本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體而言，涉及一種雙競爭法適配體檢測試紙條及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

核酸適配體(Aptamer)是一種單鏈的寡核苷酸，多為單鏈DNA，長度在10～100bp之間，通常是利用特異的靶標(biāo)從隨機序列的寡核苷酸文庫中通過體外篩選獲得，作為一種新型生物識別分子，可以與靶標(biāo)物質(zhì)高親和力特異性結(jié)合。目前文獻(xiàn)報道的已經(jīng)篩選到適配體的靶標(biāo)有幾百種，建立的基于適配體的檢測方法主要包括比色法、熒光法、電化學(xué)等上百種方法，但到目前為止基于適配體的商品化的檢測產(chǎn)品還幾乎沒有。

膠體金免疫層析試紙條技術(shù)是目前最常見最成熟也最受歡迎的快速檢測產(chǎn)品形式之一，被廣泛應(yīng)用與臨床診斷、食品安全以及環(huán)境分析等，比如著名的早孕試紙條、瘦肉精試紙條等。適配體作為一種特異性的識別分子，也可以被用來開發(fā)基于試紙條形式的快速檢測產(chǎn)品，但是目前有關(guān)適配體試紙條的文獻(xiàn)報道卻很少，僅有幾篇文獻(xiàn)。這些文獻(xiàn)一般采用的原理是在試紙條檢測線處固定適配體的互補鏈，樣品中含有靶標(biāo)時，標(biāo)記有熒光或膠體金的適配體和樣品中的靶標(biāo)結(jié)合，則不能和試紙條檢測線處的互補鏈結(jié)合，檢測線處熒光信號降低或不出信號；反之，樣品中沒有靶標(biāo)時，標(biāo)記有熒光或膠體金的適配體流經(jīng)試紙條時和檢測線處的互補鏈結(jié)合，檢測線處出現(xiàn)較強的信號，從而根據(jù)熒光或膠體金信號大小判斷樣品中靶標(biāo)含量。

然而，在實際的應(yīng)用中，由于該檢測方法的原理主要是基于適配體-靶標(biāo)和適配體-互補鏈的競爭來實現(xiàn)的，因此很難設(shè)計比較可靠的檢測方法。由于不同適配體長度不同，因此其互補鏈的長度也不同，從而適配體與互補鏈的的親和力也不同。由于適配體鏈一般比較長，所以適配體與互補鏈的親和力經(jīng)常大于適配體與靶標(biāo)的親和力，從而導(dǎo)致無法檢測；目前文獻(xiàn)的解決方法都是通過將互補鏈截短，僅將部分互補鏈固定到檢測線上，從而降低互補鏈和適配體的親和力，但是這種方法需要繁雜的摸索，且互補鏈長度過短時適配體無法與互補鏈雜交，從而也導(dǎo)致無法檢測。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種雙競爭法適配體檢測試紙條，以解決上述問題。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種雙競爭法適配體檢測試紙條，所述試紙條包括底板和依次設(shè)置在底板上的樣品吸收墊、標(biāo)記物墊、反應(yīng)膜以及吸水墊；

所述標(biāo)記物墊包被有檢測探針，所述檢測探針為標(biāo)有用于顯示信號強度的指示劑的檢測靶標(biāo)物的適配體；

所述反應(yīng)膜上設(shè)置有檢測區(qū)和質(zhì)檢區(qū)；

所述檢測區(qū)固定包被有靶標(biāo)物抗原；

所述質(zhì)檢區(qū)固定包被有質(zhì)控探針；所述質(zhì)控探針的核酸序列與所述適配體的核酸序列互補。

本發(fā)明這種雙競爭模式適配體試紙條具有設(shè)計簡單、靈敏度高、特異性強、線性范圍廣等優(yōu)點，且實驗條件也更簡單，摸索起來更容易。

優(yōu)選的，如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條，當(dāng)所述靶標(biāo)物為有機物大分子靶標(biāo)時，所述靶標(biāo)物抗原即為靶標(biāo)物本身；

當(dāng)所述靶標(biāo)物為無機小分子靶標(biāo)時，所述靶標(biāo)物抗原為所述無機小分子靶標(biāo)與載體蛋白的偶聯(lián)物。

本發(fā)明所指的大分子是指可以直接固定到膜上并暴露抗原表位的物質(zhì)，小分子是指需要通過偶聯(lián)載體蛋白才能固定到膜上并暴露抗原表位的物質(zhì)。

