隆抗體能夠以任何需要量產(chǎn)生，所以它們代表了臨床常規(guī)測(cè)定開發(fā)中的理想工具。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，MASP的單克隆抗體的產(chǎn)生和使用是另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)人員現(xiàn)在將理解，MASP已鑒定為用于CRC診斷的標(biāo)志，可以使用可選的途徑達(dá)到能夠與本發(fā)明成績(jī)相比的結(jié)果。例如，可以使用可選的策略產(chǎn)生抗體。這些策略其中包括使用合成肽，該肽為免疫呈遞MASP表位。作為選擇，可以使用DNA免疫，也稱為DNA疫苗。
為了測(cè)量，在適于形成結(jié)合試劑MASP-復(fù)合物的條件下，將從個(gè)體獲得的液體樣品與MASP特異性結(jié)合試劑溫育。由于不具有任何創(chuàng)造性努力的技術(shù)人員可以輕易地確定這類適宜的溫育條件，所以這樣的條件無需說明。
根據(jù)本發(fā)明公開的方法，作為最后步驟，測(cè)量復(fù)合物的量，并將其與CRC的診斷關(guān)聯(lián)。技術(shù)人員將理解，測(cè)量特異性結(jié)合試劑MASP-復(fù)合物量的大量方法都在有關(guān)教科書中得到詳細(xì)說明(參閱，例如Tijssen P.，見上，或Diamandis等人編(1996)Immunoassay，AcademicPress，Boston)。
優(yōu)選以夾心型測(cè)定形式檢測(cè)MASP。在這類測(cè)定中，使用第一個(gè)特異性結(jié)合試劑將MASP捕獲于一側(cè)，在另一側(cè)使用第二個(gè)特異性結(jié)合試劑，該試劑經(jīng)過標(biāo)記，可以直接或間接檢測(cè)。
如上所述，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)可以在從個(gè)體樣品獲得的液體樣品中測(cè)量MASP。在CRC診斷中，不需要組織和活組織檢查樣品來應(yīng)用標(biāo)志MASP。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以血清為液體樣品材料，實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以血漿為液體樣品材料，實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以全血為液體樣品材料，實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法。
另外，也可以使用技術(shù)人員已知的多種方法處理糞便產(chǎn)生液體樣品。這些由糞便產(chǎn)生的液體樣品也代表了根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
盡管常規(guī)蛋白組學(xué)(proteomics)方法在組織樣品的應(yīng)用導(dǎo)致許多所選組織的潛在標(biāo)志候選物的鑒定，但本發(fā)明的發(fā)明者可以令人驚訝地在體液樣品中檢測(cè)到蛋白MASP。更驚訝的是，他們能夠證實(shí)，從個(gè)體獲得的液體樣品中MASP的存在可以與結(jié)腸直腸癌診斷關(guān)聯(lián)。
具有巨大優(yōu)點(diǎn)的MASP抗體可以用于已經(jīng)確定的程序中，例如，在原位、活組織檢查或免疫組織程序中檢測(cè)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞。
MASP抗體優(yōu)選用于定性(有無MASP存在)或定量(確定MASP量)免疫測(cè)定中。
已證明測(cè)量蛋白MASP水平在CRC領(lǐng)域中非常有利。因此，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在獲得自個(gè)體的液體樣品的結(jié)腸直腸癌診斷中，使用蛋白MASP作為標(biāo)志分子。
術(shù)語標(biāo)志分子用于指示，從個(gè)體體液測(cè)量的提高的分析物MASP水平標(biāo)志著CRC的存在。
特別優(yōu)選在結(jié)腸直腸癌的早期診斷中使用新標(biāo)志MASP。
