本發(fā)明涉及一種中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種中藥復(fù)方配伍規(guī)律的研究方法。

背景技術(shù)：

新生化顆粒來源于清代傅青山的婦科名著《傅青主女科》的“生化湯”，由當(dāng)歸、益母草、川芎、桃仁、紅花、干姜(碳)、甘草(炙)七味中藥組成，歷來被稱為“產(chǎn)后第一方”。當(dāng)歸補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛，為方中君藥；川芎活血行氣、祛風(fēng)止痛，桃仁活血化瘀，共為臣藥；炮姜走血分、溫中散寒，為佐藥；炙甘草調(diào)和諸藥，為使藥。新生化顆粒在此基礎(chǔ)上，加入益母草和紅花后，大大加強(qiáng)了原“生化湯”活血祛瘀的作用，共奏溫經(jīng)活血，化瘀生新，調(diào)經(jīng)止痛功效。臨床上，當(dāng)歸常與其它許多藥味配伍使用，體現(xiàn)出良好的協(xié)調(diào)或制約作用，從而產(chǎn)生了一系列與當(dāng)歸相關(guān)的藥對(duì)[4]。在新生化顆粒中，君藥當(dāng)歸分別與其它六味藥都能形成藥對(duì)，可能對(duì)新生化顆粒的療效發(fā)揮了重要的作用。課題組前期對(duì)當(dāng)歸-川芎、當(dāng)歸-紅花藥對(duì)的配伍均有研究，發(fā)現(xiàn)其在活血、養(yǎng)血等方面皆具有協(xié)同增效的作用。然而，當(dāng)歸系列不同藥對(duì)在新生化顆粒中具體的作用貢獻(xiàn)大小仍不得而知，從而制約了該方的進(jìn)一步發(fā)展。近年來，整方研究和拆方研究策略已經(jīng)被廣泛用于中藥復(fù)方配伍研究中。整方研究即將復(fù)方視為整體后進(jìn)行化學(xué)分析和藥理學(xué)研究，盡管能夠反映其藥效和臨床應(yīng)用的相關(guān)程度，然而由于復(fù)方組成的復(fù)雜性，該方法難以解釋其真正的藥效物質(zhì)。而拆方研究對(duì)于闡明經(jīng)方配伍的科學(xué)性、確定方中的主要藥效物質(zhì)和新藥的研制都有一定的指導(dǎo)作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種多指標(biāo)綜合指數(shù)法進(jìn)行效應(yīng)整合與比較分析，結(jié)合主成分分析法，研究當(dāng)歸系列藥對(duì)在新生化顆粒中的活血作用貢獻(xiàn)大小，從藥對(duì)層面揭示新生化顆粒配伍作用規(guī)律，從而促進(jìn)該方在中醫(yī)臨床更有效地應(yīng)用，并為中藥配伍藥物相互作用現(xiàn)代基礎(chǔ)研究提供思路與方法。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為：

1、一種中藥復(fù)方配伍規(guī)律的研究方法，其特征在于，結(jié)合主成分分析法和多指標(biāo)綜合指數(shù)法綜合評(píng)價(jià)中藥復(fù)方中藥對(duì)或單味藥對(duì)中藥復(fù)方臨床功效的貢獻(xiàn)作用。

2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥復(fù)雜成分配伍相互作用研究方法，其特征在于，所述的主成分分析法為：將中藥復(fù)方功效檢測(cè)指標(biāo)的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Waters公司的MassLynx v4.1軟件的EZ info中，通過降維矩陣建立包含兩個(gè)主成分軸t[1]和t[2]的平面空間的PCA分類模型；主成分軸t[1]是源數(shù)據(jù)矩陣方差最大方向，主成分軸t[2]是方差的次大方向，降維過程中，最大限度保留有用信息，尋找能夠使不同組別指標(biāo)得到最大分離的方向；并以離正常組或模型組的中心距離來判斷活性大小，離正常組越近說明活性越好；離模型組越近說明活性差。

