專利名稱：一種細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微全分析技術(shù)，特別提供了一種細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片。
微全分析技術(shù)是20世紀(jì)90年代提出的一種全新的概念，可分為芯片式與非芯片式兩大類，目前芯片式是發(fā)展的重點(diǎn)，其中依據(jù)芯片結(jié)構(gòu)及工作原理又可分為微陣列生物芯片，以及微流控芯片。微陣列生物芯片主要以生物技術(shù)為基礎(chǔ)，以親和結(jié)合技術(shù)為核心，以在芯片表面固定一系列可尋址的識別分子陣列為結(jié)構(gòu)特征，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)深度產(chǎn)業(yè)化。微流控芯片則主要以分析化學(xué)和分析生物化學(xué)為基礎(chǔ)，以微機(jī)電加工技術(shù)為依托，以微管道網(wǎng)絡(luò)為結(jié)構(gòu)特征，是當(dāng)前微全分析技術(shù)發(fā)展的重點(diǎn)。目前芯片點(diǎn)陣已經(jīng)可以接受各種無菌處理，各種必須的細(xì)胞外基質(zhì)也可以包被在芯片的表面。這為細(xì)胞的活體分析提供了基礎(chǔ)，同時完全可以在芯片點(diǎn)陣上建立與普通細(xì)胞培養(yǎng)相同的環(huán)境，從而細(xì)胞可以在點(diǎn)陣中存活、生長、繁殖。另外可以根據(jù)研究的目的，改變細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境在培養(yǎng)液中加入化學(xué)物質(zhì)，以考察這種物質(zhì)對細(xì)胞生長的影響；改變培養(yǎng)點(diǎn)陣的物理空間結(jié)構(gòu)，考察特定細(xì)胞的空間誘導(dǎo)下生長變化；改變細(xì)胞培養(yǎng)的溫度、濕度、培養(yǎng)液的組成，以優(yōu)化細(xì)胞的培養(yǎng)。這些都為選擇性的細(xì)胞培養(yǎng)提供了可能。
同時各種生化過程也可以集成在微芯片上。芯片上的鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)，已經(jīng)取得成功，可以采用非接觸是熱循環(huán)方式利用凸鏡將紅外光源聚焦于芯片上的鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)液上，熱偶可以檢測溫度反饋給加熱源和散熱部件，從而精確控制反應(yīng)的溫度。也可以采用接觸式的熱循環(huán)方式接觸的電阻加熱片取代凸鏡聚焦紅外光源，其他部件基本相似。痕量核酸樣品的鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)與高分子溶液的電泳篩分已經(jīng)可以集成在一個芯片上。甚至將細(xì)胞破碎、鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)、電泳篩分集成在一塊芯片也已實(shí)現(xiàn)。
另外基于硅凝膠的固相萃取反應(yīng)也已經(jīng)在微流通道上實(shí)現(xiàn)。作為固相萃取的凝膠可以有多種選擇可以將硅球微顆粒直接灌入柱內(nèi)；也可以用有機(jī)硅烷直接合成首先將一些有機(jī)硅烷用水、酸在加熱的條件下制成溶液，灌入微流通道后，再用堿催化制成凝膠。當(dāng)核酸分子在壓力或電滲的帶動下通過凝膠時就被吸附，然后用洗脫液洗脫。
但是，到目前為止，將微陣列生物芯片和微流控芯片相結(jié)合應(yīng)用到細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的研究尚未見報(bào)道。
本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片，它可以在一塊芯片上實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，細(xì)胞的收集，細(xì)胞的裂解，核酸的提取、純化、擴(kuò)增、電泳分析，或蛋白的提取、純化、電泳分析，從而大大節(jié)省分析時間和分析成本。
本發(fā)明提供了一種細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片，其特征在于該芯片由細(xì)胞培養(yǎng)單元和分離單元構(gòu)成，細(xì)胞培養(yǎng)單元為多孔點(diǎn)陣，每個孔通過微流通道與分離單元的流入端相連。
本發(fā)明細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片中，所述分離單元可以是多個基本分離單元的陣列?；痉蛛x單元可以采用十字交叉型，或者雙T型。其分離通道可以是直線、折線或者曲線。
本發(fā)明還提供了另一種細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片，其特征在于該芯片由細(xì)胞培養(yǎng)單元、固相萃取單元和分離單元構(gòu)成；細(xì)胞培養(yǎng)單元為多孔點(diǎn)陣；固相萃取單元為一段灌注硅凝膠的微通道；細(xì)胞培養(yǎng)單元的每個孔通過微流通道與固相萃取單元的流入端相連，固相萃取單元的流出端與分離單元的流入端相連。