蛋白MASP的使用本身代表了充滿挑戰(zhàn)的CRC診斷領(lǐng)域的重大進(jìn)展。將MASP與其他已知的標(biāo)志例如CEA、或其他有待發(fā)現(xiàn)的CRC標(biāo)志的測(cè)量聯(lián)合，引起了更深遠(yuǎn)的進(jìn)步。因此，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及從獲得自個(gè)體的液體樣品的結(jié)腸直腸癌診斷中，與一種或多種結(jié)腸直腸癌標(biāo)志分子聯(lián)合來使用MASP作為結(jié)腸直腸癌標(biāo)志分子。在這一點(diǎn)上，表述“一種或多種”指1-10，優(yōu)選1-5，更優(yōu)選3?？梢耘cMASP的測(cè)量聯(lián)合的其他優(yōu)選CRC標(biāo)志為CEA、CA 19-9、CA 72-4和/或CA 242。因而，本發(fā)明非常優(yōu)選的實(shí)施方案是從獲得自個(gè)體的液體樣品的結(jié)腸直腸癌診斷中，與一種或多種結(jié)腸直腸癌標(biāo)志分子聯(lián)合來使用蛋白MASP作為結(jié)腸直腸癌標(biāo)志分子，其中至少一種其他標(biāo)志分子選自CEA、CA 19-9、CA 72-4和CA 242。
在諸如免疫測(cè)定的特異性結(jié)合測(cè)定領(lǐng)域中，診斷試劑通常最好以試劑盒形式提供，試劑盒包括特異性結(jié)合試劑和實(shí)施該測(cè)定需要的輔助試劑。本發(fā)明因此也涉及免疫學(xué)試劑盒，其包括至少一種MASP特異性結(jié)合試劑以及MASP測(cè)量的輔助試劑。
測(cè)試的精確性最好由其承受操作特性(ROC)說明(特別見Zweig，M.H.和Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC曲線圖是在整個(gè)觀察數(shù)據(jù)范圍內(nèi)連續(xù)變化決定閾值(decisionthresh-hold)產(chǎn)生的所有靈敏性/特異性對(duì)的圖。
實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的臨床性能依賴于其診斷精確性、或?qū)⑹茉囌哒_分類為臨床相關(guān)亞群的能力。診斷精確性衡量了檢驗(yàn)將研究的受試者的兩種不同狀況正確區(qū)分的能力。這類狀況為例如健康和疾病或良性對(duì)惡性疾病。
在每個(gè)病例中，ROC圖通過在決定閾值的全部范圍將靈敏性對(duì)1-特異性作圖，描述了兩種分布之間的重疊。在y軸上是靈敏性或真陽性分?jǐn)?shù)[定義為(真陽性試驗(yàn)結(jié)果數(shù))/(真陽性數(shù)+假陰性試驗(yàn)結(jié)果數(shù))]。它也指疾病或狀況存在的確定性。它從受影響的亞群?jiǎn)为?dú)計(jì)算。在x軸上是假陽性分?jǐn)?shù)或1-特異性[定義為(假陽性結(jié)果數(shù))/(真陰性數(shù)+假陽性結(jié)果數(shù))]。它是特異性的指標(biāo)，并完全從未受影響的亞群計(jì)算。因?yàn)槭褂脙蓚€(gè)不同亞群的檢驗(yàn)結(jié)果，完全獨(dú)立地計(jì)算真和假陽性分?jǐn)?shù)，所以ROC圖不依賴于樣品中疾病的流行率。ROC上的每點(diǎn)代表對(duì)應(yīng)于特定決定閾值的靈敏性/特異性對(duì)。具有最佳辨別力的檢驗(yàn)(在結(jié)果的兩個(gè)分布中沒有重疊)具有經(jīng)過左上角的ROC圖，在左上角，真陽性分?jǐn)?shù)為1.0，或者100％(理想的靈敏性)，且假陽性分?jǐn)?shù)為0(理想的特異性)。沒有辨別力的檢驗(yàn)的理論圖(兩組結(jié)果的同樣分布)為從左下角至右上角的45°對(duì)角線。大多圖介于這兩個(gè)極端之間。(如果ROC圖完全落在45°對(duì)角線之下，則容易通過將“確定性”標(biāo)準(zhǔn)從“高于”反轉(zhuǎn)為“低于”來矯正這種情況，反之亦然。)從定性上，圖越接近左上角，檢驗(yàn)的總精確度就越高。
定量實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)診斷精確度的一個(gè)方便的目標(biāo)是通過單獨(dú)的數(shù)字表達(dá)其性能。最普通的全面測(cè)量是ROC圖下的面積。按照慣例，該面積總是≥0.5(如果不是，可以反轉(zhuǎn)決定規(guī)則使其≥0.5)。值在1.0(兩組檢驗(yàn)值的理想分離)和0.5(在兩組檢驗(yàn)值之間沒有明顯的分布差異)之間變化。該面積不僅依賴于該圖的特定部分，例如最接近對(duì)角線的點(diǎn)或在90％特異性的靈敏性，也依賴于全圖。這是對(duì)ROC圖有多么接近理想ROC圖(面積＝1.0)的定量的說明性表達(dá)。
使用承受操作曲線分析(ROC；Zweig，M.H.，以及Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)，與確定的標(biāo)志CEA比較并與其聯(lián)合，評(píng)價(jià)新標(biāo)志MASP的臨床效用。該分析以由50個(gè)樣品組成的明確患者群組為基礎(chǔ)，其中各個(gè)樣品分別來自T1-3；N0；M0、進(jìn)展更晚期的腫瘤即T4和/或不同嚴(yán)重性的轉(zhuǎn)移(N+和/或M+)的患者，以及健康對(duì)照。
經(jīng)曲線下面積證明，建立在單獨(dú)測(cè)量MASP基礎(chǔ)上的診斷方法具有的診斷精確度(靈敏性/特異性特征)，至少與確定的單獨(dú)標(biāo)志CEA相比一樣好。
