專利名稱：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性的實(shí)時(shí)pcr檢測(cè)的制作方法
單核苷酸多態(tài)性的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域
本申請(qǐng)要求在2010年10月4日提交的第61/389,412號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)，在2010年10月7日提交的第61/390，701號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)，以及在2011年6月13日提交的第13/158，593號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，通過(guò)引用將這些申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容包含于此。
本公開(kāi)描述了使用單核苷酸多態(tài)性(SNP)特異性的CataCleave 探針對(duì)SNP的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。
背景技術(shù)：
人類基因組計(jì)劃(HGP)的完成已經(jīng)為更好地了解在給定人類種群內(nèi)的基因多樣性以及該多樣性與基因疾病的起始和誘因如何相關(guān)鋪平了道路。例如，稱為單核苷酸多態(tài)性(SNP)的個(gè)體之間的單核苷酸差異可能是造成表型的巨大差異的原因，其在某些情況下可以預(yù)測(cè)誰(shuí)將患某種疾病或者誰(shuí)將對(duì)這些疾病的特定治療做出反應(yīng)。藥物基因組學(xué)領(lǐng)域正在快速地接近根據(jù)病人基因組成定制藥物治療。對(duì)病人的DNA中的基因突變的快速和可靠的檢測(cè)可以指導(dǎo)醫(yī)師的臨床診斷和藥物治療的選擇。這在腫瘤學(xué)中尤其正確，其中，致癌基因的編碼區(qū)域內(nèi)的離散突變的存在可以有力地預(yù)測(cè)癌癥的易感性和預(yù)后。
例如，在大多數(shù)的醫(yī)療實(shí)踐中，對(duì)在BRCA的腫瘤抑制基因中的有害突變的存在的基因檢測(cè)現(xiàn)在是常規(guī)的。有害的BRCA-1突變可以大大增加?jì)D女在早期(更年期之前)患乳房癌和/或卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)以及患宮頸癌、子宮癌、胰腺癌和結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。有害的BRCA-2突變可以另外增加胰腺癌、胃癌、膽囊和膽管癌以及黑色素瘤的風(fēng)險(xiǎn)。在包括TP53、PTEN、STK11/LKB1、⑶H1、CHEK2、ATM、MLH1和MSH2的若干其他基因中的突變已經(jīng)與遺傳性乳房和/或卵巢腫瘤有關(guān)。
伴隨出現(xiàn)核酸擴(kuò)增，可以將任何DNA序列的低至單個(gè)的分子復(fù)制足夠的次數(shù)以允許SNP序列分析?？梢酝ㄟ^(guò)諸如DNA測(cè)序、熒光探針檢測(cè)、質(zhì)譜分析法或DNA微陣列雜交(例如，第5，885，775號(hào)、第6，368，799號(hào)美國(guó)專利)的各種技術(shù)檢測(cè)SNP。然而，由于總體差的靈敏度、成本、時(shí)間消耗或者對(duì)PCR后處理的需要，這些方法中的許多方法仍然不適于高通量應(yīng)用。此外，現(xiàn)有的SNP檢測(cè)方法具有不可接受的高水平的假陽(yáng)性和/或假陰性的結(jié)果。
由于上述的原因，現(xiàn)有技術(shù)未滿足在DNA擴(kuò)增的同時(shí)對(duì)SNP進(jìn)行精確的實(shí)時(shí)檢測(cè)的需要。 發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題
描述了用于在實(shí)時(shí)PCR中使用包括DNA和RNA序列的特異性探針的快速檢測(cè)SNP的方法和試劑盒。該方法能夠有助于以經(jīng)濟(jì)和可靠的方式對(duì)單個(gè)PCR片段進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)SNP的高通量檢測(cè)。
在一個(gè)實(shí)施例中，公開(kāi)了一種用于靶DNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的方法，包括以下步驟:提供將被檢測(cè)具有多態(tài)性的靶DNA的存在的樣品；提供可以退火到靶DNA的成對(duì)的擴(kuò)增引物，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的上游退火，第二擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的下游退火；提供包括可檢測(cè)的標(biāo)簽以及DNA和RNA核酸序列的探針，其中，探針的RNA核酸序列與包含多態(tài)性的靶DNA序列的選擇區(qū)域完全互補(bǔ)，探針的DNA核酸序列與和靶DNA序列的選擇區(qū)域相鄰的DNA序列基本上互補(bǔ)；在擴(kuò)增聚合酶活性、擴(kuò)增緩沖液、RNA酶H活性和探針的存在下，在探針中的RNA序列可以與包含多態(tài)性的PCR片段中的互補(bǔ)的DNA序列形成RNA:DNA異源雙鏈體的條件下，擴(kuò)增第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物之間的PCR片段；以及檢測(cè)來(lái)自探針上的標(biāo)簽的信號(hào)發(fā)射的實(shí)時(shí)增加，其中，信號(hào)的增加表明靶DNA中存在多態(tài)性。