優(yōu)選的，如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條，所述載體蛋白包括酪蛋白、牛血清白蛋白或雞卵清白蛋白。

雞卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)由386個氨基酸組成，分子量約43Kd。OVA作為載體蛋白可以協(xié)助小分子物質(zhì)固定到硝酸纖維素膜上并暴露其抗原表位，從而利于抗原與適配體的結(jié)合。

同樣的，載體蛋白也可選用酪蛋白(Casein)或牛血清白蛋白(BSA)等。

優(yōu)選的，如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條，所述質(zhì)控探針通過末端修飾生物素-親和素固定到所述質(zhì)控區(qū)。

優(yōu)選的，如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條，所述顯示信號強度的指示劑包括熒光物質(zhì)、量子點、地高辛標(biāo)記探針、生物素、放射性同位素、電子致密物質(zhì)、膠體金或酶中的任一種。

優(yōu)選的，如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條，所述熒光物質(zhì)包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基熒光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、熒光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚藍(lán)紫、亮甲酚藍(lán)、對氨基苯甲酸、赤蘚紅、酞菁、偶氮甲堿、花青、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、稀土金屬穴狀化合物、三雙吡啶基二胺銪、銪穴狀化合物或螯合物、二胺、雙花青苷、La Jolla藍(lán)染料、別藻藍(lán)蛋白、allococyanin B、藻藍(lán)蛋白C、藻藍(lán)蛋白R、硫胺、藻紅青蛋白、藻紅蛋白R、REG、羅丹明綠、羅丹明異硫氰酸酯、羅丹明紅、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基羅丹明異硫醇)、四甲基羅丹明和德克薩斯紅中的任一種。

優(yōu)選的，如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條，所述放射性同位素包括¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、⁹⁴mTc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵²mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁸²mRb和⁸³Sr中的任一種。

優(yōu)選的，如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條，所述酶包括辣根過氧化酶、堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一種。

如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條在檢測黃曲霉毒素B1中的應(yīng)用。

如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條檢測靶標(biāo)物含量的方法，其特征在于，包括：

1)、用試紙條檢測靶標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)品在試紙條的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的信號強度比值，制作靶標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對應(yīng)信號強度比值的線性回歸曲線，計算回歸方程；

2)、用試紙條檢測待測樣品，得到待測樣品在試紙條的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的信號強度比值，根據(jù)步驟1)得到回歸方程，得到所述待測樣品中靶標(biāo)物的含量。

用上述的試紙條檢測靶標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，得到標(biāo)準(zhǔn)品在所述試紙的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光或顯色信號比值包括如下步驟：取靶標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品滴加到試紙的樣品吸收墊上，10分鐘后，將試紙條放入試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3中進(jìn)行檢測，分別測定檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光或顯色信號強度；將檢測區(qū)的熒光信號強度(T)比上質(zhì)控區(qū)的熒光信號強度(C)，得到T/C值，為檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光信號比值。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1)、由于采用了雙競爭法，在檢測區(qū)固定靶標(biāo)抗原，使得靶標(biāo)-適配體與適配體-靶標(biāo)抗原的親和力一致，T線可以正確反映樣品中靶標(biāo)的含量，避免了原來由于適配體互補鏈親和力過大而無法設(shè)計試紙條或檢測結(jié)果不準(zhǔn)確不穩(wěn)定的問題；

2)、變原來由于適配體互補鏈親和力過大需要繁瑣優(yōu)化不容易開發(fā)試紙條的劣勢為優(yōu)勢，將適配體互補鏈固定到質(zhì)控區(qū)，當(dāng)適配體靶標(biāo)復(fù)合物移動到質(zhì)控區(qū)時，由于適配體與互補鏈結(jié)合力更強，因此復(fù)合物解離，適配體與互補鏈結(jié)合，作為第二重檢測提高了檢測的特異性；

3)、本方法采用T/C值對靶標(biāo)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的靶標(biāo)含量，比單獨用T線和C線計算提高了信噪比、靈敏度，擴大了檢測范圍；