提供下列實(shí)施例、參考文獻(xiàn)、序列表和附圖以幫助對(duì)本發(fā)明的理解，其真實(shí)范圍于附加的權(quán)利要求中提出。應(yīng)當(dāng)理解，可以在不偏離本發(fā)明精神的情況下，在提出的方法中進(jìn)行修飾。


圖1圖1顯示以腫瘤樣品上樣的2D-凝膠(左側(cè))、以匹配的獲得自鄰近的健康粘膜層的對(duì)照樣品上樣的凝膠(右側(cè))的典型實(shí)例。MASP的表觀分子量和等電點(diǎn)分別相應(yīng)為理論值約46kDA和5.98。這些凝膠放大部分的圓形指示蛋白MASP的位置。在健康粘膜層中，以同樣的方法不能檢測(cè)到該蛋白。
圖2圖2顯示蛋白印跡的典型實(shí)例。凝膠以來自結(jié)腸直腸腫瘤組織和鄰近的健康對(duì)照組織的組織裂解物上樣，所述組織來自4個(gè)患者(受試者36直腸癌，Dukes B；受試者37直腸癌，Dukes A；受試者39結(jié)腸癌，Dukes A；以及受試者40結(jié)腸癌，Dukes B)。使用多克隆兔抗-MASP血清檢測(cè)樣品中MASP的存在。以“T”指示含有腫瘤裂解物的泳道，以“N”指示含有正常對(duì)照組織的泳道。以“Ma”指示含有分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物的標(biāo)志泳道。以“300”、“1000”和“3000”指示含有不同濃度所重組MASP的泳道。箭標(biāo)指示MASP條帶在凝膠中的位置。所有腫瘤樣品在MASP位置給以強(qiáng)信號(hào)，而來自鄰近的正常對(duì)照組織的裂解物中只能檢測(cè)到弱信號(hào)。在13個(gè)檢驗(yàn)的受試者中，13個(gè)顯示結(jié)腸直腸癌患者腫瘤組織中MASP的強(qiáng)烈超表達(dá)。
縮寫ABTS 2，2’-疊氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽BSA牛血清清蛋白cDNA 互補(bǔ)DNACHAPS (3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸鹽)DMSO 二甲亞砜DTT二硫蘇糖醇EDTA 乙二胺四乙酸ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定HRP辣根過氧化物酶IAA碘乙酰胺IgG免疫球蛋白G
IEF等電聚焦IPG固定pH梯度LDS十二烷基硫酸鋰MALDI-TOF 基質(zhì)輔助的激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜MES基，2，4，6-三甲苯基OD 光密度PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳PBS磷酸緩沖鹽水PI 等電點(diǎn)RTS快速翻譯體系SDS十二烷基硫酸鈉實(shí)施例1MASP作為可能的結(jié)腸直腸癌標(biāo)志的鑒定組織來源為了鑒定作為可能的結(jié)腸直腸癌診斷標(biāo)志的腫瘤特異性蛋白，使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行三種不同種類組織的分析。
總共分析來自10個(gè)患有結(jié)腸直腸癌的患者的組織樣品。以治療性切除術(shù)從各個(gè)患者收集三種不同的組織類型腫瘤組織(＞80％腫瘤)(T)、鄰近的健康組織(N)和由鄰近的健康粘膜層剝除的粘膜層(M)。后兩種組織類型作為匹配的健康對(duì)照樣品。組織在切除后立即冰凍，并在處理前保存于-80℃。腫瘤經(jīng)組織病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)診斷。
組織制備將0.8-1.2g冰凍組織置于研缽并以液氮完全冰凍。將組織在研缽中粉碎，于10倍體積(w/v)的裂解緩沖液(40mM檸檬酸鈉，5mMMgCl2，1％Genapol X-080，0.02％疊氮化鈉，CompleteEDTA-free[Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國，Cat.No.1 873580])中溶解，隨后在Wheaton玻璃勻漿器中勻漿(20x松配合，20x緊配合)。將3ml勻漿物以4500×g進(jìn)行蔗糖密度離心(10-60％蔗糖)1小時(shí)。離心步驟后獲得三個(gè)級(jí)分。梯度頂端的級(jí)分含有可溶性蛋白，用于進(jìn)一步分析。
等電聚焦(IEF)及SDS-PAGE