在一個(gè)方面中，來(lái)自探針上的標(biāo)簽的信號(hào)發(fā)射的實(shí)時(shí)增加是由于RNA酶H對(duì)在RNAiDNA異源雙鏈體中的探針的RNA序列的切割。 在另一個(gè)實(shí)施例中，公開(kāi)了一種用于靶DNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的方法，所述方法包括以下步驟:提供將被檢測(cè)具有多態(tài)性的靶DNA的存在的樣品；提供可以退火到靶DNA的成對(duì)的擴(kuò)增引物，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的上游退火，第二擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的下游退火；提供包括可檢測(cè)的標(biāo)簽以及DNA和RNA核酸序列的探針，其中，探針的RNA核酸序列與在多態(tài)性的位置包含野生型DNA序列的靶DNA序列的選擇區(qū)域完全互補(bǔ)，探針的DNA核酸序列與和靶DNA序列的選擇區(qū)域相鄰的DNA序列基本上互補(bǔ)；在擴(kuò)增聚合酶活性、擴(kuò)增緩沖液、RNA酶H活性和探針的存在下，在探針中的RNA序列可以與包含多態(tài)性的PCR片段中的互補(bǔ)的DNA序列形成RNA = DNA異源雙鏈體的條件下，擴(kuò)增第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物之間的PCR片段；以及檢測(cè)來(lái)自探針上的標(biāo)簽的信號(hào)發(fā)射的實(shí)時(shí)降低，其中，信號(hào)的降低表明靶DNA中存在多態(tài)性。在另一個(gè)實(shí)施例中，公開(kāi)了一種用于靶RNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的方法，所述方法包括以下步驟:提供靶RNA ;提供可以退火到靶RNA的cDNA的成對(duì)的擴(kuò)增引物，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性序列的位置的上游退火，第二擴(kuò)增引物在多態(tài)性序列的位置的下游退火；提供包括可檢測(cè)的標(biāo)簽以及與靶RNA的cDNA基本上互補(bǔ)的DNA和RNA核酸序列的探針，其中，探針的RNA核酸序列包含與在疑似`SNP序列的位置處的相應(yīng)的cDNA序列完全互補(bǔ)的序列；在逆轉(zhuǎn)錄酶活性、擴(kuò)增聚合酶活性、逆轉(zhuǎn)錄PCR緩沖液、位點(diǎn)特異性RNA酶H活性和探針的存在下，在探針中的RNA序列可以與RT-PCR DNA片段中的互補(bǔ)序列形成RNA:DNA異源雙鏈體的情況下，擴(kuò)增第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物之間的逆轉(zhuǎn)錄PCR片段；以及檢測(cè)來(lái)自探針上的標(biāo)簽的信號(hào)發(fā)射的實(shí)時(shí)增加，其中，信號(hào)的增加表明靶RNA的cDNA中存在多態(tài)性。在一個(gè)方面中，來(lái)自探針上的標(biāo)簽的信號(hào)發(fā)射的實(shí)時(shí)增加是由于RNA酶H對(duì)在RNAiDNA異源雙鏈體中的探針的RNA序列的切割。在另一個(gè)實(shí)施例中，公開(kāi)了一種用于靶RNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的方法，所述方法包括以下步驟:提供將被檢測(cè)具有多態(tài)性的靶RNA的存在的樣品；提供可以退火到靶RNA的cDNA的成對(duì)的擴(kuò)增引物，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的上游退火，第二擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的下游退火；提供包括可檢測(cè)的標(biāo)簽以及DNA和RNA核酸序列的探針，其中，探針的RNA核酸序列與在多態(tài)性的位置包含野生型DNA序列的cDNA的選擇區(qū)域完全互補(bǔ)，探針的DNA核酸序列與和cDNA的選擇區(qū)域相鄰的DNA序列基本上互補(bǔ)；在逆轉(zhuǎn)錄酶活性、擴(kuò)增聚合酶活性、逆轉(zhuǎn)錄PCR緩沖液、RNA酶H活性和探針的存在下，在探針中的RNA序列可以與在多態(tài)性的位置包含野生型DNA序列的RT-PCR DNA片段中的互補(bǔ)的序列形成RNA:DNA異源雙鏈體的條件下，擴(kuò)增第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物之間的逆轉(zhuǎn)錄PCR片段；以及檢測(cè)來(lái)自探針上的標(biāo)簽的信號(hào)發(fā)射的實(shí)時(shí)降低，其中，信號(hào)的降低表明靶RNA中存在多態(tài)性。在另一個(gè)實(shí)施例中，公開(kāi)了一種用于靶DNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含:可以退火到靶DNA的成對(duì)的擴(kuò)增引物，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的上游退火，第二擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的下游退火；探針，包含可檢測(cè)的標(biāo)簽以及DNA和RNA核酸序列，其中，探針的RNA核酸序列與包含多態(tài)性的靶DNA序列的選擇區(qū)域完全互補(bǔ)，探針的DNA核酸序列與和靶DNA序列的選擇區(qū)域相鄰的DNA序列基本上互補(bǔ)；以及擴(kuò)增聚合酶活性、擴(kuò)增緩沖液和RNA酶H活性。