本發(fā)明提供的第二種細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片中，所述固相萃取單元中增設(shè)一洗脫液的儲液槽，其通過微通道與流入端相連。所述分離單元可以是多個基本分離單元的陣列?；痉蛛x單元可以采用十字交叉型，或者雙T型。
其分離通道可以是直線、折線或者曲線。
本發(fā)明細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片中，所述細(xì)胞培養(yǎng)單元可以用用膠原、細(xì)胞表面纖連蛋白、層粘連蛋白，肌腱蛋白、血小板反應(yīng)蛋白和玻連蛋白、糖蛋白選擇性包被。
本發(fā)明細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片，首次將陣列生物芯片技術(shù)與微流控芯片相結(jié)合，并應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具有下述功能區(qū)域細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)芯片點(diǎn)陣，可以根據(jù)需要選擇點(diǎn)陣數(shù)，以及點(diǎn)陣的尺寸和面積。各種細(xì)胞外基質(zhì)包括膠原、細(xì)胞表面纖連蛋白、層粘連蛋白，肌腱蛋白、血小板反應(yīng)蛋白和玻連蛋白、糖蛋白都可以選擇性的包被在點(diǎn)陣內(nèi)。在需要的情況下，可以將將細(xì)胞裂解液加入點(diǎn)陣內(nèi)裂解細(xì)胞，當(dāng)然也可以用超聲、電擊穿等其他方法裂解細(xì)胞。
核酸的固相萃取將硅球微粒直接灌入固相萃取通道，或者將有機(jī)硅烷水解后的硅溶液灌入通道后，在較高的溫度或者堿催化下制成硅凝膠。細(xì)胞的裂解液在電滲或壓力的驅(qū)動下流經(jīng)硅凝膠后核酸被吸附。
核酸的鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)區(qū)一定的核酸模板、引物、和堿基在DNA聚合酶的作用下，通過溫度循環(huán)使核酸擴(kuò)增。芯片上的被硅凝膠吸附的核酸用洗脫液洗脫后可以集中到核酸擴(kuò)增區(qū)，用接觸式或非接觸式熱循環(huán)后擴(kuò)增。根據(jù)需要鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)區(qū)的大小和形狀可以任意設(shè)計(jì)。
核酸分離區(qū)分離區(qū)采用一般的十字交叉構(gòu)型或雙T構(gòu)型，核酸擴(kuò)增區(qū)現(xiàn)在即是樣品池，與之相對的是樣品廢液池，另外的兩個是緩沖池和廢液池。從交叉點(diǎn)到廢液池的通道為分離用，可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)成任意長度，采用直線或者折疊形狀。一般分離后的核酸可以用激光誘導(dǎo)熒光實(shí)現(xiàn)在線檢測。核酸的分離一般采用高分子溶液篩分模式。
蛋白分離區(qū)一般也采用十字交叉或雙T構(gòu)型，儲液池和分離通道也可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)成任意的形狀。蛋白分離過程中可以用染料動態(tài)標(biāo)記以便于激光誘導(dǎo)熒光檢測，也可以采用偶連質(zhì)譜檢測。蛋白的電泳分離模式相對較多，可以是自由區(qū)帶電泳、等電聚焦電泳、膠束電動電泳、高分子溶液篩分電泳。
本發(fā)明芯片制作的基本過程是圖案經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)后打印，制成擋板，然后在玻璃或石英上直接腐蝕成型，封接制成芯片；也可以用硅片、玻璃、石英、金屬制成模板，在各種塑料上復(fù)制出子板，然后封接成芯片。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1) 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞差異表達(dá)及基因分析集成在同一塊芯片，減少操作的成本。
(2)基于(1)，減少了傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞差異表達(dá)及基因分析過程中的污染，提高了分析的速度。
(3)基于(1)(2)，為細(xì)胞的差異表達(dá)及基因分析提供完全一致的分析環(huán)境，提高分析數(shù)據(jù)的可比較性。
另外，基于本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞蛋白和基因差異分析芯片的結(jié)構(gòu)，它至少具有以下方面的應(yīng)用(1)不同類細(xì)胞的差異表達(dá)和/或基因比較分析。
分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常會要了解生物體不同的組織部位中的蛋白表達(dá)情況，以了解組織發(fā)育的分化過程、內(nèi)在控制機(jī)制，從而可以為分子胚胎學(xué)、組織學(xué)、發(fā)育學(xué)研究提供準(zhǔn)確信息?，F(xiàn)在進(jìn)行這類實(shí)驗(yàn)需要單獨(dú)培養(yǎng)、分另提取需要的蛋白和串行凝膠電泳分析，這樣實(shí)驗(yàn)量大、操作誤差大、結(jié)果可靠性低。現(xiàn)在用細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片，可以最大限度的降低誤差，加快實(shí)驗(yàn)速度。