對(duì)于IEF，將3ml懸液與12ml樣品緩沖液(7M尿素，2M硫脲，2％CHAPS，0.4％IPG緩沖液pH4-7，0.5％DTT)混合，溫育1小時(shí)。在AmiconUltra-15裝置(Millipore GmbH，Schwalbach，德國)中濃縮樣品，使用Bio-Rad蛋白測(cè)定(Cat.No.500-0006；Bio-Rad Laboratories GmbH，München，德國)按照廠商手冊(cè)說明測(cè)定蛋白濃度。對(duì)于相當(dāng)于1.5mg的蛋白的體積，添加樣品緩沖液至350μl終體積。使用該溶液將IPG條pH4-7(AmershamBiosciences，F(xiàn)reiburg，德國)再水化過夜。使用下列梯度方案進(jìn)行IEF1.)1分鐘至500V；2.)2小時(shí)至3500V；3.)22小時(shí)恒定于3500V，使發(fā)生82kVh。IEF后，將條保存于-80℃，或直接用于SDS-PAGE。
SDS-PAGE之前，條在平衡緩沖液(6M尿素，50mM Tris/HCl，pH8.8，30％甘油，2％SDS)中溫育，添加DDT(15分鐘，+50mgDTT/10ml)以還原，添加IAA(15分鐘，+235mg碘乙酰胺/10ml)以烷基化。將條置于12.5％聚丙烯酰胺凝膠上，以1W/凝膠電泳1小時(shí)，其后以17W/凝膠進(jìn)行電泳。隨后，將凝膠固定(50％甲醇，10％醋酸鹽)并以NovexTMColloidal Blue Staining Kit(Invitrogen，Karlsruhe，德國，Cat No.LC6025，45-7101)染色過夜。
MASP作為可能的結(jié)腸直腸癌標(biāo)志的檢測(cè)使用ProteomeWeaver軟件(Definiens AG，德國，München)通過影像分析分別分析各個(gè)患者。另外，使用采集自動(dòng)機(jī)械切割凝膠上所有的點(diǎn)，使用MALDI-TOF質(zhì)譜(UltraflexTMTof/Tof，BrukerDaltonik GmbH，Bremen，德國)鑒定點(diǎn)中存在的蛋白。對(duì)于每個(gè)患者，將腫瘤樣品的4塊凝膠與鄰近的正常和剝除的粘膜層組織的4塊凝膠比較，分析相應(yīng)于差異表達(dá)蛋白的不同點(diǎn)。使用這種方法，發(fā)現(xiàn)蛋白MASP在腫瘤組織中特異地表達(dá)或強(qiáng)烈超表達(dá)，在健康對(duì)照組織中不可檢測(cè)或強(qiáng)度較低地表達(dá)。因此，在其他許多蛋白中，MASP取得用于結(jié)腸直腸癌診斷的候選標(biāo)志的資格。
實(shí)施例2結(jié)腸直腸癌標(biāo)志蛋白MASP抗體的產(chǎn)生產(chǎn)生結(jié)腸直腸癌標(biāo)志蛋白MASP的多克隆抗體用于抗體在進(jìn)一步測(cè)量MASP的血清和血漿和全血水平中的用途，測(cè)量使用免疫檢測(cè)測(cè)定，例如蛋白印跡和ELISA。
大腸桿菌(E.coli)中的重組蛋白表達(dá)為了產(chǎn)生MASP抗體，進(jìn)行該蛋白的重組表達(dá)以獲得免疫原。結(jié)合使用RTS 100表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)。第一步，分析DNA序列，并使用“ProteoExpert RTS E.coli HY”系統(tǒng)獲得高產(chǎn)量cDNA沉默突變變體推薦和各自的PCR引物序列。該系統(tǒng)是以網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)的商業(yè)服務(wù)(www.proteoexpert.com)。使用推薦的引物對(duì)，利用“RTS 100E.coli Linear Template Generation Set，His-tag”(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，德國，Cat.No.3186237)系統(tǒng)，從cDNA產(chǎn)生線性PCR模板，并用于編碼MASP蛋白的核苷酸序列的體外轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。對(duì)于蛋白印跡檢測(cè)和隨后的純化，表達(dá)的蛋白含有His-標(biāo)志。鑒定最佳的表達(dá)變體。根據(jù)廠商說明執(zhí)行從PCR到表達(dá)和檢測(cè)的所有步驟。根據(jù)廠商說明，將各自的PCR產(chǎn)物克隆到pBADTOPO載體(Invitrogen，Karlsruhe，德國，Cat.No.K 4300/01)中，PCR產(chǎn)物含有所有必需的T7調(diào)節(jié)區(qū)域(啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和T7終止子)。對(duì)于使用T7調(diào)節(jié)序列的表達(dá)，將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL 21(DE 3)中(Studier，F(xiàn).W.等人，Methods Enzymol.185(1990)60-89)，分批培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌以表達(dá)蛋白，每批1L。