在另一個(gè)實(shí)施例中，公開(kāi)了一種用于靶DNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含:可以退火到靶DNA的成對(duì)的擴(kuò)增引物，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的上游退火，第二擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的下游退火；探針，包含可檢測(cè)的標(biāo)簽以及DNA和RNA核酸序列，其中，探針的RNA核酸序列與在多態(tài)性的位置處包含野生型DNA序列的靶DNA序列的選擇區(qū)域完全互補(bǔ)，探針的DNA核酸序列與和靶DNA序列的選擇區(qū)域相鄰的DNA序列基本上互補(bǔ)；以及擴(kuò)增聚合酶活性、擴(kuò)增緩沖液和RNA酶H活性。在另一個(gè)實(shí)施例中，公開(kāi)了一種用于靶RNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含:可以退火到靶RNA的cDNA的成對(duì)的擴(kuò)增引物，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性序列的位置的上游退火，第二擴(kuò)增引物在多態(tài)性序列的位置的下游退火；探針，包含可檢測(cè)的標(biāo)簽以及DNA和RNA核酸序列，其中，探針的RNA核酸序列與包含多態(tài)性的cDNA的選擇區(qū)域完全互補(bǔ)，探針的DNA核酸序列與和cDNA的選擇區(qū)域相鄰的DNA序列基本上互補(bǔ)；以及反轉(zhuǎn)錄酶活性、擴(kuò)增聚合酶活性、反轉(zhuǎn)錄PCR緩沖液和RNA酶H活性。在另一個(gè)實(shí)施例中，公開(kāi)了一種用于靶RNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含:可以退火到靶RNA的cDNA的成對(duì)的擴(kuò)增引物，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性序列的位置的上游退火，第二擴(kuò)增弓I物在多態(tài)性序列的位置的下游退火；探針，包含可檢測(cè)的標(biāo)簽以及DNA和RNA核酸序列，其中，探針的RNA核酸序列與在多態(tài)性的位置包含野生型DNA序列的cDNA的選擇區(qū)域完全互補(bǔ)，探針的DNA核酸序列與和cDNA的選擇區(qū)域相鄰的DNA序列基本上互補(bǔ)；以及反轉(zhuǎn)錄酶活性、擴(kuò)增聚合酶活性、反轉(zhuǎn)錄PCR緩沖液和RNA酶H活性。多態(tài)性可以是單核苷酸多態(tài)性(SNP)。靶DNA可以是基因組DNA。靶RNA可以是基因組RNA或轉(zhuǎn)錄的mRNA。 探針的DNA序列和RNA序列可以是共價(jià)連接的。
探針上的可檢測(cè)標(biāo)簽可以是諸如FRET對(duì)的熒光標(biāo)簽。PCR片段或探針可以連接到固體載體。擴(kuò)增聚合酶活性可以是熱穩(wěn)定的DNA聚合酶的活性,位點(diǎn)特異性RNA酶H活性可以是熱穩(wěn)定的RNA酶H的活性或者熱啟動(dòng)熱穩(wěn)定的RNA酶H的活性。在某些實(shí)施例中，在相同的分子上發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶活性和擴(kuò)增聚合酶活性。前述的實(shí)施例具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)靶核酸中的SNP的存在。該檢測(cè)方法快速、準(zhǔn)確并適于高通量應(yīng)用。還描述了用于檢測(cè)在不同的基因座處的SNP的方便、用戶友好和可靠的診斷試劑盒。
技術(shù)方案
除非另有說(shuō)明，否則本發(fā)明的實(shí)踐采用本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)。這樣的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)講是公知的，并且在文獻(xiàn)中被充分地解釋。參見(jiàn)，例如，Ausubel 等作者，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 公司，NY, N.Y.(1987-2008),包括所有增刊；Sambrook 等人，Molecular Cloning:ALaboratoryManual,第二版，Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)。
除非另有定義，否則這里使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的意思相同的意思。本說(shuō)明書(shū)也提供了對(duì)術(shù)語(yǔ)的定義，以有助于解釋本申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容和權(quán)利要求書(shū)。如果定義與別處的定義不一致，則將以本申請(qǐng)中所闡述的定義為準(zhǔn)。
術(shù)語(yǔ)“多態(tài)性”是指在不同的基因組或個(gè)體之間或之中出現(xiàn)兩個(gè)或更多的替換的基因組序列或等位基因。
術(shù)語(yǔ)“多態(tài)的”是指在種群中發(fā)現(xiàn)特定的基因組序列的兩個(gè)或更多的變體的情況。
術(shù)語(yǔ)“多態(tài)性位點(diǎn)”是變異發(fā)生的基因座。多態(tài)性位點(diǎn)通常具有至少兩個(gè)等位基因，每個(gè)等位基因在選擇的種群中以顯著的頻率出現(xiàn)。在被稱為單核苷酸多態(tài)性(SNP)的情況下，多態(tài)性基因座可以是小至一個(gè)的堿基對(duì)。將首先被確定的等位基因形式任意地指定為參考、野生型、常見(jiàn)或主要形式，將其他的等位基因形式指定為替換的、次要的、少見(jiàn)的或變異的等位基因。