3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥復(fù)雜成分配伍相互作用研究方法，其特征在于，所述的多指標(biāo)綜合指數(shù)法為：將各組大鼠的所有指標(biāo)導(dǎo)入Waters公司的Mass Lynx v4.1軟件的EZ info中，采用偏最小二乘法分析每個(gè)指標(biāo)的VIP值，VIP值越大，說明在該指標(biāo)對(duì)分類的貢獻(xiàn)越大。

4、當(dāng)歸系列藥對(duì)在新生化顆粒中的作用貢獻(xiàn)研究方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)大鼠血瘀模型的復(fù)制：除空白組外，模型組和各給藥組的大鼠分別于大鼠皮下注射鹽酸腎上腺素注射液，劑量均為0.8mg·kg^-1，共兩次，兩次間隔時(shí)間4h；大鼠第一次皮下注射鹽酸腎上腺素2h后，將其置于0～2℃的冰水中游泳4～6min，復(fù)制大鼠急性血瘀模型；最后一次皮下注射鹽酸腎上腺素后，所有組的大鼠均禁食不禁水，12h后頸總動(dòng)脈采血測(cè)全血黏度、血漿黏度、血沉和紅細(xì)胞壓積、血小板最大聚集率、凝血酶時(shí)間、凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間和血漿纖維蛋白原含量為指標(biāo)；

(2)分組與給藥：大鼠飼養(yǎng)10天后，將110只大鼠隨機(jī)分為11組，每組10只，分別為正常組、模型組、復(fù)方丹參滴丸陽性藥組、生化湯組、新生化顆粒組和新生化顆粒缺失各當(dāng)歸系列藥對(duì)的樣品組，包括新生化顆粒缺失當(dāng)歸-益母草、新生化顆粒缺失當(dāng)歸-川芎、新生化顆粒缺失當(dāng)歸-桃仁、新生化顆粒缺失當(dāng)歸-紅花、新生化顆粒缺失當(dāng)歸-姜炭和新生化顆粒缺失當(dāng)歸-炙甘草；陽性藥組灌胃給予復(fù)方丹參滴丸，灌胃劑量為0.10g·kg^-1；正常組與模型組大鼠給予等容積生理鹽水；新生化顆粒組和新生化顆粒缺失各當(dāng)歸系列藥對(duì)的樣品組按4.86g·kg^-1的劑量灌胃給藥；

(3)血液流變學(xué)和凝血功能指標(biāo)檢測(cè)：各組大鼠均于末次給藥30min后，在10％水合氯醛麻醉下，頸總動(dòng)脈插管取血，以枸櫞酸鈉1:9抗凝；吸取1mL全血置于壓積管中，靜置1h記錄血沉；然后3000r·min^-1離心30min，記錄紅細(xì)胞壓積；取全血800μL采用LG-R-80B電腦血液粘度測(cè)定儀測(cè)定各切變率下的全血粘度；余下的全血，先800r·min^-1離心10min吸取富血小板血漿，然后3000r·min^-1離心10min吸取貧血小板血漿；血小板聚集率的測(cè)定采用PRP，凝血四項(xiàng)APTT/s、PT/s、TT/s和FIB/g·L^-1的指標(biāo)采用PPP，儀器均為L(zhǎng)G-PABER-1型血小板聚集凝血因子分析儀；