按照標(biāo)準(zhǔn)程序在Ni螯合柱上進(jìn)行His-MASP融合蛋白的純化。簡(jiǎn)要地說，通過離心將1L含有His-MASP融合蛋白表達(dá)載體的細(xì)菌培養(yǎng)物沉淀。在裂解緩沖液中將細(xì)胞沉淀重懸，隨后使用Ultra-Turrax勻漿，所述裂解緩沖液中含有磷酸鹽，pH8.0，7M氯化胍，咪唑和硫甘油。通過高速離心使不溶材料沉淀，將上清液應(yīng)用于Ni螯合層析柱。使用數(shù)個(gè)柱床體積的裂解緩沖液洗滌柱子，隨后使用含有磷酸鹽，pH8.0和尿素的緩沖液洗滌。最后，在酸性條件下，使用含有SDS的磷酸鹽緩沖液洗脫結(jié)合的抗原。
抗MASP單克隆抗體的生產(chǎn)a)小鼠的免疫使用100μgMASP腹膜內(nèi)初次免疫12周齡A/J小鼠。初次免疫六周后繼之以另外兩次腹膜內(nèi)免疫，這兩次免疫間隔一個(gè)月。在此過程中，向每只小鼠施用吸附至氫氧化鋁的100μgMASP、以及109個(gè)百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)。隨后，在融合前第三和第二天，每只小鼠使用100μgMASP的PBS緩沖液溶液靜脈內(nèi)進(jìn)行最后兩次免疫。
b)融合與克隆將根據(jù)a)免疫的小鼠脾細(xì)胞與根據(jù)Galfre，G.和Milstein，C.，Methods in Enzymology 73(1981)3-46的骨髓瘤細(xì)胞融合。在此過程中，將約1×108個(gè)免疫小鼠脾細(xì)胞與2×107個(gè)骨髓瘤細(xì)胞(P3X63-Ag8-653，ATCC CRL1580)混合并離心(10分鐘，300g，4℃)。以不含胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培養(yǎng)基將細(xì)胞洗滌一次，在50ml錐形管中于400g再次離心。棄上清液，輕敲以溫和地松散細(xì)胞沉淀，經(jīng)吸液添加并混合1ml PEG(分子量4000，Merck，Darmstadt)。于37℃水浴1分鐘后，于室溫在4-5分鐘時(shí)間段內(nèi)滴加5ml不含F(xiàn)CS的RPMI 1640。然后在大約1分鐘內(nèi)滴加5ml含有10％FCS的RPMI 1640，充分混合，以培養(yǎng)基(RPMI 1640+10％FCS)填充至50ml，隨后于4℃以400×g離心10分鐘。將沉淀的細(xì)胞置于含10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，接種于次黃嘌呤-重氮絲氨酸選擇培養(yǎng)基(100mmol/l次黃嘌呤，1μg/ml重氮絲氨酸于RPMI 1640+10％FCS中)。白細(xì)胞介素6作為生長(zhǎng)因子以100U/ml添加于培養(yǎng)基中。
約10天后，將原代培養(yǎng)物對(duì)特異性抗體進(jìn)行檢驗(yàn)。使用熒光激活細(xì)胞分選儀將MASP陽性原代培養(yǎng)物克隆到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。在此過程中，白細(xì)胞介素6再次作為生長(zhǎng)添加劑以100U/ml添加于培養(yǎng)基中。
c)從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離免疫球蛋白獲得的雜交瘤細(xì)胞以每毫升含有10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種，并于發(fā)酵罐中增殖7天(ThermoduxCo.，Wertheim/Main，Model MCS-104XL，Order No.144-050)。在培養(yǎng)物上清液中獲得平均濃度為每毫升100μg的單克隆抗體。使用蛋白化學(xué)中的常規(guī)方法(例如根據(jù)Bruck，C.等人，Methods inEnzymology 121(1986)587-695)進(jìn)行該抗體從培養(yǎng)物上清液中的純化。
多克隆抗體的產(chǎn)生
a)免疫為了免疫，以1∶1比例制備蛋白溶液(100μg/ml蛋白MASP)和完全弗氏佐劑的新鮮乳劑。在1、7、14和30、60和90天以1ml乳劑免疫各兔。吸出血液，將產(chǎn)生的抗MASP血清用于實(shí)施例3和4中說明的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
b)使用辛酸和硫酸銨依次沉淀(sequential precipitation)從兔血清純化IgG(免疫球蛋白G)以4體積醋酸鹽緩沖液(60mM，pH4.0)稀釋1體積兔血清。以2M Tris堿調(diào)節(jié)pH至4.5。在劇烈攪動(dòng)下滴加辛酸(25μl/ml稀釋樣品)。30分鐘后，將樣品離心(13000×g，30分鐘，4℃)，棄沉淀，收集上清液。通過添加2M Tris堿將上清液pH調(diào)節(jié)至7.5并過濾(0.2μm)。