術(shù)語(yǔ)“基因型”是指對(duì)包含在個(gè)體或樣品中的基因的等位基因的描述。
術(shù)語(yǔ)“單核苷酸多態(tài)性”(“SNP”)是指在等位基因之間變化的一個(gè)核苷酸的位點(diǎn)。單核苷酸可以被改變(取代)、移除(刪除)或添加(插入)到多核苷酸序列。插入或刪除SNP可以導(dǎo)致翻譯移碼。單核苷酸多態(tài)性可以落入基因的編碼序列內(nèi)、基因的非編碼區(qū)域內(nèi)或基因之間的基因間區(qū)域內(nèi)。由于基因編碼的簡(jiǎn)并性，在編碼序列內(nèi)的SNP將不必然改變產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。兩種形式都導(dǎo)致相同的多肽序列的SNP稱作同義的(有時(shí)稱作沉默突變)，但是如果產(chǎn)生不同的多肽序列，則它們是非同義的。非同義的變化可以是錯(cuò)義或者無(wú)義，其中，錯(cuò)義變化導(dǎo)致不同的氨基酸，而無(wú)義變化導(dǎo)致提前的終止密碼?！肮δ躍NP”是在基因表達(dá)中 或基因產(chǎn)物的表達(dá)或功能中產(chǎn)生變化的SNP，因此最能夠預(yù)測(cè)可能的臨床表型。由功能SNP導(dǎo)致的基因功能的變化可以包括編碼的多肽的變化、mRNA穩(wěn)定性的變化以及轉(zhuǎn)錄和翻譯因子與DNA或RNA的結(jié)合等。未在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域內(nèi)的SNP仍然可以對(duì)基因拼接、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或非編碼RNA序列產(chǎn)生影響。
根據(jù)實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，SNP具有兩種替代的等位基因，每種對(duì)應(yīng)于可以存在于染色體中的核苷酸。因此，SNP由四種核苷酸(A、C、G、T)中的兩種核苷酸表征。示例將是SNP在每條染色體上的給定位置處具有等位基因C或等位基因T。這表示為C >T或C/T。更常出現(xiàn)的等位基因首先出現(xiàn)(在這種情況下是C)，并被稱作主要的、常見(jiàn)的或野生型等位基因。不常出現(xiàn)的取代常見(jiàn)等位基因的替代等位基因(在這種情況下是T)稱作次要的、少見(jiàn)的或變異的等位基因。野生型和變異的等位基因可以分別稱作常見(jiàn)的或少見(jiàn)的等位基因。由于人類是二倍體生物體(意思是每條染色體有兩個(gè)拷貝)，所以每個(gè)個(gè)體在SNP處具有兩個(gè)等位基因。這些等位基因可以是兩個(gè)拷貝的相同的等位基因(CC或TT)，或者它們可以是不同的等位基因(CT)。CC、CT和TT被稱作基因型。這些之中，CC和TT由具有兩個(gè)拷貝的相同的等位基因表征，并稱作純合基因型?；蛐虲T在每條染色體上具有不同的等位基因，是雜合基因型。具有純合基因型或雜合基因型的個(gè)體分別被稱作純合子和雜合子。SNP的選擇實(shí)施例提供了一種檢測(cè)任何靶核酸序列中的一個(gè)或多個(gè)SNP的新型方法。通過(guò)參照SNP的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，極方便確定SNP在目標(biāo)基因中的位置。dbSNP是來(lái)自美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的 SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)。SNPedia是來(lái)自于混合組織的維基-風(fēng)格的數(shù)據(jù)庫(kù)。OM頂數(shù)據(jù)庫(kù)以文本的形式描述了多態(tài)性和例如疾病之間的聯(lián)系，而HGVbaseG2P允許用戶可視地詢問(wèn)實(shí)際的概要水平的相關(guān)數(shù)據(jù)。還可以在國(guó)際單體型圖計(jì)劃(International HapMap Project)找到關(guān)于SNP的珍貴的信息，其中，國(guó)際單體型圖計(jì)劃在整個(gè)人類基因組中尋找大約每5kb —個(gè)信息性SNP的基因型。對(duì)具有來(lái)自尼日利亞、歐洲和中國(guó)/日本的祖先的人群進(jìn)行基因分型，以確定人類DNA序列變異的共同圖案(單體 型)并使得該信息可以在公共領(lǐng)域內(nèi)可免費(fèi)地獲得。該信息將有助于發(fā)現(xiàn)影響常見(jiàn)疾病和藥物響應(yīng)的序列變異。構(gòu)建人類單體型圖是邁向個(gè)體化治療的重要步驟。用于基因分型的引物的選擇一旦選擇了基因和相關(guān)的SNP，制備用于靶核酸序列的基因分型的引物寡核苷酸和探針?！鞍蠨NA或靶RNA”或“靶核酸”或“靶核酸序列”是指待分析的并包含目標(biāo)多態(tài)性位點(diǎn)的核酸的區(qū)域。靶核酸序列在PCR反應(yīng)或逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)中用作用于擴(kuò)增的模板。靶核酸序列可以包括自然產(chǎn)生的分子和合成的分子。示例性靶核酸序列包括但不限于基因組DNA或基因組RNA。 如這里所使用，術(shù)語(yǔ)“核酸”是指寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述寡核苷酸或多核苷酸可以被修飾或可以包含被修飾的堿基。寡核苷酸是包含2至60個(gè)核苷酸的單鏈核苷酸聚合物。多核苷酸是包含兩個(gè)或更多的核苷酸的核苷酸聚合物。多核苷酸可以是包括退火的寡核苷酸的雙鏈DNA，其中，第二鏈?zhǔn)蔷哂械谝还押塑账岬姆聪蚧パa(bǔ)序列的寡核苷酸，多核苷酸也可以是包含脫氧胸苷的單鏈核酸聚合物、單鏈RNA、雙鏈RNA或RNA/DNA異源雙鏈體。