生物成像方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于分析體外樣本的方法和計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 在很多環(huán)境中實(shí)施體外分析，以便識(shí)別生物樣本如微生物、細(xì)胞和組織培養(yǎng)、細(xì)胞 或亞細(xì)胞提取物、以及純化的分子。使不同物質(zhì)的樣本與它們通常的生物背景隔離且提供 可以使它們?cè)谄渲猩L(zhǎng)的環(huán)境。通常以皮式培養(yǎng)皿的形式提供這種環(huán)境，為了使樣本生長(zhǎng) 將皮式培養(yǎng)皿放置到培養(yǎng)箱中。皮式培養(yǎng)皿通常包括促進(jìn)樣本生長(zhǎng)的微生物學(xué)培養(yǎng)基。理 想情況下，適當(dāng)培養(yǎng)基上的培育引起許多樣本集落（colony)的生長(zhǎng)。通常實(shí)施隨后的集落 分析，以識(shí)別微生物和評(píng)估它們對(duì)抗菌劑的敏感性或抗性。
[0004] 例如，樣本分析的重要部分是識(shí)別集落中的特定的微生物或細(xì)菌的能力。另外，還 可以基于樣本中的微生物的生長(zhǎng)和與應(yīng)用于樣本的任何藥物的相互作用分析利用適當(dāng)?shù)?藥物對(duì)細(xì)菌的處理。
[0005] 通過(guò)有資格的科學(xué)家對(duì)皮式培養(yǎng)皿的視覺(jué)分析實(shí)施許多初步分析。初步的視覺(jué)分 析十分有效，但是由于不同的微生物的形狀、顏色、大小和形態(tài)的巨大多樣性，易于出現(xiàn)可 能難以解釋的人為誤差和不一致性。然而，目測(cè)仍然是目前快速地識(shí)別微生物的最好的方 法之一。另外，因?yàn)樵S多生長(zhǎng)是"隨機(jī)的"，所以模擬微生物生長(zhǎng)和找到適合于所說(shuō)明的上述 多樣性的自動(dòng)化系統(tǒng)，并非易事。
[0006] 已知的培養(yǎng)箱可以包括窗口，可以通過(guò)該窗口觀察樣本，但是通常，將皮式培養(yǎng)皿 取出培養(yǎng)箱，實(shí)施視覺(jué)上的分析。初步的視覺(jué)分析涉及將皮式培養(yǎng)皿拿到光源前面識(shí)別集 落。然后，可以根據(jù)需要在具體的已識(shí)別的集落上實(shí)施更詳細(xì)的化學(xué)和顯微鏡分析方法。
[0007] 在現(xiàn)有技術(shù)中已有生物掃描器，也就是，用于掃描或計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落的設(shè)備。例如， US 2004/0101951和US 2010/0232660都公開了用于掃描生物生長(zhǎng)平皿的生物掃描器，它 們具有不同的結(jié)構(gòu)但是同樣都具有生成平皿的圖像和執(zhí)行這些圖像的分析，以便檢測(cè)生 物生長(zhǎng)的能力。然而，兩者都利用提供正面照射或背面照射的單一光源。實(shí)際上，在US 2004/0101951和US 2010/0232660中都指出了，"某些生物生長(zhǎng)平皿可能僅需要正面照射 或背面照射，但是不是需要兩種照射"。這樣的照射是基本的且不能提供足夠好的品質(zhì)的圖 像以獲得以有效的方式實(shí)施初步分析。
[0008] 存在某些現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)，在所述系統(tǒng)中通過(guò)不同的顏色或波長(zhǎng)的光照射皮式培養(yǎng) 皿中的樣本，以便形成樣本的圖像。通過(guò)適當(dāng)定向的照相機(jī)捕捉該圖像。
[0009] FR2926820公開用于檢測(cè)生物樣本中的至少一種具體的微生物的方法，所述方法 包括，使培養(yǎng)基經(jīng)受至少兩種輻射的步驟，每一種輻射呈現(xiàn)特定的波長(zhǎng)，以及其他步驟。優(yōu) 選地，使用兩種照射系統(tǒng)，每一種照射系統(tǒng)發(fā)出特定波長(zhǎng)的輻射。更具體地，F(xiàn)R2926820的 圖1顯示明顯的頂部照射和紫外線背光照射的組合。然后，將來(lái)自兩種不同的照射的后來(lái) 的組合圖像用于檢測(cè)具體微生物的存在。
[0010] 同樣地，已發(fā)表的日本專利申請(qǐng)，JP2010104301，描述用于檢測(cè)微生物的方法，該 方法包括顯像步驟，以便獲取微生物在其上進(jìn)行生長(zhǎng)的培養(yǎng)基的圖像和集落檢測(cè)步驟，所 述方法也利用頂部照射和背光照射的組合。
[0011] 一旦獲得了生物樣本的圖像，處理技術(shù)就可以用于增強(qiáng)圖像。然而，存在許多與增 強(qiáng)生物樣本的圖像相關(guān)的問(wèn)題。這些問(wèn)題可能涉及下列方面：
[0012] -正在觀察的集落的大小；
[0013]--個(gè)集落與另一個(gè)集落的接近程度；
[0014]-集落的顏色混合；
[0015] _皮式培養(yǎng)皿的性質(zhì)；
[0016]-培養(yǎng)基的性質(zhì)；
[0017] _其他。