通過在劇烈攪動(dòng)下滴加4M硫酸銨至2M的終濃度，將上清液中的免疫球蛋白沉淀。通過離心收集沉淀的免疫球蛋白(8000×g，15分鐘，4℃)。
棄上清液。以10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl溶解沉淀并徹底透析。將透析液離心(13000×g，15分鐘，4℃)并過濾(0.2μm)。
多克隆兔IgG的生物素化在10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl中制備10mg/ml多克隆兔IgG。每毫升IgG溶液添加50μl生物素-N-羥基琥珀酰亞胺(3.6mg/ml于DMSO中)。于室溫30分鐘后，將樣品在Superdex 200(10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl)上層析。收集含有生物素化IgG的級(jí)分。根據(jù)相同程序?qū)慰寺】贵w生物素化。
多克隆兔IgG的洋地黃毒苷化(Digoxygenylation)在10mM NaH2PO4/NaOH，30mM NaCl，pH7.5中制備10mg/ml多克隆兔IgG。每毫升IgG溶液添加50μl洋地黃毒苷-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Roche Diagnostics，Mannheim，德國，Cat.No.1 333 054)(3.8mg/ml于DMSO中)。于室溫30分鐘后，將樣品在Superdex200(10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl)上層析。收集含有洋地黃毒苷化的IgG的級(jí)分。根據(jù)相同程序?qū)慰寺】贵w以洋地黃毒苷標(biāo)記。
實(shí)施例3利用實(shí)施例2中產(chǎn)生的多克隆抗體檢測(cè)人結(jié)腸直腸癌組織中MASP的蛋白印跡如實(shí)施例1中“組織制備”所說明的，制備腫瘤樣品和健康對(duì)照樣品的組織裂解物。
使用Invitrogen，Karlsruhe，德國的試劑和設(shè)備進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白印跡。對(duì)于每個(gè)檢驗(yàn)的組織樣品，在還原NuPAGE(Invitrogen)SDS樣品緩沖液中稀釋10μg組織裂解物，并于95℃加熱10分鐘。在MES運(yùn)行緩沖系統(tǒng)中的4-12％NuPAGE凝膠(Tris-Glycine)上運(yùn)行樣品。使用Invitrogen XCell IITMBlot Module(Invitrogen)和NuPAGE轉(zhuǎn)移緩沖系統(tǒng)將凝膠分離的蛋白混合物印跡于硝化纖維素膜上。于PBS/0.05％Tween-20中將膜洗滌3次，并以Roti-Block封閉緩沖液(A151.1；Carl Roth GmbH，Karlsruhe，德國)封閉2小時(shí)。將第一抗體多克隆兔抗MASP血清(根據(jù)實(shí)施例2中說明產(chǎn)生)以1∶10 000稀釋于Roti-Block封閉緩沖液中，并與膜溫育1小時(shí)。在PBS/0.05％Tween-20中將膜洗滌6次。使用POD綴合的多克隆綿羊抗兔IgG抗體標(biāo)記特異性結(jié)合的兔第一抗體，POD綴合的多克隆綿羊抗兔IgG抗體以0.5×Roti-Block封閉緩沖液稀釋至10mU/ml。溫育1小時(shí)后，在PBS/0.05％Tween-20中將膜洗滌6次。為了檢測(cè)結(jié)合的POD綴合的抗兔抗體，將膜與Lumi-LightPLUSWestern Blotting Substrate(Order-No.2015196，Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，德國)溫育，并暴光于放射自顯影膠片。
實(shí)施例4測(cè)量人血清和血漿樣品中MASP的ELISA為了檢測(cè)人血清或血漿中的MASP，開發(fā)了夾心法ELISA。為了捕獲和檢測(cè)抗原，分別使用生物素和洋地黃毒苷綴合等分試樣的抗MASP多克隆抗體(見實(shí)施例2)。