核酸包括但不限于基因組DNA、cDNA、hnRNA、snRNA、mRNA、rRNA、tRNA、片段化核酸、從諸如線粒體或葉綠體的亞細(xì)胞器獲得的核酸以及從可以存在于生物試樣上或生物試樣中的DNA或RNA病毒或者微生物獲得的核酸。核酸可以由單一類型的糖配基組成，例如，如在RNA和DNA的情況下，或者可以由不同的糖配基的混合物組成，例如，如在RNA/DNA嵌合體的情況下。如這里所使用，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”與“引物”或“多核苷酸”交換地使用。術(shù)語(yǔ)“弓I物”是指在PCR反應(yīng)中用作DNA合成起始位點(diǎn)的寡核苷酸。引物通常是大約15至大約35個(gè)核苷酸長(zhǎng)并雜交到與靶序列互補(bǔ)的區(qū)域。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適的方法(例如，化學(xué)合成)來(lái)合成和制備寡核苷酸。寡核苷酸也可以通過(guò)商業(yè)來(lái)源方便地購(gòu)得。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地優(yōu)化并確定在PCR反應(yīng)中與目標(biāo)多態(tài)性位點(diǎn)側(cè)接的引物。商業(yè)購(gòu)得的引物可以用于擴(kuò)增特定SNP的目標(biāo)特定基因。許多計(jì)算機(jī)程序(例如,Primer-Express)可容易地用于設(shè)計(jì)理想引物組。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)明顯的將是，可以相應(yīng)地基于提供(或者使用登錄號(hào)公開(kāi)地獲得)的核酸信息來(lái)制備引物和探針。
術(shù)語(yǔ)“退火”和“雜交”被交換地使用，并表示一個(gè)核酸與另一個(gè)核酸的堿基對(duì)相互作用，導(dǎo)致形成雙鏈體、三鏈體或其他更高級(jí)的結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施例中，初級(jí)相互作用是通過(guò)沃森/克里克以及胡斯坦型氫鍵的堿基特異性，例如，A/T和G/C。在某些實(shí)施例中，堿基堆積和疏水作用也可以有助于雙鏈體的穩(wěn)定?；旧匣パa(bǔ)是指序列上充分互補(bǔ)以退火并形成穩(wěn)定的雙鏈體的兩條核酸鏈。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道如何設(shè)計(jì)與目標(biāo)多態(tài)性位點(diǎn)側(cè)接的PCR引物。合成的寡核苷酸的長(zhǎng)度通常在20和26個(gè)堿基對(duì)之間，具有大約55°C的熔點(diǎn)(TM)?？梢栽谟蓢?guó)際單體型圖計(jì)劃創(chuàng)建的分配文件中找到用于引物設(shè)計(jì)的旁側(cè)序列。這些文件包含大量的關(guān)于每個(gè)SNP的信息，包括觀察的等位基因和每個(gè)側(cè)面的IOOObp的NCB1-遮蔽序列。
核酸模板的制備
在一些實(shí)施例中，樣品包括純化的核酸模板(例如，mRNA、rRNA及其混合物)。從樣品提取和純化RNA的程序在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。例如,可以使用TRIzol 試劑(Invitrogen)提取法從細(xì)胞分離RNA。然后，使用例如Nanodrop 分光光度計(jì)和Agilent2100生物分析儀確定RNA的量和質(zhì)量。
在其他實(shí)施例中，樣品是細(xì)胞裂解液，通過(guò)使用pH為大約6至大約9的裂解緩沖液、濃度為大約0.125%至大約2%的兩性離子洗漆劑、濃度為大約0.3mg/ml至大約2.5mg/ml的疊氮化物和諸如蛋白酶K(大約lmg/ml)的蛋白酶裂解細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生所述細(xì)胞裂解液。在55°C溫育15分鐘之后，在95°C處理10分鐘使蛋白酶K失活，以產(chǎn)生適合于高效PCR或逆轉(zhuǎn)錄PCR分析的“基本上無(wú)蛋白質(zhì)”的裂解液。
在一個(gè)實(shí)施例中，Ix裂解試劑包含12.5mM Tris乙酸鹽或Tris-HCl或HEPES (4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(PH = 7-8)、0.25% (w/v) CHAPS,0.3125mg/ml 疊氮化鈉和lmg/ml的蛋白酶K。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“裂解液”是指具有裂解的細(xì)胞碎片和核酸的液相。
如這里所使用，術(shù)語(yǔ)基本上無(wú)蛋白質(zhì)是指大部分蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶的水解切割而失活的裂解液。蛋白酶可以包括蛋白酶K。在細(xì)胞裂解過(guò)程中加入蛋白酶K使核酸酶迅速失活，否則核酸酶會(huì)降解靶核酸?？梢詫?duì)“基本上無(wú)蛋白質(zhì)”的裂解液進(jìn)行除去失活的蛋白質(zhì)的處理，或者可以不進(jìn)行該處理。
如這里所使用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”可以指原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”可以指諸如細(xì)菌的微生物，細(xì)菌包括但不限于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏 陰性細(xì)菌和耐酸細(xì)菌等。在某些實(shí)施例中，可以使用表面的擦拭取樣(swab sampling)來(lái)收集待測(cè)“細(xì)胞”。在其他實(shí)施例中，“細(xì)胞”可以指病原生物體。
