專利名稱：：利用熒光標(biāo)記酶切基因進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的分析方法，具體是一種利用熒光標(biāo)記酶切基因進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析的方法。
背景技術(shù)：
：微生物是地球上為數(shù)最為眾多的一類生物，通常以復(fù)雜群落的形式存在，并在維系生態(tài)平衡、提供自然資源、調(diào)節(jié)宿主新陳代謝等方面發(fā)揮著重要的作用。目前，已有大量微生物被分離、培養(yǎng)和鑒定。但是由于培養(yǎng)方法有著費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)以及技術(shù)上的局限性，近年來已有大量分子生物學(xué)方法被開發(fā)并應(yīng)用于研究復(fù)雜微生物群落的結(jié)構(gòu)，并對(duì)研究其功能提供指導(dǎo)。常用的微生物分子生物學(xué)技術(shù)包括基于分子標(biāo)簽(如SSUrRNA基因、ITS序列等)的分子指紋圖譜技術(shù)，如變性/溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)、單鏈構(gòu)像多態(tài)性(SSCP)、rDNA限制性片段多態(tài)性(ADRDA)、末端限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)等；以及用于全面描述微生物群落結(jié)構(gòu)和物種進(jìn)化關(guān)系的克隆文庫(kù)分析等。DNA指紋圖技術(shù)能夠把從環(huán)境樣品中PCR擴(kuò)增得到的微生物群落中所有種群的特征性基因片段以指紋圖譜的形式展現(xiàn)出來，從而快速靈敏地檢測(cè)微生態(tài)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)變化，展現(xiàn)微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性。ADRDA和T-RFLP是兩種目前最常用的基于限制性酶切的DNA指紋圖譜技術(shù)。ARDRA技術(shù)是通過PCR得到rDNA的基因序列混合物，用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，并通過凝膠電泳獲得圖譜，對(duì)得到的所有限制性片段多樣性進(jìn)行全面分析。但基于傳統(tǒng)凝膠電泳技術(shù)使得其具有分辨率低、重復(fù)性差以及不便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析等缺點(diǎn)，故目前多用于對(duì)環(huán)境中分離得到的菌株進(jìn)行屬、種水平的分類和菌株的區(qū)分，以及對(duì)rDNA克隆文庫(kù)中的克隆進(jìn)行分型和評(píng)價(jià)，僅有少數(shù)研究將其運(yùn)用于分析廢水、土壤等微生物群落結(jié)構(gòu)；T-RFLP技術(shù)使用5'端用熒光標(biāo)記的引物來擴(kuò)3增目標(biāo)基因，進(jìn)行限制性酶切得到酶切片段，然后用DNA測(cè)序儀對(duì)帶有熒光的末端限制性片段進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得代表微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的指紋圖譜。依賴于毛細(xì)管電泳技術(shù)的T-RFLP技術(shù)具有高靈敏度，高通量及高重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)，且便于多樣性圖譜的數(shù)字化輸出和后續(xù)分析，故被廣泛應(yīng)用于包括土壤、水體、特殊地質(zhì)層、生物降解池以及人和動(dòng)物的腸道菌群在內(nèi)的各種環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的比較分析和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。但因其只對(duì)基因的末端限制性片段進(jìn)行分析，故在對(duì)復(fù)雜微生物群落進(jìn)行分析的時(shí)候具有一定的局限性。它僅檢測(cè)末端限制性片段長(zhǎng)度的多態(tài)性，因而在圖譜中，同樣長(zhǎng)度的末端限制性片段可能來自幾種不同的細(xì)菌，有的在進(jìn)化關(guān)系中甚至相去甚遠(yuǎn)。同時(shí)，自然環(huán)境中的微生物群落多樣性往往過于復(fù)雜，故T-RFLP圖譜所反映的群落組成很難具體到種屬水平，因此，在低分類單元水平上的多樣性無法體現(xiàn)出來，但這種多樣性恰恰是很多復(fù)雜樣品的特征。運(yùn)用多種限制性內(nèi)切酶對(duì)同一樣品進(jìn)行檢測(cè)，并將數(shù)據(jù)綜合進(jìn)行分析，可以得到微生物群落組成的更豐富的信息，這一手段已被廣泛運(yùn)用于彌補(bǔ)上述不足。