將鏈霉抗生素蛋白包被的96孔微孔滴定板與100μl生物素化的抗MASP多克隆抗體溫育60分鐘，生物素化的抗MASP多克隆抗體以10μg/ml溶于10mM磷酸鹽，pH7.4，1％BSA，0.9％NaCl和0.1％Tween-20中。溫育后，以0.9％NaCl，0.1％Tween 20將板洗滌3次。然后，將孔與作為標(biāo)準(zhǔn)抗原的重組蛋白(見實(shí)施例2)的連續(xù)稀釋液或稀釋的患者血漿樣品溫育2小時(shí)。MASP結(jié)合后，使用0.9％NaCl，0.1％Tween-20將板洗滌3次。為了結(jié)合的MASP的特異性檢測(cè)，將孔與100μl洋地黃毒苷化抗MASP多克隆抗體溫育60分鐘，洋地黃毒苷化抗MASP多克隆抗體以10μg/ml溶于10mM磷酸鹽，pH7.4，1％BSA，0.9％NaCl和0.1％Tween-20中。此后，將板洗滌3次以去除未結(jié)合的抗體。在下一步中，將孔與20mU/ml抗洋地黃毒苷-POD綴合物(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國，Catalog No.1633716)溫育60分鐘，抗洋地黃毒苷-POD綴合物溶于10mM磷酸鹽，pH7.4，1％BSA，0.9％NaCl和0.1％Tween-20中。隨后使用相同緩沖液將板洗滌3次。為了檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物，將孔與100μl ABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國，Catalog No.11685767)溫育，并于30-60分鐘后使用ELISA讀出器(ELISA reader)在405nm測(cè)量OD。
實(shí)施例5根據(jù)診斷精確度評(píng)價(jià)臨床效用的ROC分析通過分析從充分表征的患者群組獲得的個(gè)體液體樣品評(píng)價(jià)精確度，即，分別為50個(gè)經(jīng)歷結(jié)腸鏡檢查并發(fā)現(xiàn)沒有腺瘤或CRC的患者；50個(gè)診斷并分期為CRC Tis-3、N0、M0的患者；以及50個(gè)診斷為進(jìn)展后期CRC的患者，其具有腫瘤浸潤(rùn)于至少一個(gè)鄰近淋巴結(jié)、或更嚴(yán)重形式的轉(zhuǎn)移。使用商業(yè)供應(yīng)的測(cè)定(Roche Diagnostics，CEA-assay(Cat.No.1 173 1629用于ElecsysSystems免疫測(cè)定分析儀)測(cè)量的CEA，以及如上說明測(cè)量的MASP，在從這些個(gè)體的每一個(gè)中獲得的血清中得到定量。根據(jù)Zweig，M.H.，和Campbell，如上，進(jìn)行ROC分析。經(jīng)曲線下面積測(cè)量發(fā)現(xiàn)，對(duì)于MASP，將Tis-3、N0、M0組的患者與健康個(gè)體區(qū)分分辨力至少與確定的標(biāo)志CEA相比一樣好。
初步數(shù)據(jù)顯示，MASP也可能用于外科手術(shù)后患者的隨訪。
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序列表<110>Roche Diagnostics GmbHF.Hoffmann-La Roche AG<120>蛋白MASP作為結(jié)腸直腸癌標(biāo)志的用途<130>21767<150>EP 03011158.7<151>2003-05-26<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>375<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑前體；Swiss-PROTP36952<400>1Met Asp Ala Leu Gln Leu Ala Asn Ser Ala Phe Ala Val Asp Leu Phe1 5 10 15Lys Gln Leu Cys Glu Lys Glu Pro Leu Gly Asn Val Leu Phe Ser Pro20 25 30Ile Cys Leu Ser Thr Ser Leu Ser Leu Ala Gln Val Gly Ala Lys Gly35 40 45Asp Thr Ala Asn Glu Ile Gly Gln Val Leu His Phe Glu Asn Val Lys50 55 60
Asp Ile Pro Phe Gly Phe Gln Thr Val Thr Ser Asp ValAsn Lys Leu65 70 75 80Ser Ser Phe Tyr Ser Leu Lys Leu Ile Lys Arg Leu Tyr Val Asp Lys85 90 95Ser Leu Asn Leu Ser Thr Glu Phe Ile Ser Ser Thr Lys Arg Pro Tyr100 105 110Ala Lys Glu Leu Glu Thr Val Asp Phe Lys Asp Lys Leu Glu Glu Thr115 120 125Lys Gly Gln Ile Asn Asn Ser Ile Lys Asp Leu Thr Asp Gly His Phe130 135 140Glu Asn Ile Leu Ala Asp Asn Ser Val Asn Asp Gln Thr Lys Ile Leu145 150 155 160Val Val Asn Ala Ala Tyr Phe Val Gly Lys Trp Met Lys Lys Phe Pro165 170 175Glu Ser Glu Thr Lys Glu Cys Pro Phe Arg Leu Asn Lys Thr Asp Thr180 185 190Lys Pro Val Gln Met Met Asn Met Glu Ala Thr Phe Cys Met Gly Asn195 200 205Ile Asp Ser Ile Asn Cys Lys Ile Ile Glu Leu Pro Phe Gln Asn Lys210 215 220His Leu Ser Met Phe Ile Leu Leu Pro Lys Asp Val Glu Asp Glu Ser225 230 235 240