(3)采用多指標(biāo)綜合指數(shù)法，對(duì)全血黏度、血漿黏度、血沉和紅細(xì)胞壓積、血小板最大聚集率、凝血酶時(shí)間、凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間和血漿纖維蛋白原含量多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行單一化處理，計(jì)算各給藥組總的活血效應(yīng)值；首先，對(duì)各個(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)化，相比于模型組，若正常組的各指標(biāo)值(Value)升高，則V_{標(biāo)化}＝(V_給藥-V_模型)/V_模型；若正常組的指標(biāo)值降低，則V_{標(biāo)化}＝(V_模型-V_給藥)/V_模型；結(jié)合變量重要性投影值(variable importance in the projection,VIP)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合給出各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，總活血效應(yīng)值等于各個(gè)指標(biāo)的標(biāo)化值乘以相應(yīng)權(quán)重的加和值。各指標(biāo)VIP值的計(jì)算如下：首先將每組大鼠的所有指標(biāo)導(dǎo)入Waters公司的MassLynx v4.1軟件的EZ info中，采用主成分分析法中的Pareto處理得到各組活血療效的得分圖；然后采用偏最小二乘法(分析得到各指標(biāo)的VIP值；根據(jù)VIP值的大小判斷各個(gè)指標(biāo)的相對(duì)重要程度，若VIP>1，則一般認(rèn)為該指標(biāo)的貢獻(xiàn)比較大；最終各指標(biāo)取權(quán)重系數(shù)如下：活化部分凝血活酶時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間、血小板最大聚集率、凝血酶原時(shí)間和血沉的權(quán)重系數(shù)為1；血漿纖維蛋白原含量的權(quán)重系數(shù)為2，全血黏度、血漿黏度和紅細(xì)胞壓積的權(quán)重系數(shù)為3；采用多指標(biāo)綜合指數(shù)法中的總活血化瘀效應(yīng)值與主成分分析法的得分圖綜合評(píng)價(jià)當(dāng)歸系列藥對(duì)在新生化顆粒中的活血效應(yīng)貢獻(xiàn)；

所述的主成分分析法為：將中藥復(fù)方功效檢測(cè)指標(biāo)的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Waters公司的MassLynx v4.1軟件的EZ info中，通過降維矩陣建立包含兩個(gè)主成分軸t[1]和t[2]的平面空間的PCA分類模型；主成分軸t[1]是源數(shù)據(jù)矩陣方差最大方向，主成分軸t[2]是方差的次大方向，降維過程中，最大限度保留有用信息，尋找能夠使不同組別指標(biāo)得到最大分離的方向；并以離正常組或模型組的中心距離來判斷活性大小，離正常組越近說明活性越好；離模型組越近說明活性差。

有益效果：本發(fā)明提供的中藥復(fù)方配伍規(guī)律的研究方法和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供的中藥復(fù)方配伍規(guī)律的研究方法，具有可操作性強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明可以從藥對(duì)角度揭示新生化顆粒的配伍效應(yīng)，為新生化顆粒在臨床中更好的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，也為復(fù)雜方劑的配伍作用研究提供了較好的方法參考。

附圖說明

圖1為新生化顆粒缺失當(dāng)歸系列藥對(duì)前后活血化瘀藥效的PCA圖。

圖2為血瘀各指標(biāo)的VIP圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等價(jià)形式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所限定的范圍。

實(shí)施例1

1材料

1.1動(dòng)物 SD大鼠，110只，雌性，SPF級(jí)，體重230～250g，購(gòu)于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)為SCKY(滬)2013-0004。大鼠購(gòu)入后檢疫與馴化1周，使其適應(yīng)環(huán)境并剔除體質(zhì)差異較大的動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，晝夜節(jié)律正常。

1.2試劑 鹽酸腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)：150609)；復(fù)方丹參滴丸(天士力制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：151227)；氯化鈉(國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司，批號(hào)：150928)；水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司，批號(hào)：20160109)；檸檬酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司，批號(hào)：20151105)。

1.3儀器 LG-PABER-1型血小板聚集凝血因子分析儀(北京世帝科學(xué)儀器公司)；LG-R-80-B電腦血液黏度測(cè)試儀(北京世帝科學(xué)儀器公司)；YRE-301型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有效責(zé)任公司)；超純水儀(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)；電子分析天平(BT125D，sartorius，德國(guó))；Anke LXJ-II B離心機(jī)。