但是，運(yùn)用多種酶切不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且在數(shù)據(jù)處理的過程中容易引入誤差。因此，結(jié)合上述兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展一種能夠準(zhǔn)確和全面地對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的方法，具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的局限，提供一種利用熒光標(biāo)記酶切基因進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析的方法。本發(fā)明的方法利用了毛細(xì)管電泳的高通量、高靈敏度和高重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效獲得全面的微生物群落結(jié)構(gòu)信息。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，具體步驟如下步驟一，提取樣本的基因組總DNA，擴(kuò)增微生物系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因；步驟二，利用限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增得到的標(biāo)記基因進(jìn)行酶切，得到帶有粘性末端的限制性片段；步驟三，對(duì)所有限制性片段進(jìn)行末端熒光標(biāo)記；步驟四，運(yùn)用DNA遺傳分析儀分離并檢測(cè)已被末端熒光標(biāo)記的限制性片段，4得到樣本的微生物組成信息圖譜；步驟五，對(duì)信息圖譜進(jìn)行多元變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，獲得微生物群落結(jié)構(gòu)信息特征與變化規(guī)律。步驟二中，所述酶切具體為，采用4核苷酸識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)標(biāo)記基因進(jìn)行酶切，獲得具有粘性末端的酶切片段。步驟三中，所述末端熒光標(biāo)記具體為，使用DNApolymeraseKlenow酶進(jìn)行熒光標(biāo)記，標(biāo)記所用的底物是與酶切后得到的粘性末端堿基互補(bǔ)配對(duì)的脫氧單核苷酸。步驟四中，所述分離并檢測(cè)具體為，利用DNA遺傳分析儀進(jìn)行檢測(cè)。步驟五中，所述多元變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為主成分分析。本發(fā)明涉及的是一種分析微生物群落結(jié)構(gòu)的DNA指紋圖譜方法，具體是選取具有微生物分類特征的特定基因片段作為研究對(duì)象，使用限制性內(nèi)切酶對(duì)其進(jìn)行酶切，并對(duì)所有的限制性片段進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過DNA片段熒光分析儀器對(duì)所有片段進(jìn)行檢測(cè)和分析獲得DNA多樣性指紋圖譜，用于比較研究多樣本的微生物群落的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明的方法利用了毛細(xì)管電泳的高通量、高靈敏度和高重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效全面地獲得微生物群落結(jié)構(gòu)信息。圖1DNA樣品以ADRDA和本發(fā)明方法分析結(jié)果的比較；圖2第一組模擬微生物群落用本發(fā)明方法分析的結(jié)果；圖3第二組模擬微生物群落用本發(fā)明方法分析的結(jié)果；圖4動(dòng)物腸道微生物群落用本發(fā)明方法和T-RFLP法分析結(jié)果的比較。具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例做詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1下面通過對(duì)模擬微生物群落進(jìn)行分析來進(jìn)一步描述本發(fā)明1、16SrRNA基因代表序列的選取本實(shí)施例提取樣品的基因組總DNA，并選取16SrRNA基因(或其它微生物系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因，如gyrB、r叩B等)作為細(xì)菌多樣性的標(biāo)記基因，采用合適的通用引物擴(kuò)增該標(biāo)記基因片段。其中16SrRNA基因是目前分子生態(tài)學(xué)中最常用的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記基因，包含豐富的進(jìn)化信息，且具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)庫(kù)作為后續(xù)分析的支撐。