[0018] 本發(fā)明的第一個(gè)問(wèn)題涉及集落的鄰近集落的確定，以便提供關(guān)于集落的檢選過(guò)程 的指導(dǎo)?？磥?lái)，需要確定集落周圍的一個(gè)或多個(gè)隔離區(qū)。
[0019] 另一個(gè)問(wèn)題涉及照射偽影的存在，如鏡面反射，其起因于定向照射源的使用?？?來(lái)，存在解決位于生物樣本的圖像中的集落上的照射偽影的問(wèn)題的另外的需求。
[0020] 考慮位于皮式培養(yǎng)皿的外圍的集落，另外的問(wèn)題涉及集落的數(shù)目的確定?？磥?lái)，存 在改進(jìn)生物樣本的圖像中的集落的計(jì)數(shù)方法的需要。
[0021] 本發(fā)明的目標(biāo)
[0022] 本發(fā)明的目標(biāo)是克服所提及的上述問(wèn)題中的至少一些問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023] 本發(fā)明提供如在隨附權(quán)利要求中陳述的方法和計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了用于定義細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)感興趣的對(duì)象周圍的隔離 區(qū)的方法，方法包括下列步驟：
[0025]-利用多個(gè)照射源中的一個(gè)或多個(gè)獲得細(xì)胞培養(yǎng)皿的一個(gè)或多個(gè)圖像，每一個(gè)照 射源能夠從不同的方向照射器皿；
[0026]-選擇圖像或圖像的組合，用于進(jìn)一步處理；
[0027]-應(yīng)用圓形對(duì)象檢測(cè)變換，以識(shí)別細(xì)胞培養(yǎng)皿中的一個(gè)或多個(gè)是大體上圓形的對(duì) 象的感興趣的對(duì)象并確定感興趣的對(duì)象的中心，其中感興趣的圓形對(duì)象代表細(xì)胞培養(yǎng)皿中 隔離的集落；
[0028]-應(yīng)用二值化步驟獲得感興趣的對(duì)象和其他對(duì)象的二值化圖像，其中二值化圖像 的中心對(duì)應(yīng)于感興趣的對(duì)象的中心；
[0029] _重復(fù)地形成半徑不斷增加的同心圓，其中同心圓以二值化圖像的中心為中心；
[0030]-識(shí)別冠狀物（corona)，其中通過(guò)具有連續(xù)的半徑值的兩個(gè)圓圈劃定冠狀物的界 限；
[0031]-對(duì)于每一個(gè)冠狀物：
[0032]_確定位于冠狀物中的任何其他對(duì)象的存在和位置，從而確定其他對(duì)象的存在和 位置；
[0033]-確定定義感興趣的對(duì)象周圍沒(méi)有其他對(duì)象的角扇區(qū)（angularsector)的空隙 角（clearanceangle)，從而定義感興趣的對(duì)象周圍的隔離區(qū)。
[0034]優(yōu)選地，方法還包括提供對(duì)象的檢選模式（picking profile)，其中檢選模式包括 與每一個(gè)冠狀物和相應(yīng)的空隙角相關(guān)的值。
[0035] 優(yōu)選地，方法還包括利用檢選模式聯(lián)合用于檢選過(guò)程的查找表確定用于與查找表 的具體的標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)的集落的檢選過(guò)程的可用性。
[0036] 提供了計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，其包括用于引起可編程的數(shù)據(jù)處理裝置執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明 的第一目標(biāo)的方法的圖像處理步驟，或服務(wù)上面提出的數(shù)據(jù)處理裝置的指令。計(jì)算機(jī)程序 產(chǎn)品可以包括存儲(chǔ)在機(jī)器可讀的存儲(chǔ)介質(zhì)內(nèi)的所述指令。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了用于形成生物樣本的改進(jìn)的圖像的方法，其中 圖像包括像素，每一個(gè)像素具有第一像素值，方法包括下列步驟：
[0038]-利用數(shù)目為N的照射源照射生物樣本；
[0039] _獲取每一個(gè)不同的照射源下的生物樣本的圖像，以獲得N幅圖像；
[0040] -利用已獲得的N幅圖像確定N個(gè)像素值；
[0041]-基于N個(gè)像素值確定校正的像素值；
[0042]-對(duì)于每一個(gè)像素，利用校正的像素值代替第一像素值，以便獲得生物樣本的改進(jìn) 的圖像。
[0043] 優(yōu)選地，方法還包括被均勻地布置在生物樣本周圍的照射源，照射源對(duì)于生物樣 本具有相同的入射角。
[0044] 優(yōu)選地，N幅圖像包括與相應(yīng)的顏色通道相關(guān)的N幅彩色圖像或N幅黑白圖像。
[0045] 優(yōu)選地，校正值是N個(gè)像素值的中間值并且計(jì)算每一個(gè)顏色通道的中間值。