4)、本發(fā)明采用雙競爭模式進(jìn)一步增強了本方法的可靠性，樣品中靶標(biāo)濃度高，則T線熒光強度弱C線強，若樣品中樣品濃度低，則T線熒光強度強C線弱，也就是說無論樣品中是否含有靶標(biāo)，T、C中至少有一條線熒光信號較強，也如果兩條線均沒有熒光，則表明試紙條失效或檢測方法有誤，需要重新測定；

5)、本雙競爭模式適配體試紙條采用比值作為數(shù)據(jù)歸一化方法，降低了不同紙條間不同操作人員乃至不同儀器掃描的實驗誤差，將不同紙條測得的樣品值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可以達(dá)到精確定量的效果；

6)、由于采用了適配體作為識別分子，基于適配體對靶標(biāo)的高親和力和高特異性，因此本發(fā)明試紙條具有高靈敏高特異性的優(yōu)點；

7)、核酸適配體具有非常好的熱穩(wěn)定性，因此本發(fā)明的試紙條還可以常溫儲運，具有貨架期長、結(jié)果可靠等優(yōu)點；

8)、本發(fā)明避免了傳統(tǒng)的繁瑣的互補鏈截短優(yōu)化過程，直接采用抗原和互補鏈固定，使得適配體試紙條開發(fā)更簡單，且性能更優(yōu)異。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明提供的試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本申請實施例中不同濃度AFB1水溶液下檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)處熒光強度檢測結(jié)果圖；

圖3為本申請實施例中AFB1濃度與T/C值線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖4為申請實施例中用試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3分別測定不同物質(zhì)檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)處的熒光強度，進(jìn)而計算出的T/C值。

附圖標(biāo)記：

1 樣品吸收墊；

2 標(biāo)記物墊；

3 反應(yīng)膜；

4 吸水墊；

5 底板；

6 檢測區(qū)；

7 質(zhì)控區(qū)；

8 待檢靶標(biāo)；

9 標(biāo)有用于顯示信號強度的指示劑的檢測靶標(biāo)物的適配體；

10 固定包被在檢測區(qū)的靶標(biāo)物抗原；

11 固定包被在質(zhì)控區(qū)的質(zhì)控探針。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例 檢測黃曲霉毒素B1試紙條的制備及在檢測黃曲霉毒素B1(AFB1)中的應(yīng)用

一、檢測黃曲霉毒素B1試紙條的制備

1、檢測探針和質(zhì)控探針的合成

分別設(shè)計合成熒光素標(biāo)記的檢測探針和生物素標(biāo)記的質(zhì)控探針。

其中檢測探針為熒光素Cy5標(biāo)記的黃曲霉毒素B1適配體；黃曲霉毒素B1適配體可以和檢測區(qū)的黃曲霉毒素B1半抗原結(jié)合，具體序列如下：

5'-Cy5-GTT-GGG-CAC-GTG-TTG-TCT-CTC-TGT-GTC-TCG-TGC-CCT-TCG-CTA-GGC-CCA-CA-3′

質(zhì)控探針為生物素標(biāo)記的黃曲霉毒素B1適配體的互補序列，可以與檢測探針適配體序列通過堿基互補結(jié)合。

質(zhì)控探針的核酸序列為：

5'-biotin-TGT-GGG-CCT-AGC-GAA-GGG-CAC-GAG-ACA-CAG-AGA-GAC-AAC-ACG-TGC-CCA-AC-3'

2、AFB1半抗原和載體蛋白BSA的偶聯(lián)物AFB1-BSA制備

首先經(jīng)過肟化反應(yīng)制備AFB1肟(AFB1-O)；然后用碳二亞胺法制備AFB1人工抗原，然后與陽離子化牛血清蛋白(C-BSA)的反應(yīng)得到偶聯(lián)產(chǎn)物，即偶聯(lián)物AFB1-BSA。

3、制備試紙條

1)、標(biāo)記物墊制備

將檢測探針包被在標(biāo)記物墊(上海杰一生物技術(shù)有限公司，JY-BX101)上(包被濃度為0.02μM)，得到包被檢測探針的標(biāo)記物墊,37度過夜烘干。

2)、反應(yīng)膜制備

反應(yīng)膜包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)。

將偶聯(lián)物AFB1-BSA按照包被濃度為5μM包被在反應(yīng)膜形成檢測區(qū)；

質(zhì)控探針為標(biāo)記生物素的適配體的互補序列，其通過鏈酶親和素與其上的生物素偶聯(lián)形成共價鍵包被在反應(yīng)膜上形成質(zhì)控區(qū)，包被濃度為1μM。