本實(shí)例以16SrRNA基因?yàn)榇?。本?shí)施例所選取的16SrRNA基因代表序列選自李旻等人報(bào)道的中國(guó)人腸道菌群中的代表序列，共12條序列，記為A~F和H~M，其中5條來自擬桿菌門，4條來自厚壁菌門，3條來自變形菌門。該12條序列的Genbank登錄號(hào)依次為EF403826,EF403827,EF403833,EF403836,EF403840,EF403957,EF404131,EF404244，EF404279，EF404297，EF404313，EF404522;同時(shí)這12條序列已經(jīng)在《LiM，WangB,ZhangM，RantalainenM，WangS，ZhouH，ZhangY，ShenJ，PangX,ZhangM,WeiH，ChenY,LuH，ZuoJ，SuM，QiuY，JiaW，XiaoC，SmithLM，YangS，HolmesE，TangH，ZhaoG，NicholsonJK，LiL，ZhaoL.Symbioticgutmicrobesmodulatehumanmetabolicphenotypes.ProcNatlAcadSciUSA.2008Feb12;105(6):2117-22》(共生調(diào)節(jié)的人體腸道微生物的代謝表型，美國(guó)科學(xué)院院報(bào))中公開。將這些序列克隆在常規(guī)TA克隆載體pGEMT質(zhì)粒上，記為PAPF，PHPM。具體方法為將攜帶有質(zhì)粒的E.coliDH5a細(xì)胞于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，用試劑盒抽取質(zhì)粒DNA作為以下研究對(duì)象。2、對(duì)單序列進(jìn)行片段分析將質(zhì)粒DNA以16SrRNA基因全長(zhǎng)通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用具有4核苷酸識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶Mspl(5'-C—CGG)對(duì)16SrRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，得到帶有粘性末端的限制性片段，這些片段可作為樣品的微生物群落多樣性的指標(biāo)，當(dāng)一個(gè)樣品的多樣性較高時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生更多種類的酶切片段；產(chǎn)生粘性末端保證了后續(xù)標(biāo)記步驟的進(jìn)行。在Klenow酶的作用下，將熒光標(biāo)記的Cy5-dCTP(或其它與酶切片段粘性末端核苷酸堿基互補(bǔ)的熒光標(biāo)記脫氧三磷酸核苷酸)通過堿基互補(bǔ)連接到粘性末端，使DNA片段進(jìn)行熒光標(biāo)記。運(yùn)用BeckmanCEQ8000DNA遺傳分析儀(或其它可對(duì)熒光標(biāo)記的DNA片段進(jìn)行分離和片段大小測(cè)定的儀器)分離檢測(cè)經(jīng)酶切和熒光標(biāo)記的限制性片段，得到DNA片段大小和豐度組成的信息圖譜。對(duì)前述12條序列用本方法進(jìn)行分析；同時(shí)根據(jù)這12條16SrRNA基因的序列信息和內(nèi)切酶M印I的酶切位點(diǎn)(5'-(TCGG)對(duì)生成片段進(jìn)行模擬，得到相應(yīng)限制性片段的數(shù)量和長(zhǎng)度的理論值；并對(duì)這12條序列進(jìn)行ARDRA分析。將實(shí)驗(yàn)得到的片段信息與模擬結(jié)果、ARDRA分析結(jié)果作比較。根據(jù)模擬酶切，所有片段都位于0~800bp區(qū)間內(nèi)。考慮到測(cè)序儀本身的檢測(cè)局限，以及去除引物二聚體的影響，本實(shí)施例選取70~600bp區(qū)間內(nèi)的片段，比較模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，在模擬中出現(xiàn)的該區(qū)間的69個(gè)片段全都能夠被檢測(cè)到，來自各代表序列的片段數(shù)目與模擬值一致。ARDRA分析得到片段數(shù)目也與本方法檢測(cè)結(jié)果一致(圖la)。圖1為DNA樣品以ADRM和本實(shí)施例分析結(jié)果的比較圖，圖中，a單條16SrRNA基因片段樣本，b動(dòng)物腸道微生物群落DNA樣本。作為比ARDRA更精細(xì)的檢測(cè)方法，本實(shí)施例能夠較為準(zhǔn)確地測(cè)量出片段的長(zhǎng)度。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，片段長(zhǎng)度的測(cè)量值與模擬值的結(jié)果一致。來自不同序列的模擬長(zhǎng)度相同的片段，其長(zhǎng)度測(cè)量值的差別不超過lbp;對(duì)于長(zhǎng)度在100bp以上的片段，62。/。的片段其測(cè)量值與模擬值之間的誤差為土lbp以內(nèi)，92。/。