在其他實(shí)施例中，試樣包括病毒核酸，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒核酸。在某些實(shí)施例中，試樣可以包括慢病毒核酸，例如，HIV-1或HIV-2。
如這里所使用，“兩性離子洗滌劑”指表現(xiàn)出兩性離子特性(例如，不具有凈電荷、無(wú)導(dǎo)電性和電泳遷移率、不與離子交換樹(shù)脂結(jié)合、破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用)的洗滌劑，其包括但不限于CHAPS、CHAPSO和三甲銨乙內(nèi)酯衍生物，例如，三甲銨乙內(nèi)酯衍生物優(yōu)選是以商品名 Zwittergent (Calbiochem, San Diego, CA)和 Anzergent (Anatrace 公司，Maumee，0H)出售的磺基三甲銨乙內(nèi)酯。在一個(gè)實(shí)施例中，兩性離子洗滌劑是CHAPS (CAS號(hào):75621_03_3 ；可從SIGMA-ALDRICH購(gòu)得，產(chǎn)品號(hào)為C3023-1G)，CHAPS是3_[ (3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸的縮寫(xiě)(在第4，372，888號(hào)美國(guó)專利中被更詳細(xì)地描述)，具有結(jié)構(gòu):
權(quán)利要求
1.一種用于靶DNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的方法，包括以下步驟: a)提供將被檢測(cè)具有多態(tài)性的靶DNA的存在的樣品； b)提供能夠退火到靶DNA的擴(kuò)增引物對(duì)，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的上游退火，第二擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的下游退火； c)提供包括可檢測(cè)的標(biāo)簽以及DNA和RNA核酸序列的探針，其中，探針的RNA核酸序列與包含多態(tài)性的靶DNA序列的選擇區(qū)域完全互補(bǔ)，探針的DNA核酸序列與和靶DNA序列的選擇區(qū)域相鄰的DNA序列基本上互補(bǔ)； d)在擴(kuò)增聚合酶活性、擴(kuò)增緩沖液、RNA酶H活性和探針的存在下以及探針中的RNA序列能夠與包含多態(tài)性的PCR片段中的互補(bǔ)的DNA序列形成RNA = DNA異源雙鏈體的條件下，擴(kuò)增第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物之間的PCR片段；以及 e)檢測(cè)來(lái)自探針上的標(biāo)簽的信號(hào)發(fā)射的實(shí)時(shí)增加， 其中，信號(hào)的增加表明靶DNA中存在多態(tài)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，來(lái)自探針上的標(biāo)簽的信號(hào)發(fā)射的實(shí)時(shí)增加是由于RNA酶H對(duì)在RNA = DNA異源雙鏈體中的探針的RNA序列的切割。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，探針的RNA核酸序列包含與靶DNA中的多態(tài)性互補(bǔ)的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，多態(tài)性是單核苷酸多態(tài)性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，探針的DNA和RNA序列是共價(jià)連接的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，探針上的可檢測(cè)標(biāo)簽是熒光標(biāo)簽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，熒光標(biāo)簽包含熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，PCR片段被連接到固體載體。
9.一種用于靶DNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的方法，所述方法包括以下步驟: a)提供將被檢測(cè)具有多態(tài)性的靶DNA的存在的樣品； b)提供能夠退火到靶DNA的擴(kuò)增引物對(duì)，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的上游退火，第二擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的下游退火； c)提供包括可檢測(cè)的標(biāo)簽以及DNA和RNA核酸序列的探針，其中，探針的RNA核酸序列與在多態(tài)性的位置包含野生型DNA序列的靶DNA序列的選擇區(qū)域完全互補(bǔ)，探針的DNA核酸序列與和靶DNA序列的選擇區(qū)域相鄰的DNA序列基本上互補(bǔ)； d)在擴(kuò)增聚合酶活性、擴(kuò)增緩沖液、RNA酶H活性和探針的存在下以及探針中的RNA序列能夠與包含多態(tài)性的PCR片段中的互補(bǔ)的DNA序列形成RNA = DNA異源雙鏈體的條件下，擴(kuò)增第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物之間的PCR片段；以及 e)檢測(cè)來(lái)自探針上的標(biāo)簽的信號(hào)發(fā)射的實(shí)時(shí)減小， 其中，信號(hào)的減小表明靶DNA中存在多態(tài)性。