Thr Gly Leu Glu Lys Ile Glu Lys Gln Leu Asn Ser Glu Ser Leu Ser245 250 255Gln Trp Thr Asn Pro Ser Thr Met Ala Asn Ala Lys Val Lys Leu Ser260 265 270Ile Pro Lys Phe Lys Val Glu Lys Met Ile Asp Pro Lys Ala Cys Leu275 280 285Glu Asn Leu Gly Leu Lys His Ile Phe Ser Glu Asp Thr Ser Asp Phe290 295 300Ser Gly Met Ser Glu Thr Lys Gly Val Ala Leu Ser Asn Val Ile His305 310 315 320Lys Val Cys Leu Glu Ile Thr Glu Asp Gly Gly Asp Ser Ile Glu Val325 330 335Pro Gly Ala Arg Ile Leu Gln His Lys Asp Glu Leu Asn Ala Asp His340 345 350Pro Phe Ile Tyr Ile Ile Arg His Asn Lys Thr Arg Asn Ile Ile Phe355 360 365Phe Gly Lys Phe Cys Ser Pro370 37權(quán)利要求
1.診斷結(jié)腸直腸癌的方法，包括下列步驟a)提供從個(gè)體獲得的液體樣品，b.在適于乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑前體(MASP)特異性結(jié)合試劑與MASP之間形成復(fù)合物的條件下，將所述樣品與所述結(jié)合試劑接觸，以及c.將(b)中形成的復(fù)合物的量與結(jié)腸直腸癌的診斷關(guān)聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步的特征在于所述樣品為血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步的特征在于所述樣品為血漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步的特征在于所述樣品為全血。
5.蛋白MASP作為標(biāo)志分子在從個(gè)體獲得的液體樣品進(jìn)行結(jié)腸直腸癌的診斷中的用途。
6.蛋白MASP作為標(biāo)志分子在從個(gè)體獲得的液體樣品進(jìn)行結(jié)腸直腸癌的早期診斷中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述早期診斷使用得自腺瘤病期CRC患者的樣品進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述早期診斷使用得自Tis-3；N0；M0病期CRC患者的樣品進(jìn)行。
9.蛋白MASP作為結(jié)腸直腸癌的標(biāo)志分子，與另一個(gè)結(jié)腸直腸癌的標(biāo)志分子聯(lián)合在從個(gè)體獲得的液體樣品進(jìn)行結(jié)腸直腸癌診斷中的用途。
10.免疫學(xué)試劑盒，其包括至少一種MASP的特異性結(jié)合試劑和用于MASP測(cè)量的輔助試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)腸直腸癌的診斷。它公開了蛋白MASP在結(jié)腸直腸癌診斷中的用途。它涉及從來自個(gè)體的液體樣品診斷結(jié)腸直腸癌的方法，該方法通過測(cè)量所述樣品中的MASP進(jìn)行診斷。MASP的測(cè)量可以用于例如結(jié)腸直腸癌的早期檢測(cè)或診斷。
文檔編號(hào)G01N33/536GK1795385SQ200480014319
公開日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2004年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月26日
發(fā)明者P·伯恩德特, M·-L·哈格曼, H·朗根, S·帕爾姆, M·勒斯勒, W·羅林格爾, M·塔克, W·措爾格, J·卡爾 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司