為土2bp以內(nèi)。而在長(zhǎng)度在100bp以內(nèi)的片段，誤差范圍較大，僅有42%的片段其測(cè)量值與模擬值之間的誤差為土2bp以內(nèi)?；诖耍瑸榱藴p小檢測(cè)誤差，準(zhǔn)確表現(xiàn)群落結(jié)構(gòu)，本實(shí)施例100~600bp范圍內(nèi)的片段信息是準(zhǔn)確可靠的，并在后面的分析中，選取本區(qū)間的片段用于數(shù)據(jù)分析。73、構(gòu)建模擬微生物群落并對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析用前述含有單條序列的質(zhì)粒構(gòu)建兩組模擬微生物群落。第一組由PA和PE組成，編號(hào)為P1P8八個(gè)組合，其構(gòu)建方法是向lOOng質(zhì)粒PE中依次加入質(zhì)粒PA，其質(zhì)量為10ng，5ng，2ng，1.25ng，lng，0.5ng，0.2ng，0.lng，換算成質(zhì)?？截悢?shù)即為向拷貝數(shù)為4.13*10w的質(zhì)粒PE中依次加入拷貝數(shù)為4.13*109，2.08*109，8.26*108，5.17*108，4.13*108，2.08*108，8.26*107，4.13*107的質(zhì)粒PA，其中質(zhì)粒PA所占百分比依次為9.09%，4.76%，1.96%，1.23%，0.99%，0.50%，0.20%，0.10%，比例依次減??；第二組由質(zhì)粒PA，PB，PE，PF，PL按照不同比例混合構(gòu)建，記為M1M5，共五個(gè)模擬群落組合，具體組成見表l。用本實(shí)施例前述單個(gè)質(zhì)粒分析實(shí)驗(yàn)步驟檢測(cè)兩組模擬微生物群落結(jié)構(gòu)，得到模擬微生物群落DNA酶切片段的長(zhǎng)度和豐度值。根據(jù)模擬群落中16SrRNA基因序列信息和酶切位點(diǎn)對(duì)生成片段進(jìn)行模擬，得到相應(yīng)限制性片段的數(shù)量和長(zhǎng)度的理論值，并與實(shí)際檢測(cè)結(jié)果作比較；以來自同一質(zhì)粒的片段的平均豐度來表示該質(zhì)粒在群落中含量的檢測(cè)值，計(jì)算其在混合群落中的比例，并將其與各質(zhì)粒的實(shí)際比例進(jìn)行比較，從而確定本實(shí)施例對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析的準(zhǔn)確性。表l各質(zhì)粒在模擬微生物群落M1M5中所占的比例<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在第一組模擬微生物群落P1P6中，PA和PE酶切模擬結(jié)果中位于區(qū)間100600bp的7個(gè)片段都被清楚地檢測(cè)到；在P7中，來自PA的片段在峰圖上顯示為較低的峰，且與峰圖噪音混淆，不易分辨；而在P8中，來自PA的片段不能被檢測(cè)到。隨著P1P6中質(zhì)粒PA所占百分比的減少，檢測(cè)結(jié)果中PA的比例也逐漸減少，兩者呈良好的線性相關(guān)(R2=0.9999)(圖2);用CHITEST函數(shù)檢驗(yàn)得出PA在模擬群落中所占比例的檢測(cè)值和PA在混合群落DNA中所占實(shí)際比例沒有明顯差異(P=0.748)。據(jù)此，本實(shí)施例能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到在群落中所占比例最低為0.5%的細(xì)菌，并可以準(zhǔn)確反映群落結(jié)構(gòu)組成，從而顯示不同微生物群落結(jié)構(gòu)的區(qū)別。為了驗(yàn)證方法的可重復(fù)性，本實(shí)施例從擴(kuò)增標(biāo)記基因開始重復(fù)三次，在圖中以誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差，可以看出本實(shí)施例具有較好的重復(fù)性。圖2為第一組模擬微生物群落用本實(shí)施例分析的結(jié)果。在第二組模擬微生物群落的分析結(jié)果中，每個(gè)群落所檢測(cè)到的酶切片段數(shù)量和片段大小都與理論模擬值一致；圖3a中，代表各質(zhì)粒比例檢測(cè)值和實(shí)際比例的點(diǎn)都位于直線尸x附近，說明二者一致。用CHITEST函數(shù)檢驗(yàn)同樣得出各質(zhì)粒在模擬群落中所占比例的檢測(cè)值和群落DNA中的實(shí)際比例沒有明顯差異(P=0.952±0.021)，證明本方法能夠準(zhǔn)確地反映微生物群落中細(xì)菌的組成比例；構(gòu)建各群落的5個(gè)質(zhì)粒在M廣M5各群落檢測(cè)結(jié)果中所占比例與群落DNA中實(shí)際比例均呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性(R2=0.989±0.007)(圖3b)，證明本實(shí)施例能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出不同微生物群落的區(qū)別。