1.4樣品制備 當(dāng)歸(產(chǎn)地：甘肅岷縣，批號(hào)：151021)、益母草(產(chǎn)地：廣東汕頭，批號(hào)150916)、川芎(產(chǎn)地：四川彭州，批號(hào)：151018)、桃仁(產(chǎn)地：安徽亳州，批號(hào)：150906)、紅花(產(chǎn)地：新疆，批號(hào)：140816)、姜炭(產(chǎn)地：山東安丘，批號(hào)：160108)、炙甘草(產(chǎn)地：內(nèi)蒙古，批號(hào)：151108)，藥材均由江蘇省仁壽藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝老師鑒定，符合《中國(guó)藥典》(2015年版)項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。

新生化顆粒提取物的制備：稱取當(dāng)歸、益母草、川芎、桃仁、紅花、炙甘草和姜炭的混合藥材共699g，七味藥材的比例依次為80:100:30:8:5:5:5。用8倍量水熱回流提取3次，第一次2h，后兩次各1.5h(模擬臨床上新生化顆粒的制備)。自然冷卻后，傾出藥液，過濾藥渣，合并3次水提液，得到新生化顆粒的水提物。將新生化顆粒水提液于60℃下減壓濃縮，得到新生化顆粒提取物(XSHG)樣品。

新生化顆粒缺失各當(dāng)歸系列藥對(duì)的樣品制備：從全方中分別減掉當(dāng)歸-益母草、當(dāng)歸-川芎、當(dāng)歸-桃仁、當(dāng)歸-紅花、當(dāng)歸-姜炭、當(dāng)歸-炙甘草，其它五味藥的比例皆與原方相同。用8倍量水提取3次，分別用時(shí)2h、1.5h和1.5h，合并3次水提液，分別得缺失各當(dāng)歸系列藥對(duì)的新生化顆粒樣品的提取物。將各樣品的水提液分別于60℃下減壓濃縮，分別得到DY(缺失當(dāng)歸-益母草)、DC(缺失當(dāng)歸-川芎)、DT(缺失當(dāng)歸-桃仁)、DH(缺失當(dāng)歸-紅花)、DJ(缺失當(dāng)歸-姜炭)和DZ(缺失當(dāng)歸-炙甘草)提取物。

生化湯提取物品的制備：按照當(dāng)歸-川芎-桃仁-姜炭-炙甘草24:9:6:2:2配比，稱取生化湯組方藥材共430g。用8倍量水提取3次，用時(shí)依次為2h、1.5h和1.5h，合并3次水提液，將生化湯樣品的水提液于60℃下減壓濃縮，則得到生化湯(SHD)提取物。以上所有樣品均4℃冷藏備用。

2方法

2.1大鼠血瘀模型的復(fù)制 除空白組外，模型組和各給藥組的大鼠分別于大鼠皮下注射鹽酸腎上腺素注射液，劑量均為0.8mg·kg^-1，共兩次，兩次間隔時(shí)間4h。大鼠第一次皮下注射鹽酸腎上腺素2h后，將其置于0～2℃的冰水中游泳4min，復(fù)制大鼠急性血瘀模型。最后一次皮下注射鹽酸腎上腺素后，所有組的大鼠均禁食不禁水，12h后頸總動(dòng)脈采血測(cè)血液流變學(xué)和凝血功能的相關(guān)指標(biāo)。