10.一種用于靶RNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的方法，所述方法包括以下步驟: a)提供將被檢測(cè)具有多態(tài)性的靶RNA的樣品； b)提供能夠退火到靶RNA的cDNA的擴(kuò)增引物對(duì)，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的上游退火，第二擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的下游退火； c)提供包括可檢測(cè)的標(biāo)簽以及DNA和RNA核酸序列的探針，其中，探針的RNA核酸序列與包含多態(tài)性的cDNA的選擇區(qū)域完全互補(bǔ)， 探針的DNA核酸序列與和cDNA的選擇區(qū)域相鄰的DNA序列基本上互補(bǔ)； d)在逆轉(zhuǎn)錄酶活性、擴(kuò)增聚合酶活性、逆轉(zhuǎn)錄PCR緩沖液、RNA酶H活性和探針的存在下以及探針中的RNA序列能夠與包含多態(tài)性的逆轉(zhuǎn)錄PCR DNA片段中的互補(bǔ)的序列形成RNA:DNA異源雙鏈體的條件下，擴(kuò)增第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物之間的逆轉(zhuǎn)錄PCR片段；以及 e)檢測(cè)來(lái)自探針上的標(biāo)簽的信號(hào)發(fā)射的實(shí)時(shí)增加， 其中，信號(hào)的增加表明靶RNA中存在多態(tài)性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，來(lái)自探針上的標(biāo)簽的信號(hào)發(fā)射的實(shí)時(shí)增加是由于RNA酶H對(duì)在RNA = DNA異源雙鏈體中的探針的RNA序列的切割。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，探針的RNA核酸序列包含與在靶RNA中的多態(tài)性的位置處的cDNA互補(bǔ)的RNA序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，多態(tài)性是單核苷酸多態(tài)性。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，靶RNA是轉(zhuǎn)錄的mRNA。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，探針的DNA序列和RNA序列是共價(jià)連接的。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，探針上的可檢測(cè)標(biāo)簽是熒光標(biāo)簽。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，熒光標(biāo)簽包含熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，探針或PCR片段連接到固體載體。
19.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，RNA酶H活性是熱啟動(dòng)熱穩(wěn)定的RNA酶H的活性。
20.一種用于靶RNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的方法，所述方法包括以下步驟: a)提供將被檢測(cè)具有多態(tài)性的靶RNA的樣品； b)提供能夠退火到靶RNA的cDNA的擴(kuò)增引物對(duì)，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的上游退火，第二擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的下游退火； c)提供包括可檢測(cè)的標(biāo)簽以及DNA和RNA核酸序列的探針，其中，探針的RNA核酸序列與在多態(tài)性的位置包含野生型DNA序列的cDNA的選擇區(qū)域完全互補(bǔ)，探針的DNA核酸序列與和cDNA的選擇區(qū)域相鄰的DNA序列基本上互補(bǔ)； d)在逆轉(zhuǎn)錄酶活性、擴(kuò)增聚合酶活性、逆轉(zhuǎn)錄PCR緩沖液、RNA酶H活性和探針的存在下以及探針中的RNA序列能夠與包含多態(tài)性的逆轉(zhuǎn)錄PCR DNA片段中的互補(bǔ)的序列形成RNA:DNA異源雙鏈體的條件下，擴(kuò)增第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物之間的逆轉(zhuǎn)錄PCR片段；以及 e)檢測(cè)來(lái)自探針上的標(biāo)簽的信號(hào)發(fā)射的實(shí)時(shí)減小， 其中，信號(hào)的減小表明靶RNA中存在多態(tài)性。
21.一種用于靶DNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含: a)能夠退火到靶DNA的擴(kuò)增引物對(duì)，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的上游退火，第二擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的下游退火； b)探針，包含可檢測(cè)的標(biāo)簽以及DNA和RNA核酸序列，其中，探針的RNA核酸序列與包含多態(tài)性的靶DNA序列的選擇區(qū)域完全互補(bǔ)，探針的DNA核酸序列與和靶DNA序列的選擇區(qū)域相鄰的DNA序列基本上互補(bǔ)； c)擴(kuò)增聚合酶活性、擴(kuò)增緩沖液和RNA酶H活性。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，探針的RNA核酸序列包含與在靶DNA中的多態(tài)性互補(bǔ)的序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，多態(tài)性是單核苷酸多態(tài)性。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，探針的DNA序列和RNA序列是共價(jià)連接的。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，探針上的可檢測(cè)標(biāo)簽是熒光標(biāo)簽。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中，熒光標(biāo)簽包含熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，探針或PCR片段連接到固體載體。