(2)同一種細(xì)胞的差異培養(yǎng)分析。
特定組織發(fā)育的細(xì)胞群或腫瘤組織的細(xì)胞，對特別的培養(yǎng)的體系(加入了特定的試劑)的反應(yīng)是非常重要的信息，用細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片用于細(xì)胞培養(yǎng)和差異表達(dá)分析，可以以最快的速度拿到信息。
(3)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、可疑細(xì)胞的比較分析。
現(xiàn)在的醫(yī)院里，基于免疫學(xué)做一些血清方面的檢查，以得到肌體內(nèi)蛋白表達(dá)的信息，用于疾病方面的檢測，這科方法靈敏性和特異性都很差。不可能用于腫瘤的早期診斷。而用細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片可以對很少的細(xì)胞樣品做差異分析，對比正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、可疑細(xì)胞的結(jié)果，可以很快得到準(zhǔn)確的疾病信息。
(4)基于細(xì)胞差異表達(dá)的藥物篩選。
化合物對細(xì)胞培養(yǎng)的效應(yīng)分析用于藥物篩選是一種非常有效的藥篩手段。這需要將細(xì)胞培養(yǎng)和差異表達(dá)分析集成起來、高通量快速分離?，F(xiàn)在沒有這樣的設(shè)備。細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片則可以應(yīng)用于這一領(lǐng)域。
(5)常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)、表達(dá)、基因變異分析。
很多生物學(xué)現(xiàn)象最終要在細(xì)胞層次上才能找到答案，所以常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)、表達(dá)、基因變異分析越來越成為一個普通的生物學(xué)研究手段，現(xiàn)在的培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶的單獨(dú)培養(yǎng)，再細(xì)胞破碎，蛋白或核酸提取，凝膠電泳、染色、顯象、人工定量已經(jīng)不能適應(yīng)生物學(xué)研究的需要了。細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片完全可以代替以上流程。
圖2為核酸的固相萃取與洗脫結(jié)構(gòu)示意；圖3為核酸或蛋白分離結(jié)構(gòu)示意；圖4為細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片I結(jié)構(gòu)示意；圖5為細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片II結(jié)構(gòu)示意；圖6為細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片III結(jié)構(gòu)示意；圖7為細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片IV結(jié)構(gòu)示意；圖8為細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片V結(jié)構(gòu)示意；圖9為細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片VI結(jié)構(gòu)示意。
第二部分，核酸的固相萃取與洗脫，見圖2，流入端A與所有的細(xì)胞培養(yǎng)點(diǎn)陣由微流通道相連，洗脫液的儲液槽B也與A相連。當(dāng)細(xì)胞的裂解液流出時，流出端C與蛋白的進(jìn)樣端相連。當(dāng)核酸的洗脫液流出時，流出端與核酸的鏈?zhǔn)綌U(kuò)增區(qū)相連。
第三部分，核酸或蛋白分離芯片，見圖3，可以采用十字交叉型，如A′B′，也可以采用雙T型，如C′、D′，以增大進(jìn)樣量。分離通道可以是直線的，如A′、C′，也可以是折線的，如B′、D′，以增大分離長度，提高分離度，增大峰容量。蛋白樣品的進(jìn)樣端就是細(xì)胞裂解液流經(jīng)固相萃取區(qū)后的流入端。核酸樣品的進(jìn)樣端就是核酸固相萃取經(jīng)洗脫后的流入端，同時也是核酸鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)區(qū)。