本實(shí)施例同樣重復(fù)三次，并計(jì)算各片段長(zhǎng)度和豐度百分比數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)差，在圖中以誤差線表示，顯示本方法具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。圖3第二組模擬微生物群落用本發(fā)明方法分析的結(jié)果，a群落實(shí)測(cè)酶切片段所計(jì)算的質(zhì)粒含量與實(shí)際含量的回歸曲線，b不同微生物群落中質(zhì)粒A的實(shí)測(cè)計(jì)算含量與實(shí)際含量的回歸曲線。實(shí)施例2本實(shí)施例是以皮下注射化學(xué)致癌劑1，2-二甲肼(1,2-dimethylhydrazine)誘導(dǎo)結(jié)腸癌癌前病變大鼠模型為對(duì)象，對(duì)結(jié)腸癌癌前病變形成過程中腸道菌群組成的漸進(jìn)性變化進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組(6只大鼠，記為A-F)和造模組(6只大鼠，記為G-L)，造模組分兩次注射造模劑1，2-二甲肼，間隔為一周，對(duì)照組注射安慰劑。在第二次注射造模劑前及之后六周各采集一次糞便樣品。后一次糞便樣品收集完畢之后，對(duì)大鼠進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)造模組6只大鼠腸壁上均有異常隱9窩病灶生成，數(shù)量為37.7±2.6個(gè)，證明結(jié)腸癌癌前病變確實(shí)在造模組中發(fā)生。而對(duì)照組6只大鼠腸壁均無異常隱窩病灶生成。提取每份糞便樣品中的細(xì)菌總DNA用于后續(xù)分析。對(duì)造模組和對(duì)照組大鼠在上述兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腸道菌群用ARDRA，DGGE和454測(cè)序方法證明隨著時(shí)間變化，兩組大鼠的腸道菌群在前后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均發(fā)生了一定的變化，提示大鼠腸道菌群變化與其自身生長(zhǎng)有關(guān)；同時(shí)在造模前兩組大鼠的腸道菌群沒有明顯差異，而在造模六周后，兩組大鼠的腸道菌群有明顯差異，說明癌前病變的發(fā)生發(fā)展與腸道菌群的改變相關(guān)。用本實(shí)施例造模組和對(duì)照組大鼠在上述兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腸道菌群結(jié)構(gòu)，并與ADRDA結(jié)果作比較。ARDRA分析得到的片段數(shù)目和長(zhǎng)度值與本方法檢測(cè)結(jié)果相似，但本實(shí)施例可以有效分別的一組大小為350400bp的片段在ARDRA中無法分辨(附圖lb)。對(duì)本實(shí)施例所測(cè)定的不同樣本的微生物群落的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，各樣本的熒光標(biāo)記限制性片段的組成(包括片段大小與豐度)圖譜信息可以轉(zhuǎn)化為一列數(shù)據(jù)矩陣，多個(gè)樣本組成的數(shù)據(jù)矩陣可以采用多元變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括主成分分析(PCA)等各種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，從而找出不同樣本微生物群落結(jié)構(gòu)的特征和變化規(guī)律。造模組和對(duì)照組大鼠在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腸道菌群結(jié)構(gòu)的主成分分析(PCA)結(jié)果可看出隨著時(shí)間變化，模型組和對(duì)照組大鼠的腸道菌群沿所占比例最大的主成分1(PC1)方向發(fā)生了變化，說明在此實(shí)驗(yàn)中，與時(shí)間相關(guān)的生長(zhǎng)因素是造成腸道菌群變化的主要原因；而比較造模組和對(duì)照組大鼠的腸道菌群，本實(shí)施例在造模前時(shí)間點(diǎn)，代表兩組腸道菌群的點(diǎn)混雜在一起，說明它們之間沒有明顯差異。而在造模六周后的時(shí)間點(diǎn)，代表兩組腸道菌群的點(diǎn)分開了，說明這時(shí)兩組之間的腸道菌群有了明顯的差異。這說明，結(jié)腸癌癌前病變?cè)炷＿^程與腸道菌群的改變相關(guān)(附圖4a)。將不同時(shí)間點(diǎn)兩組的腸道菌群結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行分析，也能得到一樣的結(jié)果在造模前時(shí)間點(diǎn)，兩組腸道菌群沒有明顯差異(附圖4d);在造模六周后，兩組之間的腸道菌群有了明顯的差異(附圖4g)。