2.2分組與給藥 大鼠飼養(yǎng)10天后，將110只大鼠隨機(jī)分為11組，每組10只，分別為正常組(K)、模型組(M)、復(fù)方丹參滴丸陽性藥組(DSDW)、生化湯組(XSD)、新生化顆粒組(XSHG)和新生化顆粒缺失各當(dāng)歸系列藥對(duì)的樣品組(DY、DC、DT、DH、DZ和DJ)。陽性藥組灌胃給予復(fù)方丹參滴丸，灌胃劑量為0.10g·kg^-1；正常組與模型組大鼠給予等容積生理鹽水；XSHG給藥組(通常，新生化顆粒的臨床用量為36g，本實(shí)驗(yàn)依此為基準(zhǔn)，設(shè)定新生化顆粒的臨床1倍量，總量為36g)，XSHG組按新生化顆粒的臨床1倍量，繼而通過人與大鼠體表面換算公式計(jì)算大鼠的灌胃劑量，即以4.86g·kg^-1的劑量灌胃給藥?？紤]到其它因素的影響，其它各給藥組(SHD、DY、DC、DT、DH、DZ和DJ)的給藥劑量均與XSHG給藥組相同，以評(píng)價(jià)當(dāng)歸系列藥對(duì)在新生化顆粒中的作用貢獻(xiàn)。所有大鼠均統(tǒng)一灌胃1mL·100g·次^-1，每日早晚各1次，共7次。于第5次給藥后除正常組外，其余各組大鼠均按照相應(yīng)的造模方法復(fù)制急性血瘀模型。各組大鼠第7次給藥30min后頸總動(dòng)脈取血，及時(shí)測(cè)定血液流變學(xué)和凝血功能相關(guān)指標(biāo)。給藥劑量按照動(dòng)物體表面換算系數(shù)計(jì)算：人臨床用量×0.018/200×1000×臨床等效量的倍數(shù)。

2.3血液流變學(xué)和凝血功能指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠均于末次給藥30min后，在10％水合氯醛麻醉下，頸總動(dòng)脈插管取血，以枸櫞酸鈉(3.8％)1:9抗凝。吸取1mL全血置于壓積管中，靜置1h記錄血沉(ESR)。然后3000r·min^-1離心30min，記錄紅細(xì)胞壓積(HCT)。取全血800μL采用LG-R-80B電腦血液粘度測(cè)定儀測(cè)定各切變率下的全血粘度(WBV)。余下的全血，先800r·min^-1離心10min吸取富血小板血漿(PRP)，然后3000r·min^-1離心10min吸取貧血小板血漿(PPP)。血小板聚集率(ADP/％)的測(cè)定采用PRP，凝血四項(xiàng)(APTT/s、PT/s、TT/s和FIB/g·L^-1)的指標(biāo)采用PPP，儀器均為L(zhǎng)G-PABER-1型血小板聚集凝血因子分析儀。血漿PT、TT、APTT和FIB的測(cè)定按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件中的Descriptives進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；與空白組和模型組的比較，采用ANOVA中的Dunnett法進(jìn)行組間兩兩比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5效應(yīng)整合 采用多指標(biāo)綜合指數(shù)法，對(duì)PV、WBV、HCT、ESR、APTT、TT、PT、FIB和ADP多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行單一化處理，計(jì)算各給藥組總的活血效應(yīng)值。首先，對(duì)各個(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)化^[12]。相比于模型組，若正常組的各指標(biāo)值(Value)升高，則V_{標(biāo)化}＝(V_給藥-V_模型)/V_模型；若正常組的指標(biāo)值降低，則V_{標(biāo)化}＝(V_模型-V_給藥)/V_模型。標(biāo)化指標(biāo)權(quán)重的確定首先根據(jù)各指標(biāo)在臨床中的重要性，賦予各指標(biāo)以相應(yīng)的權(quán)重。結(jié)合變量重要性投影值(variable importance in theprojection,VIP)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合給出各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，總活血效應(yīng)值等于各個(gè)指標(biāo)的標(biāo)化值乘以相應(yīng)權(quán)重的加和值。各指標(biāo)VIP值的計(jì)算如下：首先將每組大鼠的所有指標(biāo)導(dǎo)入MassLynx v4.1(Waters公司)軟件的EZ info中，采用主成分分析法(principal componentsanalysis,PCA)中的Pareto處理得到各組活血療效的得分圖；然后采用偏最小二乘法(partial least squares method,PLS)分析得到各指標(biāo)的VIP值。根據(jù)VIP值的大小判斷各個(gè)指標(biāo)的相對(duì)重要程度，若VIP>1，則一般認(rèn)為該指標(biāo)的貢獻(xiàn)比較大^[12-13]。最終各指標(biāo)取權(quán)重系數(shù)如下：APTT、TT、ADP、PT和ESR的權(quán)重系數(shù)為1；FIB的權(quán)重系數(shù)為2，PV、WBV和HCT的權(quán)重系數(shù)為3。采用多指標(biāo)綜合指數(shù)法中的總活血化瘀效應(yīng)值與主成分分析法的得分圖綜合評(píng)價(jià)當(dāng)歸系列藥對(duì)在新生化顆粒中的活血效應(yīng)貢獻(xiàn)。