28.一種用于靶DNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含: a)能夠退火到靶DNA的擴(kuò)增引物對(duì)，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的上游退火，第二擴(kuò)增引物在多態(tài)性的位置的下游退火； b)探針，包含可檢測(cè)的標(biāo)簽以及DNA和RNA核酸序列，其中，探針的RNA核酸序列與在多態(tài)性的位置處包含野生型DNA序列的靶DNA序列的選擇區(qū)域完全互補(bǔ)，探針的DNA核酸序列與和靶DNA序列的選擇區(qū)域相鄰的DNA序列基本上互補(bǔ)； c)擴(kuò)增聚合酶活性、擴(kuò)增緩沖液和RNA酶H活性。
29.一種用于靶RNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含: a)能夠退火到靶RNA的cDNA的擴(kuò)增引物對(duì)，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性序列的位置的上游退火，第二擴(kuò)增引物在多態(tài)性序列的位置的下游退火； b)探針，包含可檢測(cè)的標(biāo)簽以及DNA和RNA核酸序列，其中，探針的RNA核酸序列與包含多態(tài)性的cDNA的選擇區(qū)域完全互補(bǔ)，探針的DNA核酸序列與和cDNA的選擇區(qū)域相鄰的DNA序列基本上互補(bǔ)；以及 c)反轉(zhuǎn)錄酶活性、擴(kuò)增聚合酶活性、反轉(zhuǎn)錄PCR緩沖液和RNA酶H活性。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中，探針的RNA核酸序列包含與在靶RNA中的多態(tài)性的位置處的cDNA互補(bǔ)的序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中，多態(tài)性是單核苷酸多態(tài)性。
32.根據(jù)權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中，探針的DNA序列和RNA序列是共價(jià)連接的。
33.根據(jù)權(quán)利要求28所述的試劑盒，其中，探針上的可檢測(cè)標(biāo)簽是熒光標(biāo)簽。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中，熒光標(biāo)簽包含熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)。
35.根據(jù)權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中，探針或逆轉(zhuǎn)錄PCR片段連接到固體載體。
36.根據(jù)權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中，在相同的分子上發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶活性和擴(kuò)增聚合酶活性。
37.一種用于 靶RNA中的多態(tài)性的實(shí)時(shí)檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包括: a)能夠退火到靶RNA的cDNA的擴(kuò)增引物對(duì)，其中，第一擴(kuò)增引物在多態(tài)性序列的位置的上游退火，第二擴(kuò)增引物在多態(tài)性序列的位置的下游退火； b)探針，包含可檢測(cè)的標(biāo)簽以及DNA和RNA核酸序列，其中，探針的RNA核酸序列與在多態(tài)性的位置包含野生型DNA序列的cDNA的選擇區(qū)域完全互補(bǔ)，探針的DNA核酸序列與和cDNA的選擇區(qū)域相鄰的DNA序列基本上互補(bǔ)；以及 c)反轉(zhuǎn)錄酶活性、擴(kuò)增聚合酶活性、反轉(zhuǎn)錄PCR緩沖液和RNA酶H活性。
全文摘要
公開(kāi)了用于實(shí)時(shí)PCR中的多態(tài)性檢測(cè)的方法和試劑盒。使用PCR引物執(zhí)行對(duì)靶核酸序列的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，其中，引物退火到與目標(biāo)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)側(cè)接的序列。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)包括標(biāo)記的探針，標(biāo)記的探針包括被設(shè)計(jì)為退火到在SNP位置處的DNA序列的RNA序列。然后，可以在PCR片段中的SNP和與SNP互補(bǔ)的探針的RNA序列之間形成RNA:DNA異源雙鏈體。RNA酶H對(duì)RNA:DNA異源雙鏈中的RNA序列的切割導(dǎo)致由標(biāo)簽產(chǎn)生的信號(hào)的強(qiáng)度的增加，這表明在靶核酸中存在SNP。
文檔編號(hào)G06F19/22GK103154271SQ201180048810
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月4日
發(fā)明者詹森·歐普迪克, 約翰·哈爾威 申請(qǐng)人:三星泰科威株式會(huì)社