圖4動(dòng)物腸道微生物群落10用本發(fā)明方法和T-RFLP法分析結(jié)果的比較a用本方法對(duì)模型組和對(duì)照組大鼠在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腸道菌群檢測(cè)結(jié)果的PCA分析；b用基于限制性內(nèi)切酶Mspl的T-RFLP對(duì)模型組和對(duì)照組大鼠兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腸道菌群檢測(cè)結(jié)果的PCA分析；c用基于限制性內(nèi)切酶Mspl，Hhal和HaeIII的T-RFLP對(duì)模型組和對(duì)照組大鼠兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腸道菌群檢測(cè)結(jié)果的PCA分析；d用本方法對(duì)模型組和對(duì)照組大鼠造模前的腸道菌群檢測(cè)結(jié)果的PCA分析；e用基于限制性內(nèi)切酶Mspl的T-RFLP對(duì)模型組和對(duì)照組大鼠造模前的腸道菌群檢測(cè)結(jié)果的PCA分析；f用基于限制性內(nèi)切酶Mspl，Hhal和HaeIII的T-RFLP對(duì)模型組和對(duì)照組大鼠造模前的腸道菌群檢測(cè)結(jié)果的PCA分析；g用本方法對(duì)模型組和對(duì)照組大鼠造模六周后的腸道菌群檢測(cè)結(jié)果的PCA分析；h用基于限制性內(nèi)切酶Mspl的T-RFLP對(duì)模型組和對(duì)照組大鼠造模六周后的腸道菌群檢測(cè)結(jié)果的PCA分析；i用基于限制性內(nèi)切酶MspI，Hhal和HaeIII的T-RFLP對(duì)模型組和對(duì)照組大鼠造模六周后的腸道菌群檢測(cè)結(jié)果的PCA分析。其中，模型組動(dòng)物由黑色實(shí)心圖標(biāo)表示，對(duì)照組動(dòng)物由空心圖標(biāo)表示。A表示造模前樣本，O表示造模六周后樣本。各圖中縱橫坐標(biāo)中各PC表示相應(yīng)的主成分因子。同時(shí)用T-RFLP技術(shù)對(duì)上述24個(gè)樣本進(jìn)行分析，以熒光標(biāo)記的16SrRNA基因全長(zhǎng)通用引物27f(5，-Cy5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT)對(duì)16SrRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段以限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。使用的限制性內(nèi)切酶有Mspl(5'-C"CGG)，Hhal(GCG'C)和HaeIII(GG"CC)。首先將Mspl酶切得到的圖譜信息加以解譯，轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)矩陣用于PCA分析；其次，將三種限制性內(nèi)切酶得到的圖譜綜合加以解譯，轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)矩陣用于PCA分析。在由Mspl酶切數(shù)據(jù)得到的PCA圖中，本實(shí)施例在造模前，兩組大鼠的腸道菌群沒有差異，而在造模六周后，兩組大鼠的腸道菌群顯示出一定的分開趨勢(shì)，但區(qū)別并不明顯(附圖4b，e，h);而在三種限制性內(nèi)切酶綜合數(shù)據(jù)得到的PCA圖中，造模前兩組的腸道菌群同樣沒有區(qū)別，而造模六周后，兩組的腸道菌群則被明顯地分開了(附圖4c，f，i)。T-RFLP的分析結(jié)果與本方法分析結(jié)果在一定程度上相互映證。但同時(shí)也能夠看到，當(dāng)僅將MspI酶切數(shù)據(jù)用于分析的時(shí)候，造模后六周的兩組大鼠腸道菌群區(qū)別并不明顯，而多種酶切的綜合數(shù)據(jù)卻能夠?qū)⑦@兩者的區(qū)別顯示出來，與前文所述的本方法得到的結(jié)論一致，且與DGGE、454測(cè)序結(jié)果一致。本實(shí)施例結(jié)果說明，T-RFLP在對(duì)構(gòu)成極為復(fù)雜的微生物群落進(jìn)行分析時(shí)，由于信息量有限帶來分辨率不夠高的問題，需要對(duì)相同的樣本用多種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切并對(duì)酶切圖譜綜合進(jìn)行，才能夠揭示不同微生物群落之間的區(qū)別。本實(shí)施例作為同樣基于毛細(xì)管電泳的方法，也具有高通量、高重復(fù)性和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)能夠?qū)γ盖械玫降娜肯拗菩云味鄳B(tài)性進(jìn)行分析，因而能夠得到更多的信息量，從而能夠?qū)ξ⑸锶郝涞慕Y(jié)構(gòu)作比較全面的分析。