3.1新生化顆粒缺失當(dāng)歸系列藥對(duì)前后對(duì)急性血瘀大鼠全血黏度和血漿黏度的影響 不同給藥組的全血黏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，新生化顆粒缺失當(dāng)歸系列藥對(duì)前后對(duì)血漿粘度的結(jié)果表明：與正常組相比，模型組的WBV和PV均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。相比于模型組，各給藥組的PV和WBV均有不同程度的降低；其中，陽性藥組(DSDW)于不同切變率下的WBV和PV較模型組均顯著降低(P<0.01)。WBV中，DY組和DC組在不同切變率下的全血黏度均無顯著性差異；DH組在切變率為30s^-1和1s^-1時(shí)的黏度有顯著性差異(P<0.05)；其它各給藥組在不同切變率下的全血黏度均顯著降低(P<0.05)。PV中，除了DY給藥組外，其他各給藥組的差異較模型組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與XSHG組比較，DSDW組在不同切變率下的WBV和PV均無顯著性差異，表明XSHG組與DSDW組在血液流變學(xué)方面具有相似的療效；DY組和DC組在各切變率下的全血黏度均有顯著性差異(P<0.05)；DH組除了切變率30s^-1下沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其余切變率下的全血黏度顯著升高(P<0.05)；SHD組和DZ組在切變率1s^-1的WBV均較XSHG組明顯升高(P<0.05)；DY組和DH組PV均顯著升高(P<0.01)。

3.2新生化顆粒樣品缺失當(dāng)歸系列藥對(duì)前后對(duì)急性血瘀大鼠ESR和HCT的影響 各給藥組的ESR和HCT結(jié)果表明：與正常組比較，模型組的ESR、HCT均有明顯升高，兩者差異皆具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，DSDW組的ESR和HCT顯著性降低(P<0.01)；各給藥組的ESR和HCT均有不同程度的降低；各給藥組的ESR均明顯降低(P<0.01)；除了DC和DT組外，其它各給藥組的HCT顯著降低(P<0.05)。與XSHG組比較，DSDW組的ESR和HCT有所升高，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DY、DH和DZ組的ESR明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DY、DC和DH組的HCT均顯著升高(P<0.05)。

表1新生化顆粒缺失當(dāng)歸系列藥對(duì)前后對(duì)急性血瘀大鼠WBV的影響(n＝10)