3)、試紙條組裝

試紙條由樣品吸收墊(上海杰一生物技術(shù)有限公司，JY-BX111)、上述1)制備的包被檢測探針的標(biāo)記物墊、上述2)制備的反應(yīng)膜、吸水墊依次按照順序黏貼在底板上，且反應(yīng)膜的檢測區(qū)與標(biāo)記物墊相鄰，反應(yīng)膜的檢質(zhì)控區(qū)與吸水墊相鄰，如圖1所示。

二、試紙條檢測原理

如圖1所示，當(dāng)不含黃曲霉毒素B1的樣品加入樣品吸收墊1上時，樣品在毛細(xì)作用下流動到標(biāo)記物墊2，并帶著熒光標(biāo)記的探針混合物一起繼續(xù)向前流動。當(dāng)流動到檢測區(qū)6時，檢測探針會與檢測區(qū)6處固定的半抗原結(jié)合，經(jīng)試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3檢測出高熒光強度；由于固定在標(biāo)記物墊2上的檢測探針濃度較低，絕大部分被檢測區(qū)結(jié)合，只有少數(shù)在層析作用下來不及結(jié)合的會流動到質(zhì)控區(qū)7與質(zhì)控探針11結(jié)合，因此質(zhì)控區(qū)7出現(xiàn)很弱的熒光強度。

如圖1所示，當(dāng)含有黃曲霉毒素B1的樣品加入樣品吸收墊1上時，樣品在毛細(xì)作用下流動到標(biāo)記物墊2，黃曲霉毒素B1與檢測探針(適配體)結(jié)合，并在毛細(xì)作用下一起向前流動。當(dāng)流動到檢測區(qū)6時，剩余未與黃曲霉毒素B1結(jié)合的檢測探針會與半抗原結(jié)合；樣品中的AFB1越多，結(jié)合的檢測探針也就越來越多，剩余的游離檢測探針就會越來越少，和檢測區(qū)6半抗原結(jié)合的檢測探針也就越少，熒光強度越低。反之，樣品中的黃曲霉毒素B1越少，剩余的游離檢測探針就會越來越多，和檢測區(qū)6處半抗原結(jié)合也就越多，熒光強度越強，AFB1濃度與檢測區(qū)6(T)的熒光強度成反比。和AFB1結(jié)合的檢測探針在液體流動下急需上行至質(zhì)控區(qū)7，由于質(zhì)控區(qū)7適配體互補鏈和適配體的結(jié)合力大于適配體與靶標(biāo)的結(jié)合力，因此檢測探針適配體/AFB1復(fù)合物解離，檢測探針適配體結(jié)合到質(zhì)控區(qū)7互補鏈上，因此樣品的靶標(biāo)AFB1越多，帶到質(zhì)控區(qū)7供互補鏈結(jié)合的檢測探針也就越多，熒光信號越強，反之樣品中的AFB1越少，帶到質(zhì)控區(qū)7可供質(zhì)控探針互補鏈結(jié)合的檢測探針適配體就越少，熒光強度越低，因此樣品中AFB1濃度與質(zhì)控區(qū)7(C)熒光信號成反比。利用檢測區(qū)6熒光強度(T)和質(zhì)控區(qū)7熒光強度(C)比值對AFB1濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程即可計算樣品中的AFB1濃度。

三、試紙條檢測方法

1)、黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品滴加到試紙的樣品吸收墊上，10分鐘后，將試紙條放入試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3中，進(jìn)行檢測，分別測定檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光信號強度；將檢測區(qū)的熒光信號強度(T)比上質(zhì)控區(qū)的熒光信號強度(C)，得到T/C值，制作黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對應(yīng)熒光信號T/C比值的線性回歸曲線，計算回歸方程；

2)、黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品B1替換為待測樣品，用上述試紙檢測待測樣品，記錄在所述試紙的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光信號比值，根據(jù)步驟(1)的回歸方程，得到待測樣品中黃曲霉毒素的濃度。