[0046] 提供了計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，包括用于引起可編程的數(shù)據(jù)處理裝置執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的 第二目標(biāo)的方法的圖像處理步驟，或用于服務(wù)上面提到的數(shù)據(jù)處理裝置的指令。計(jì)算機(jī)程 序產(chǎn)品可以包括存儲(chǔ)在機(jī)器可讀的存儲(chǔ)介質(zhì)內(nèi)的所述指令。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了用于確定細(xì)胞培養(yǎng)皿的圖像中的對(duì)象的數(shù)目的方 法，其中包括由對(duì)象和對(duì)象的組組成的元素，方法包括下列步驟：
[0048] _利用照射源的已確定的視圖（view)獲取細(xì)胞培養(yǎng)皿和各個(gè)元素的圖像；
[0049]-應(yīng)用二值化步驟獲得圖像的二值化版本，其中二值化圖像包括內(nèi)部二值化圖像 和外部二值化圖像，其中內(nèi)部二值化圖像對(duì)應(yīng)于細(xì)胞培養(yǎng)皿的內(nèi)部部分，而外部二值化圖 像對(duì)應(yīng)于細(xì)胞培養(yǎng)皿的外部部分；
[0050]-確定每一個(gè)元素在二值化圖像中的位置，以便確定組分是位于內(nèi)部二值化圖像 中還是位于外部二值化圖像中；
[0051]-如果組分位于內(nèi)部二值化圖像中，則利用相應(yīng)的第一像素值代替表示內(nèi)部二值 化圖像中的組分的圖像的像素的像素值，以便獲得第一合成圖像；
[0052]-如果組分位于外部二值化圖像中，則利用相應(yīng)的第二像素值代替表示外部二值 化圖像中的組分的圖像的像素的像素值，以便獲得第二合成圖像；
[0053] _結(jié)合第一合成圖像和第二合成圖像，以便獲得其中合成圖像的像素值取決于像 素與對(duì)象邊緣的接近程度的合成圖像；
[0054] _將分割算法應(yīng)用于合成圖像，以便獲得包括具有可分辨的邊緣的對(duì)象的圖像。
[0055] 優(yōu)選地，二值化步驟包括內(nèi)部二值化步驟和外部二值化步驟。
[0056] 優(yōu)選地，外部二值化步驟包括應(yīng)用形態(tài)關(guān)閉功能獲得生成圖像，其中確定的視圖 是背光視圖。
[0057] 優(yōu)選地，將生成圖像從第一顏色空間變換到第二顏色空間，即，如感覺(jué)更加均勻的 L、a、b顏色空間。
[0058] 優(yōu)選地，通過(guò)利用元素的像素值確定元素的第一像素值，其中確定的視圖是底部 環(huán)形視圖。
[0059] 優(yōu)選地，通過(guò)計(jì)算外部二值化圖像的相應(yīng)像距中的元素的像素值和生成圖像中的 元素的像素值的平均值確定元素的第二像素值。
[0060] 優(yōu)選地，分割算法是分水嶺算法。
[0061] 提供了計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，其包括用于引起可編程的數(shù)據(jù)處理裝置執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明 的第三目標(biāo)的方法的圖像處理步驟，或用于服務(wù)上面提到的數(shù)據(jù)處理裝置的指令。計(jì)算機(jī) 程序產(chǎn)品可以包括存儲(chǔ)在機(jī)器可讀的存儲(chǔ)介質(zhì)內(nèi)的所述指令。
【附圖說(shuō)明】
[0062] 現(xiàn)在，通過(guò)實(shí)例，對(duì)附圖進(jìn)行參考，其中：
[0063]圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的生物分析系統(tǒng)；
[0064]圖2a、2b和2c是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的、圖1的系統(tǒng)的成像系統(tǒng)的示意圖；[0065]圖3是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的、圖2的系統(tǒng)的簡(jiǎn)化圖，顯示應(yīng)用于樣本的不同類 型的照射；
[0066] 圖4a是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的背光照射源的示意圖；
[0067] 圖4b是與垂直照射相關(guān)的漫射器的示意性的前視圖和后視圖表示。
[0068] 圖4c是與環(huán)形照射相關(guān)的漫射器的示意性的前視圖和后視圖表示；
[0069]圖5是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的樣本抽拉框和相關(guān)的近似水平的照射源的示意 圖；
[0070] 圖6是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的環(huán)形照射源的示意圖；
[0071] 圖7是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面顯示用于不同應(yīng)用的不同的照射類型的表格；
[0072] 圖8是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面顯示用于與不同的圖像處理技術(shù)相關(guān)的不同的培 養(yǎng)基的不同的