心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白免疫層析定量檢測試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型屬于免疫檢測領(lǐng)域，具體涉及一種高靈敏度心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白免疫層析定量檢測試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酸結(jié)合蛋白(Fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP)是多種功能相同的小分子蛋白家族，主要存在于大量耗能的細(xì)胞胞質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)脂肪代謝中起轉(zhuǎn)運(yùn)游離脂肪酸的作用。最先于心肌中發(fā)現(xiàn)的FABP又稱為心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(heart-type fattyacid-binding protein，簡稱H-FABP)，是一種低分子量的心肌細(xì)胞楽非酶類蛋白，分子量為14500D，由132個氨基酸殘基組成，其分子結(jié)構(gòu)與免疫學(xué)特性不同于其他類型的FABP，具有心肌特異性。
[0003]目前臨床常用的診斷AMI的標(biāo)志物有CK-MB、Mb、心肌肌鈣蛋白(cardiactroponin, cTn)等，現(xiàn)有心肌標(biāo)志物在靈敏度和特異度方面往往不能兼顧。cTn1、cTnT是迄今發(fā)現(xiàn)的最特異的心肌標(biāo)志物，然而cTn升高相對較晚并持續(xù)較長時間，其在AMI早期診斷以及反映心肌再梗死中的價值仍然受限。以上心肌標(biāo)志物的缺點使AMI的早期診斷變得比較困難。隨著H-FABP的發(fā)現(xiàn)及其在AMI診斷領(lǐng)域的引入，這種情況可能會得到改善。作為一種新的AMI的標(biāo)志蛋白，近年來H-FABP日益受到重視和關(guān)注。
[0004]H-FABP能及早發(fā)現(xiàn)超急期AMI患者。對于鑒別出需急診住院、冠狀動脈造影、介入治療的患者有很高的敏感性，尤其那些胸痛發(fā)病6h內(nèi)的患者的早期診斷和預(yù)后判斷有很大幫助。H-FABP如與傳統(tǒng)的標(biāo)記物cTn1、CK-MB結(jié)合起來一起檢測，早期檢測H-FABP，恢復(fù)期檢測cTnl，有利于篩選出有心臟疾患高風(fēng)險的患者，不僅方便采取積極的治療策略，還可節(jié)約患者開支和實驗室資源，H-FABP與cTnl合理互補(bǔ)監(jiān)測也許是將來一種臨床診治缺血性心臟病的理想選擇。
[0005]目前檢測心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的常用方法有:
[0006]I膠乳凝集法
[0007]膠乳凝集法是臨床較常用的血清學(xué)方法，屬于間接的凝集試驗。膠乳試劑用純化的抗人H-FABP抗體致敏，能和病人血清中H-FABP發(fā)生特異性反應(yīng)，數(shù)分鐘內(nèi)呈現(xiàn)清晰的凝集顆粒，出現(xiàn)凝集者為陽性，未出現(xiàn)凝集者為陰性。此方法操作簡單、快速，敏感性、特異性較高。但易受補(bǔ)體、類風(fēng)濕因子(RF)等因素的干擾，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。因此，為了提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，檢測時應(yīng)對待測標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，以去除干擾因素。
[0008]2免疫透射比濁法
[0009]免疫透射比濁法是實驗室常用檢測方法。免疫透射比濁法也是一種微量的免疫沉淀測定法。其與速率散射比濁法不同的是以測定透過溶液的光量來反映待測抗原的含量。當(dāng)光線透過反應(yīng)體系時，溶液中的抗原抗體免疫復(fù)合物可對光線加以吸收和反射，使透射光減少。免疫復(fù)合物越多，吸收的光線越多，透射光越少，這種變化可用吸光度表示。若抗體量固定，所測吸光度與免疫復(fù)合物的量成正比，也與待測抗原的量成正比。以一系列已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品作對照，即可以測出受檢物含量。南京諾爾曼生物技術(shù)有限公司H-FABP測定試劑通過參考校準(zhǔn)品建立H-FABP含量的校準(zhǔn)曲線，可在全自動生化分析儀上快速的測定血清中H-FABP的含量。
[0010]3免疫標(biāo)記技術(shù)
[0011]免疫標(biāo)記技術(shù)用于H-FABP測定的免疫標(biāo)記方法有放射免疫法、酶免疫法、金標(biāo)免疫法、熒光標(biāo)記免疫法等。IRNA法靈敏度和特異性高，且不需要分離純化血漿，比RIA法快捷實用，但需要耗時5?36小時，不適合用于自動分析系統(tǒng)。國內(nèi)也有部分相關(guān)產(chǎn)品，瑞萊生物工程(深圳)有限公司的H-FABP檢測試劑利用雙向側(cè)流免疫法，通過測定試紙檢測線和質(zhì)控線上金標(biāo)抗體光密度的變化可實現(xiàn)在2ng/mL-60ng/mL的范圍內(nèi)定量檢測H-FABP濃度。
[0012]生物素-親和素系統(tǒng)(b1tinavidin system，BAS)，是一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。將該系統(tǒng)應(yīng)用于免疫組化，酶聯(lián)免疫，熒光免疫，放射免疫等檢測技術(shù)中，可顯著地提高以上技術(shù)方法的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，使方法更簡便，有助于臨床快速診斷，并利于進(jìn)行大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，成為研宄免疫反應(yīng)的有力工具。由于BAS檢測系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)快速，又無放射物質(zhì)污染，不需復(fù)雜儀器，充分顯示了此系統(tǒng)的巨大潛力和應(yīng)用的可能性。
