利用水體沉積物中微生物多樣性指標(biāo)評(píng)價(jià)水質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種利用水體沉積物中微生物多樣性指標(biāo)評(píng)價(jià)水質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在淡水生態(tài)系統(tǒng)中，由于沉積物和上層水體頻繁地進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)和污染物質(zhì)的交 換，沉積物中代謝過程極大地影響了水體的水質(zhì)。水體的大部分微生物棲息于沉積物中，不 斷進(jìn)行各種有機(jī)物質(zhì)的分解和轉(zhuǎn)化，是食物鏈中的重要生產(chǎn)者。因此，微生物具有對(duì)環(huán)境條 件變化的敏感性，微生物群落對(duì)水質(zhì)變化的生態(tài)效應(yīng)主要是某些指標(biāo)種(對(duì)某種污染有耐 性或敏感的種類）的出現(xiàn)或消失、個(gè)別種群的變化、微生物群落中種類或類群的增減及改變 等，而這些生態(tài)效應(yīng)都集中體現(xiàn)在沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性方面的變化，可以利用 微生物組成與多樣性變動(dòng)評(píng)價(jià)水質(zhì)。
[0003]由于微生物監(jiān)測(cè)具有傳統(tǒng)理化監(jiān)測(cè)所不可替代的優(yōu)越性，不僅能反映環(huán)境污染對(duì) 生物產(chǎn)生的綜合效應(yīng)和積累效應(yīng)，還可以對(duì)儀器無法檢測(cè)出的一些低濃度甚至是痕量的污 染物，生物可迅速呈現(xiàn)相應(yīng)癥狀?？傊飳W(xué)法具有直觀、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，不僅反映水質(zhì)的瞬 時(shí)變化，而且能連續(xù)監(jiān)測(cè)水質(zhì)污染，反映低濃度污染物對(duì)生物體的潛在危害。
[0004]目前我國的河流水質(zhì)的微生物檢測(cè)主要以純培養(yǎng)技術(shù)為主，但是水體細(xì)菌的種類 較多，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法只能獲得少數(shù)細(xì)菌種類，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展與完 善，克服了傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法通量低、準(zhǔn)確率低等缺點(diǎn)，可以更加全面、準(zhǔn)確、快速地反映 環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)，從而可以更加客觀地認(rèn)識(shí)環(huán)境中微生物原位的生態(tài)狀況。因此，為了 更好地促進(jìn)河流水質(zhì)管理，今后我國應(yīng)采用理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)全面評(píng)價(jià)河流水質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種利用水體沉積物中微生 物多樣性指標(biāo)評(píng)價(jià)水質(zhì)的方法。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種水體沉積物中微生物多樣性指標(biāo)評(píng)價(jià)水質(zhì)的方法，其特征在于該方法的具體步驟 為： 1) 提取沉積物中微生物基因組DNA; 2) 以步驟a提取的DNA作為模板，針對(duì)16SrRNA基因的V4可變區(qū)，合成帶有barcode 的融合引物如下： F:5' -Index+AYTGGGYDTAAAGNG-3'， R:5' -TACNVGGGTATCTAATCC-3)，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 3) 將步驟b得到的PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶切膠純化，在經(jīng)切膠 純化后的DNA片段的3'端引入單堿基"A"，連接"Y"字形接頭，該"Y"字形接頭的3'末 端含有單堿基"T"，使所述的DNA片段和接頭能夠通過"A" "T"互補(bǔ)配對(duì)連接，后利用PCR 選擇性地富集兩端連有接頭的DNA片段，同時(shí)擴(kuò)增DNA文庫，測(cè)序； 4).對(duì)經(jīng)步驟c測(cè)序后的序列進(jìn)行過濾和去除嵌合體，進(jìn)行OTU的聚類和注釋，各分類 水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析和物種豐度差異分析，利用微生物指標(biāo)評(píng)價(jià)因子PA，BGN: 0進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0007] 計(jì)算微生物指標(biāo)評(píng)價(jià)因子： 根據(jù)Simtet(AppliedEnvironmentalMicrobiology, 2001，67:2284-2291)