細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片可以是以上三個部分的合理組合，圖4是細(xì)胞培養(yǎng)、核酸萃取、蛋白分離的組合，圖5是細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白分離的組合，可以用于細(xì)胞的差異培養(yǎng)和細(xì)胞內(nèi)蛋白差異表達(dá)的分析。圖6是細(xì)胞培養(yǎng)、核酸萃取、核酸鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)以及核酸分離的組合。可以用于細(xì)胞的差異培養(yǎng)以及細(xì)胞內(nèi)核酸差異分析。
圖7是單孔細(xì)胞培養(yǎng)、核酸固相萃取、核酸鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)、蛋白及核酸分離的組合，可以用于一種細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)及蛋白和核酸的分析。圖8，9將單孔增加到多孔，芯片也可以是圓形或其他形狀，以方便芯片的設(shè)計(jì)。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片，其特征在于該芯片由細(xì)胞培養(yǎng)單元和分離單元構(gòu)成，細(xì)胞培養(yǎng)單元為多孔點(diǎn)陣，每個孔通過微流通道與分離單元的流入端相連。
2.一種細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片，其特征在于該芯片由細(xì)胞培養(yǎng)單元、固相萃取單元和分離單元構(gòu)成；細(xì)胞培養(yǎng)單元為多孔點(diǎn)陣；固相萃取單元為一段灌注硅凝膠的微通道；細(xì)胞培養(yǎng)單元的每個孔通過微流通道與固相萃取單元的流入端相連，固相萃取單元的流出端與分離單元的流入端相連。
3.按照權(quán)利要求2所述細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片，其特征在于在所述固相萃取單元中增設(shè)一洗脫液的儲液槽，其通過微通道與流入端相連。
4.按照權(quán)利要求1、2或3所述細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片，其特征在于所述分離單元是多個基本分離單元的陣列。
5.按照權(quán)利要求4所述細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片，其特征在于所述基本分離單元采用十字交叉型，或者雙T型。
6.按照權(quán)利要求5細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片，其特征在于所述基本分離單元的分離通道是直線、折線或者曲線。
7.按照權(quán)利要求1或2所述細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片，其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)單元用膠原、細(xì)胞表面纖連蛋白、層粘連蛋白，肌腱蛋白、血小板反應(yīng)蛋白和玻連蛋白、糖蛋白選擇性包被。
8.權(quán)利要求1、5所述細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片用于不同類細(xì)胞的差異表達(dá)和/或基因比較分析；同一種細(xì)胞的差異培養(yǎng)分析；正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、可疑細(xì)胞的比較分析；基于細(xì)胞差異表達(dá)的藥物篩選常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)、表達(dá)、基因變異分析。
全文摘要
一種細(xì)胞差異表達(dá)與基因測試復(fù)合微流芯片，其特征在于該芯片由細(xì)胞培養(yǎng)單元和分離單元構(gòu)成，細(xì)胞培養(yǎng)單元為多孔點(diǎn)陣，每個孔通過微流通道與分離單元的流入端相連?？梢杂糜诓煌惣?xì)胞的差異表達(dá)和/或基因比較分析；同一種細(xì)胞的差異培養(yǎng)分析；正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、可疑細(xì)胞的比較分析；基于細(xì)胞差異表達(dá)的藥物篩選常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)、表達(dá)、基因變異分析。本發(fā)明將細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞差異表達(dá)及基因分析集成在同一塊芯片，減少了操作的成本，減少了傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞差異表達(dá)及基因分析過程中的污染，提高了分析的速度，為細(xì)胞的差異表達(dá)及基因分析提供完全一致的分析環(huán)境，提高分析數(shù)據(jù)的可比較性。
文檔編號C12Q1/68GK1477206SQ02132799
公開日2004年2月25日 申請日期2002年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月23日
發(fā)明者吳大朋, 羅勇, 周小棉, 戴忠鵬, 林炳承 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所