注：與空白組比較¹⁾P<0.05，²⁾P<0.01；與模型組比較³⁾P<0.05，⁴⁾P<0.01；與XSHG組比較⁵⁾P<0.05，⁶⁾P<0.01。

3.3新生化顆粒缺失當(dāng)歸系列藥對(duì)前后對(duì)急性血瘀大鼠凝血功能和血小板聚集的影響 各給藥組對(duì)急性血瘀大鼠的凝血功能和血小板聚集功能的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與正常組相比，模型組的凝血功能指標(biāo)(TT、APTT、PT和FIB)和ADP均有顯著性差異(P<0.01)，其中TT、APTT、PT和ADP均明顯降低，F(xiàn)IB和ADP含量顯著升高。與模型組相比，DSDW組和XSHG組對(duì)急性血瘀大鼠的凝血四項(xiàng)和ADP有明顯的改善作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SHD組的TT、PT和ADP均有明顯的改善作用(P<0.05)；DY組TT顯著延長(zhǎng)(P<0.01)；DC組的相關(guān)指標(biāo)均無明顯改善作用；DT組和DH組的APTT均明顯增加，ADP均顯著降低，差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DJ組和DZ組的TT、PT和APTT均顯著延長(zhǎng)，ADP含量均顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，新生化顆粒缺失當(dāng)歸系列藥對(duì)后的各給藥組對(duì)急性血瘀大鼠的FIB指標(biāo)均無明顯的改善作用。與XSHG組比較，TT中，除了DY組外，其它各給藥組均顯著縮短(P<0.05)；PT中，SHD、DY和DC組明顯縮短(P<0.05)；APTT中，DY、DC和DH組均顯著縮短(P<0.05)；FIB中，除DT組外，其它各給藥組均明顯升高(P<0.01)；ADP中，DY、DC和DH組均顯著升高(P<0.05)。此外，DSDW組的TT、APTT和FIB較XSHG組均有所降低，PT和ADP有所升高，但皆無顯著性差異。

3.4基于主成分分析法的當(dāng)歸系列藥對(duì)的活血化瘀效應(yīng)評(píng)價(jià) 將所有血瘀相關(guān)指標(biāo)的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入MassLynx v4.1軟件(Waters公司)的EZ info中，通過降維矩陣建立包含兩個(gè)主成分軸t[1]和t[2]的平面空間的PCA分類模型(圖1)。主成分軸t[1]是源數(shù)據(jù)矩陣方差最大方向，主成分軸t[2]是方差的次大方向，降維過程中，最大限度保留有用信息，尋找能夠使不同組別指標(biāo)得到最大分離的方向。從圖1中可以看出，正常組的中心大約是(6，-0.5)，模型組的中心大約是(-5.5，1)，復(fù)方丹參滴丸組的中心大約是(2，-0.5)，新生化顆粒組的中心大約是(2.5，0.5)，生化湯組的中心約在(1，-0.25)，新生化顆粒缺失當(dāng)歸系列藥對(duì)的DY、DC、DT、DH、DJ和DZ樣品組的中心依次大約是(-3.5，1)、(-4.5，-1)、(1，-1.5)、(-1.5，-1)、(0.5，0)、(0，1)。模型組的中心離正常組的中心最遠(yuǎn)，說明血瘀模型造模成功；DSDW組離空白組較近，表明DSDW對(duì)急性血瘀大鼠的改善作用較好；較其它拆方組，新生化顆粒組距離空白組最近且離陽性藥DSDW組較近，說明新生化顆粒組的活血化瘀效應(yīng)最好，在活血化瘀方面具有與復(fù)方丹參滴丸相似的治療效果；DJ組、DT組和生化湯組位于正常組和模型組中間位置，表明它們對(duì)急性血瘀大鼠的改善作用弱于新生化顆粒組；DY、DC和DH組距離模型組較近，表明DY、DC和DH組的改善作用較差；其中DY組距離模型組最近，說明DY組隊(duì)急性血瘀大鼠的改善作用最差。