PA值>0. 8為富營養(yǎng)，>0. 46時(shí)為營養(yǎng)豐富，〈0. 34為寡營養(yǎng)水平。
[0008]根據(jù)Garridoet(ScienceofTheTotalEnvironment, 2014，468 - 469: 1154 - 1161)計(jì)算
其中Bac是擬桿菌門豐度，GmP是y變形菌門豐度，Nit是硝化螺菌門豐度，BtP是 變形菌門豐度。
[0009]BGN: 0指數(shù)越高，說明水體污染越嚴(yán)重。BGN: 0〈0. 85,水體水質(zhì)尚清潔， BGN: 0 >1. 3,水體污染較嚴(yán)重。
[0010] 本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)： 1.本發(fā)明運(yùn)用微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)指標(biāo)能綜合評(píng)價(jià)水體水質(zhì)，具有很強(qiáng)的敏感性，能 更全面地反映水質(zhì)的變化。
[0011] 2.本發(fā)明應(yīng)用MiSeqIllumina測(cè)序技術(shù)可以獲得高通量的基因序列（>3萬條優(yōu) 質(zhì)序列/樣品)，能獲得客觀全面的微生物群落結(jié)構(gòu)，更直接全面地反映水環(huán)境污染程度。
[0012] 3.對(duì)各類水體的沉積物都可以準(zhǔn)確測(cè)定，在時(shí)間和空間動(dòng)態(tài)都能進(jìn)行長期和短期 的監(jiān)測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0013] 圖1本發(fā)明實(shí)施例一種沉積物基因組DNA。
[0014] 圖2沉積物中微生物物種豐度分布曲線：每條折線代表一個(gè)樣品的0TU豐度分 布，物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長度來反映，曲線跨度越大表示物種的組成越豐富； 物種組成的均勻程度由曲線的形狀來反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高。
[0015]圖3沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)非度量多維度尺度分析。
[0016] 圖4沉積物微生物PA評(píng)價(jià)因子。
[0017] 圖5沉積物微生物BGN: 0評(píng)價(jià)因子。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不限于次。
[0019] 實(shí)施例1、 1、選取浙江某城市內(nèi)兩條II級(jí)航道河流，采集不同斷面的共11個(gè)樣點(diǎn)底泥沉積物，取 樣深度為10cm。測(cè)定口11、〇)0、1隊(duì)1?、氨氮濃度等多項(xiàng)理化指標(biāo)，如表1所示。采集好的 底泥樣品置于離心管中并在_20°C保存。
[0020] 表1采樣點(diǎn)主要理化性質(zhì)指標(biāo)值
2、取0.5g各采樣點(diǎn)沉積物樣品提取DNA(PowerSoirDNAIsolationKit,按說明書 步驟提取)，見圖1。并用微量分光光度計(jì)測(cè)定采樣點(diǎn)DNA濃度和純度。
[0021] 3、針對(duì)16SrRNA基因的V4可變區(qū)合成融合引物汗：5'_ Index+AYTGGGYDTAAAGNG-3'，R:5' -TACNVGGGTATCTAATCC-3)并進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系選 取 12.5uL標(biāo)準(zhǔn)體系：1.25yL10Xbuffer、25mMMgCl2、2.5mMdNTP、0.5UTaqDNA聚 合酶、3. 0pmol前引物和后引物、50ngDNA模板進(jìn)行如下程序PCR擴(kuò)增：95°C5min，94°C下 30s進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)，52 - 64°C下 30s, 72°C下 40s, 72°C下伸展 7min。
[0022] 4、利用MiSeqIllumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，上 海）結(jié)果用QIME和Mothur等軟件進(jìn)行生物信息分析，對(duì)得到的優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行0TU的聚類 和注釋，各分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析和物種豐度差異分析。見圖2 5、運(yùn)用SPSS和R-2. 1. 1等軟件結(jié)合沉積物理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分分 析和非度量多維度尺度分析。見圖3。非度量多維度尺度分析結(jié)果良好，重要值達(dá)到0.12。 如圖1所示，影響微生物種群分布和群落結(jié)構(gòu)的主要污染物為C0D、揮發(fā)酚和氨，而它們所 影響的樣點(diǎn)分布也和污染物有一定的關(guān)系：主要受揮發(fā)酚影響的東山大橋、濕地和聯(lián)合橋 都屬于農(nóng)業(yè)區(qū)，公鐵立交橋除外；這些點(diǎn)的放線菌、綠彎菌門和厚壁菌門相對(duì)比例較高，這 些菌門均和揮發(fā)酚的轉(zhuǎn)化有關(guān)。主要受C0D影響的樣點(diǎn)長水塘河和公鐵立交橋點(diǎn)的綠菌門 和綠彎菌門相對(duì)比例較高，這兩類菌門均和有機(jī)物的轉(zhuǎn)化相關(guān)。污染物質(zhì)對(duì)微生物群落結(jié) 構(gòu)具有一定程度地選擇作用。