四、黃曲霉毒素B1試紙條在檢測黃曲霉毒素B1中的應(yīng)用

1、檢測黃曲霉毒素B1靈敏度與線性范圍研究

配制圖2所示的不同濃度AFB1(Fermentek Ltd，AF028)水溶液，分別用實施例1制備的試紙條進(jìn)行測定。

用試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3分別測定檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)處的熒光強度。結(jié)果如圖2所示，可以看出，隨著AFB1濃度增加，檢測區(qū)處熒光強度逐漸變小，質(zhì)控區(qū)熒光強度逐漸增加。利用檢測區(qū)熒光強度與質(zhì)控區(qū)熒光強度比值T/C值和黃曲霉毒素B1濃度對數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)，繪制檢測黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，結(jié)果表明，試紙條的靈敏度0.1ng/mL；線性檢測范圍為0.1ng/mL-1000ng/mL，線性回歸方程為y＝-1.8196x+5.2694，R²＝0.9846。

表1黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果

2、特異性研究

配制濃度為100ng/mL的AFB1溶液、100ng/mL的AFM1(百靈威科技有限公司)溶液、濃度為100ng/mL的黃曲霉毒素G1和G2(百靈威科技有限公司)、濃度為100ng/mL的黃曲霉毒素B2(百靈威科技有限公司)、濃度為100ng/mL的赭曲酶毒素Ochratoxin A(OTA,Fermentek Ltd)溶液、濃度為100ng/mL的玉米赤酶烯酮Zearalenone(ZEN，百靈威科技有限公司)溶液，濃度為100ng/mL的嘔吐毒素Vomitoxin(DON，百靈威科技有限公司)，濃度為100ng/mL的磺胺二甲氧嘧啶(SDM，百靈威科技有限公司)溶液，濃度為100ng/mL的卡那霉素(KAN，百靈威科技有限公司)溶液，濃度為100ng/mL的鉛離子溶液和空白樣品分別用試紙條進(jìn)行測定。

用試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3分別測定檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)處的熒光強度，計算T/C值。結(jié)果如圖4所示，其中AFM1為AFB1代謝物，結(jié)構(gòu)相似，表現(xiàn)出了近90％的交叉，而AFG1、AFB2、OTA、ZEN、DON等物質(zhì)以及空白樣品等均不能引起檢測區(qū)處熒光變化，這也說明本方法對黃曲霉毒素B1/M1具有很好的特異性。

五、黃曲霉毒素B1試紙條在飼料樣品中黃曲霉毒素B1檢測中的應(yīng)用

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

同本實施例第一部分中檢測黃曲霉毒素B1靈敏度與檢測范圍研究中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法，得到的回歸方程為：0.1ng/mL-1000ng/mL，線性回歸方程為y＝-1.8196x+5.2694，R²＝0.9846，為黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線指數(shù)回歸方程。

2、樣品提取

選擇5份經(jīng)進(jìn)口黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒(美國ROMER試劑盒)測定為陽性或陰性的飼料樣品，用本試紙條進(jìn)行測定。首先稱取2g樣品于50mL離心管中，加入8mL正己烷和10mL70％的甲醇水溶液，振蕩5min，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10min；去除上層液體，取0.5mL下層液體加入0.5mL去離子水，混勻，再取混勻液體0.5mL加入0.5mL35％的甲醇水溶液，振蕩30s；取100μL進(jìn)行分析(樣品稀釋倍數(shù)為20倍)。

3、樣品測定

取上述制備好的待測樣品100μL滴加到所述試紙的樣品吸收墊上，觀察樣品層析沿著硝酸纖維素膜流動，直到被上面的吸水墊吸附；10分鐘后，將試紙條放入試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3中，進(jìn)行檢測，分別測定檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光信號強度；將檢測區(qū)的熒光信號強度(T)比上質(zhì)控區(qū)的熒光信號強度(C)，將得到的計算值代入上述步驟1的回歸方程，計算得到待測樣品中黃曲霉毒素B1的濃度。

4、檢測結(jié)果：

5份飼料實際樣品檢測結(jié)果如表2所示。從結(jié)果可以看出，本發(fā)明試紙條結(jié)果與進(jìn)口試劑盒相比，回收率在92.7％～134.4％之間，回收率較好，說明本發(fā)明試紙條和進(jìn)口試劑盒具有非常好一致性，因此可以用于實際樣品中黃曲霉毒素B1的檢測。

表2本發(fā)明試紙條檢測玉米中AFB1結(jié)果與LC-MS方法比較

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。