綜上所述，上述實(shí)施例結(jié)合了限制性酶切多樣性分析和毛細(xì)管電泳技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，既能夠全面深入地分析微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能，又具有高通量、高靈敏度和高穩(wěn)定性的特征，因而能夠同時(shí)對(duì)大量的微生物群落樣品進(jìn)行分析，比較微生物群落結(jié)構(gòu)的遺傳多樣性，也能夠快速靈敏地檢測(cè)生態(tài)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)變化。權(quán)利要求1、一種利用熒光標(biāo)記酶切基因進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，提取樣本的基因組總DNA，擴(kuò)增微生物系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因；步驟二，利用限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增得到的標(biāo)記基因進(jìn)行酶切，得到帶有粘性末端的限制性片段；步驟三，對(duì)所有限制性片段進(jìn)行末端熒光標(biāo)記；步驟四，運(yùn)用DNA遺傳分析儀分離并檢測(cè)已被末端熒光標(biāo)記的限制性片段，得到樣本的微生物組成信息圖譜；步驟五，對(duì)信息圖譜進(jìn)行多元變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，獲得微生物群落結(jié)構(gòu)信息特征與變化規(guī)律。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用熒光標(biāo)記酶切基因進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析的方法，其特征是，步驟二中，所述酶切具體為，采用4核苷酸識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)標(biāo)記基因進(jìn)行酶切，獲得具有粘性末端的酶切片段。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用熒光標(biāo)記酶切基因進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析的方法，其特征是，步驟三中，所述末端熒光標(biāo)記具體為，使用DNApolymeraseKlenow酶進(jìn)行熒光標(biāo)記，標(biāo)記所用的底物是與酶切后得到的粘性末端堿基互補(bǔ)配對(duì)的脫氧單核苷酸。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用熒光標(biāo)記酶切基因進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析的方法，其特征是，步驟四中，所述分離并檢測(cè)具體為，利用DNA遺傳分析儀進(jìn)行檢測(cè)。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用熒光標(biāo)記酶切基因進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析的方法，其特征是，步驟五中，所述多元變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為主成分分析。全文摘要一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的利用熒光標(biāo)記酶切基因進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析的方法，包括如下步驟提取樣本的基因組總DNA，擴(kuò)增微生物系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因；利用限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增得到的標(biāo)記基因進(jìn)行酶切，得到帶有粘性末端的限制性片段；對(duì)所有限制性片段進(jìn)行末端熒光標(biāo)記；運(yùn)用DNA遺傳分析儀分離并檢測(cè)已被末端熒光標(biāo)記的限制性片段，得到樣本的微生物組成信息圖譜；對(duì)信息圖譜進(jìn)行多元變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，獲得微生物群落結(jié)構(gòu)信息特征與變化規(guī)律。本發(fā)明的方法利用了毛細(xì)管電泳的高通量、高靈敏度和高重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效全面地獲得微生物群落結(jié)構(gòu)信息。文檔編號(hào)G01N21/76GK101565750SQ20091005246公開日2009年10月28日申請(qǐng)日期2009年6月4日優(yōu)先權(quán)日2009年6月4日發(fā)明者張曉君,張夢(mèng)暉,王婷婷,趙立平申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)