[0013]生物素-親和素系統(tǒng)檢測原理:BAS是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物素與親和素間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統(tǒng)。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個亞單位組成，對生物素有非常高的親和力(結(jié)合常數(shù)高達(dá)1015M-1)。生物素很易與蛋白質(zhì)(如抗體等)以共價鍵結(jié)合。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時的催化作用而呈色，達(dá)到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。鏈霉親和素是與親和素有相似生物學(xué)特性的一種蛋白質(zhì)，鏈霉親和素與親和素一樣分子中每條肽鏈都能結(jié)合一個生物素，因幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親和素或鏈霉親合素結(jié)合。利用生物素-親和素系統(tǒng)研制心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測試快速診斷試劑尚無報道。
【實用新型內(nèi)容】
[0014]本實用新型的目的，在于提供一種心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白免疫層析定量檢測試紙條，其基于雙抗體夾心法、熒光免疫側(cè)向?qū)游龊蜕锼?鏈霉親和素放大系統(tǒng)，提供高靈敏度心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白免疫層析定量檢測試紙條。使用本實用新型時，提高了檢測靈敏度和檢測穩(wěn)定性，降低了非特異性結(jié)合，檢測時間不大于10分鐘，大大提高了診斷效率。
[0015]本實用新型解決其技術(shù)問題的解決方案是:心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白免疫層析定量檢測試紙條，其包括底板，所述底板上依次設(shè)有樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述吸水墊和熒光標(biāo)記物結(jié)合墊分別交疊壓在硝酸纖維素膜的兩端后在硝酸纖維素膜的表面形成檢測區(qū)，所述樣品墊交疊壓在熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上固定有生物素標(biāo)記的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體和鏈霉親和素標(biāo)記的熒光蛋白；所述檢測區(qū)內(nèi)的硝酸纖維素膜上固定有識別心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白另外一個表位的單克隆抗體構(gòu)成的檢測線和羊抗鼠IgG多克隆抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。
[0016]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述焚光標(biāo)記物結(jié)合墊包括層疊的第一焚光標(biāo)記物結(jié)合墊和第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊，所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊的一端墊在樣品墊的下方，所述第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊交疊壓在硝酸纖維素膜的一端。
[0017]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊中插入樣品墊下方的一端設(shè)有定位條，所述樣品墊的下端面設(shè)有能容納定位條的定位槽。
[0018]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，還包括卡殼，所述底板、樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊均置于卡殼內(nèi)，所述卡殼殼面上對應(yīng)于硝酸纖維膜的位置設(shè)有觀察窗，卡殼殼面上對應(yīng)于樣品墊的位置設(shè)有加樣孔。
[0019]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述觀察窗為長方形孔。
[0020]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白中的一種。
[0021]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述樣品墊為經(jīng)表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構(gòu)件。
[0022]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述底板為聚苯乙烯構(gòu)件或者聚乙烯構(gòu)件。
[0023]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述卡殼包括塑料上殼和塑料下殼，所述塑料上殼扣合塑料下殼上后形成卡殼。
[0024]本實用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點:
[0025](I)本實用新型將熒光蛋白作為標(biāo)記物，此標(biāo)記物穩(wěn)定性良好，有利于提高檢測穩(wěn)定性。
[0026](2)本實用新型通過利用“鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)”，提高檢測靈敏度，降低非特異性結(jié)合，有利于提高試劑盒性能。
[0027](3)利用本實用新型進(jìn)行降鈣素原的檢測時間不大于10分鐘，檢測線性范圍為0.10ng/ml?100.00ng/ml，極大地提高了檢測效率。
[0028](4)本實用新型可通過熒光免疫分析儀對結(jié)果進(jìn)行判讀，可實現(xiàn)自動化，減少主觀因素的影響，提供便利、快速、可靠的診斷結(jié)果。
[0029](5)本使用新型卡殼設(shè)有樣品進(jìn)入的加樣孔和供觀測結(jié)果的觀察窗，根據(jù)分析儀器判定結(jié)果，準(zhǔn)確可靠。
[0030](6)本實用新型制作方便，體積小、便于攜帶。
[0031](7)本實用新型檢測成本較低。
[0032](8)本實用新型可批量生產(chǎn)，適用于臨床