3.5基于多指標(biāo)綜合指數(shù)法的當(dāng)歸系列藥對(duì)的活血化瘀效應(yīng)整合 將各組大鼠的所有指標(biāo)導(dǎo)入Mass Lynx v4.1(Waters公司)軟件的EZ info中，采用偏最小二乘法(PLS-DA)分析每個(gè)指標(biāo)的VIP值，VIP值越大，說明在該指標(biāo)對(duì)分類的貢獻(xiàn)越大。如圖2所示，WBV200、WBV30、WBV5、HCT、FIB、TT、APTT、ADP和ESR的VIP值均較大，PT和WBV1的數(shù)值較小。依據(jù)本課題組前期的多指標(biāo)綜合指數(shù)法對(duì)WBV200、WBV30、WBV5、WBV1、PV、HCT、FIB、TT、PT、APTT、ADP和ESR各指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理，得到各組的總活血化瘀效應(yīng)值(表2)，結(jié)果表明新生化顆粒較生化湯的活血效應(yīng)好，缺失當(dāng)歸系列藥對(duì)后，各樣品總的活血效應(yīng)值均有一定程度的減少。新生化顆粒缺失各當(dāng)歸系列的總活血效應(yīng)值的大小順序依次為：DJ>DT>DZ>DH>DC>DY，這說明DJ和DT給藥組的總活血效應(yīng)最好。這些研究結(jié)果表明，生化湯中增加益母草和紅花兩味藥后(新生化顆粒)，大大加強(qiáng)生化湯的活血化瘀療效；而新生化顆粒中缺失當(dāng)歸系列藥對(duì)后，原方的活血化瘀療效均有不同程度的降低，尤其是缺失當(dāng)歸-益母草藥對(duì)后，活血化瘀效應(yīng)大大減弱，側(cè)面說明當(dāng)歸-益母草藥對(duì)在新生化顆粒中的活血化瘀的作用貢獻(xiàn)最大。

3.6結(jié)合主成分分析法和多指標(biāo)綜合指數(shù)法綜合評(píng)價(jià)當(dāng)歸系列藥對(duì)在新生化顆粒中的活血作用貢獻(xiàn) 綜合多指標(biāo)綜合指數(shù)法和主成分分析法中的總活血化瘀效應(yīng)結(jié)果可得，樣品DY和DC的總活血效應(yīng)最差，樣品DJ和DT的總活血效應(yīng)最好，兩種分析方法所得結(jié)果相一致。當(dāng)歸系列藥對(duì)在新生化顆粒中的活血作用貢獻(xiàn)的順序?yàn)椋寒?dāng)歸-益母草>當(dāng)歸-川芎>當(dāng)歸-紅花>當(dāng)歸-炙甘草>當(dāng)歸-桃仁>當(dāng)歸-姜炭。其中，藥對(duì)當(dāng)歸-益母草在全方中的活血作用貢獻(xiàn)度最大，與新生化顆粒的組方結(jié)構(gòu)(重用益母草)以及益母草“活血行滯、祛瘀生新”的功效相一致。

表2各給藥組對(duì)血瘀大鼠的總活血化瘀效應(yīng)值

本發(fā)明通過多指標(biāo)綜合指數(shù)法結(jié)合PCA對(duì)急性血瘀大鼠的血液流變學(xué)和凝血功能指標(biāo)進(jìn)行了效應(yīng)整合。結(jié)果顯示，新生化顆粒和生化湯樣品均能一定程度改善急性血瘀大鼠的血液流變學(xué)及凝血功能相關(guān)指標(biāo)，新生化顆粒的活血效應(yīng)明顯優(yōu)于生化湯，說明生化湯中加入益母草和紅花兩味藥組成新生化顆粒后，可明顯增加原生化湯的活血效應(yīng)。在新生化顆粒中，缺失不同的當(dāng)歸系列藥對(duì)后對(duì)原方的活血效應(yīng)有不同程度的影響，缺失藥對(duì)當(dāng)歸-益母草和當(dāng)歸-川芎后，原方的活血效應(yīng)大大減弱。益母草有活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫的作用，川芎有活血行氣的作用，兩者與當(dāng)歸配伍組成相應(yīng)藥對(duì)后，在活血方面會(huì)產(chǎn)生協(xié)同增效的作用，這與本次實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果具有一致性。本發(fā)明的研究結(jié)果有利于從藥對(duì)角度揭示新生化顆粒的配伍效應(yīng)，為新生化顆粒在臨床中更好的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，也可為復(fù)雜方劑的配伍作用研究提供重要的方法參考。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。