[0023] 6、計(jì)算微生物群落PA和BGN: 0評(píng)價(jià)因子，評(píng)價(jià)所監(jiān)測(cè)的河流水體水質(zhì)生態(tài)狀況， 見圖4、圖5。在本案例中，11個(gè)樣點(diǎn)的PA評(píng)價(jià)因子分布在0. 79-0. 89范圍內(nèi)，由此可知調(diào) 查河流水質(zhì)均達(dá)到富營養(yǎng)水平（PA值>0. 8為富營養(yǎng)，>0. 46時(shí)為營養(yǎng)豐富，〈0. 34為寡營 養(yǎng)水平)，與理化性質(zhì)指標(biāo)一致。同時(shí)，在不同功能區(qū)比值特征也存在一定區(qū)別，農(nóng)業(yè)區(qū)高于 工業(yè)區(qū)和生活區(qū)，因?yàn)檗r(nóng)業(yè)區(qū)有著較多有機(jī)污染物的排入，其次是生活區(qū)，工業(yè)區(qū)最低。另 一方面，根據(jù)BGN: 0評(píng)價(jià)指標(biāo)，工業(yè)區(qū)高于另外兩個(gè)功能區(qū)，生活區(qū)次之，農(nóng)業(yè)區(qū)最低。而BGN: 0的比值越低則說明水體受污染程度越小，但是本案例中11個(gè)樣點(diǎn)的BGN:fM直分 布在1. 55-3. 51，均大于1. 3,說明水體受污染較嚴(yán)重。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種水體沉積物中微生物多樣性指標(biāo)評(píng)價(jià)水質(zhì)的方法，其特征在于該方法的具體步 驟為： a. 提取沉積物中微生物基因組DNA; b. 以步驟a提取的DNA作為模板，針對(duì)16SrRNA基因的V4可變區(qū)，合成帶有barcode 的融合引物如下： F:5' -Index+AYTGGGYDTAAAGNG-3'， R:5' -TACNVGGGTATCTAATCC-3)，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增； c. 將步驟b得到的PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶切膠純化，在經(jīng)切膠 純化后的DNA片段的3'端引入單堿基"A"，連接"Y"字形接頭，該"Y"字形接頭的3'末 端含有單堿基"T"，使所述的DNA片段和接頭能夠通過"A" "T"互補(bǔ)配對(duì)連接，后利用PCR 選擇性地富集兩端連有接頭的DNA片段，同時(shí)擴(kuò)增DNA文庫，測(cè)序； d. 對(duì)經(jīng)步驟c測(cè)序后的序列進(jìn)行過濾和去除嵌合體，進(jìn)行OTU的聚類和注釋，各分類水 平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析和物種豐度差異分析，利用微生物指標(biāo)評(píng)價(jià)因子PA，BGN: 0 進(jìn)行評(píng)價(jià)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用水體沉積物中微生物多樣性指標(biāo)評(píng)價(jià)水質(zhì)的方法。該方法通過利用Miseq高通量測(cè)序確定沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)合相關(guān)水體理化指標(biāo)，運(yùn)用主成分分析和非度量多維度尺度分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究微生物與其生境之間的關(guān)系，并計(jì)算PA和BGN:β評(píng)價(jià)微生物指標(biāo)，確定水質(zhì)富營養(yǎng)水平和污染水平。本發(fā)明利用高通量測(cè)序技術(shù)客觀全面地獲得不同污染類型水體沉積物中微生物的群落特征，綜合評(píng)價(jià)水體水質(zhì)，所選的微生物評(píng)價(jià)指標(biāo)能靈敏地反映水質(zhì)變化，適應(yīng)性較廣，對(duì)各類水體沉積物都可以準(zhǔn)確測(cè)定。
【IPC分類】G06F19/20
【公開號(hào)】CN104899475
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510260490
【發(fā)明人】陳學(xué)萍, 張旭, 顧卿, 葉丹華, 鄭毓, 何池全
【申請(qǐng)人】上海大學(xué)
【公開日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年5月21日