本發(fā)明屬于生物燃料電池領(lǐng)域，具體是指一種基于微生物表面共展示順序酶的高性能淀粉/氧氣燃料電池。

背景技術(shù)：

淀粉是自然界中廣泛存在的一種多糖，在植物的種子和塊莖中的含量可高達57％-75％。實現(xiàn)淀粉向清潔能源轉(zhuǎn)化具有很高的實際應用價值。工業(yè)上往往采取發(fā)酵技術(shù)將淀粉轉(zhuǎn)化為乙醇和葡萄糖酸，實現(xiàn)淀粉向清潔能源的轉(zhuǎn)化。然而，發(fā)酵過程通常需要在強酸、強堿和高溫等條件下進行，且伴隨著各種副產(chǎn)品，使得乙醇和葡萄糖酸的產(chǎn)率大大降低。

生物燃料電池作為一種將化學能直接轉(zhuǎn)化為電能的裝置，可以將淀粉中的化學能直接轉(zhuǎn)化為電能進行利用，是一種清潔、可再生的能源。然而淀粉是葡萄糖的高聚體，直接將其作為生物燃料電池的燃料產(chǎn)生電能并非易事。以往報道中，有將糖化酶(GA)、α-淀粉酶和葡萄糖氧化酶(GOx)共同固定在電極上，首先將淀粉經(jīng)GA水解為葡萄糖，后葡萄糖在GOx存在下被氧氣催化氧化轉(zhuǎn)化為電能。然而將幾種單一的酶無序地固定在電極上，極大地限制了能量的轉(zhuǎn)化效率。

因此現(xiàn)急需一種高效的酶催化劑，能夠充分獲取淀粉中的能量，得到高性能生物燃料電池。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種基于微生物表面共展示順序酶的高性能淀粉/氧氣燃料電池。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種基于微生物表面共展示順序酶的高性能淀粉/氧氣燃料電池，采用大腸桿菌(E.coli)表面共展示糖化酶(GA)和葡萄糖脫氫酶突變體的基因序列(gdh-m)獲得的順序酶表面共展示系統(tǒng)作為生物陽極催化劑(GA&GDH-E.coli)，漆酶為生物陰極催化劑，分別固定在多壁碳納米管(MWNTs)修飾的玻碳電極上作為生物陽極和生物陰極。

所述生物陽極為在玻碳電極基體表面上依次固定MWNTs、電子介體聚亞甲基藍和作為催化的GA&GDH-E.coli。

具體采用涂覆法將MWNTs修飾在玻碳電極表面，然后進一步修飾電子介體亞甲基藍通過電化學聚合在其表面，最后修飾并固定GA&GDH-E.coli得到生物陽極。

所述GA&GDH-E.coli中糖化酶和葡萄糖脫氫酶的展示比例為3:1。

所述生物陰極為在玻碳電極基體表面上依次固定MWNTs和作為催化的漆酶；將獲得陰極插入至含有電子介體的電解液中。

所述電解液中電子介體為2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)。

所述生物陰極采用涂覆法將MWNTs修飾在玻碳電極表面，然后在MWNTs上滴涂漆酶液并通過戊二醛進行交聯(lián)，即獲得生物陰極。其中，漆酶液為將漆酶溶解至溶液中，溶液為水或PBS緩沖液。

所述電解液為含有4mM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)、0.5mM ABTS以及1.0％(w/w)淀粉的0.2M檸檬酸-Na₂HPO₄(pH＝4.8)緩沖溶液。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明微生物表面共展示順序酶利用基因手段將多種順序酶共同表達在微生物表面，使其可以協(xié)調(diào)地完成一系列催化反應，相較幾種單一的酶羅列在一起具有更高的催化效率。本發(fā)明采用微生物表面共展示順序酶發(fā)展淀粉/氧氣生物燃料電池，將有效的提高電池的能量輸出和穩(wěn)定性，并提高淀粉燃料中能量的利用率，具有十分重要的現(xiàn)實意義；具體是：

1、本發(fā)明采用GA&GDH-E.coli作陽極催化劑，聚亞甲基藍作為電子介體，構(gòu)筑了單室的淀粉/氧氣生物燃料電池。電池的開路電位達0.74V，并在0.44V處獲得了30.1±2.8μW cm^-2的最大輸出能量密度，在連續(xù)運行后表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，并且電池連續(xù)運行8小時，仍能保持其85％以上的最大輸出能量密度。由于GA&GDH-E.coli較純酶具有更高的穩(wěn)定性，導致該淀粉/氧氣燃料電池亦表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。

2、本發(fā)明提供的GA&GDH-E.coli順序酶將淀粉逐級分解、氧化，提高了淀粉燃料在生物陽極的催化氧化效率，實現(xiàn)了淀粉的高效利用，進一步提高了生物燃料電池的輸出功率密度和穩(wěn)定性。

3、本發(fā)明實現(xiàn)了淀粉中能量的高效利用，是一種清潔、可再生的能源，為實現(xiàn)自然界中其它生物質(zhì)燃料的高效利用提供了一條有效途徑。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的基于GA&GDH-E.coli的淀粉/氧氣燃料電池工作原理示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例提供的基于GA&GDH-E.coli的生物陽極在含有1.0％(w/w)淀粉的0.2M檸檬酸-Na₂HPO₄(pH＝4.8)緩沖溶液中不含(a)和含有4mM NAD⁺的循環(huán)伏安曲線。掃速為20mV s^-1。

圖3為本發(fā)明實施例提供的基于漆酶的生物陰極在含有0.5mM ABTS的N₂飽和(a)、空氣飽和(b)和O₂飽和條件下(c)的0.2M檸檬酸-Na₂HPO₄緩沖溶液(pH＝4.8)中的循環(huán)伏安曲線。掃速為20mV s^-1。

圖4為本發(fā)明實施例提供的淀粉/氧氣燃料電池的功率密度圖(4a)和連續(xù)運行穩(wěn)定性(4b)。

具體實施方式

下面通過實施例詳述本發(fā)明涉及的電池，但不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。

實施例1

1)生物陽極的制備

生物陽極催化劑(GA&GDH-E.coli)為采用大腸桿菌(E.coli)表面共展示糖化酶(GA)和葡萄糖脫氫酶突變體的基因序列(gdh-m)獲得的順序酶表面共展示系統(tǒng)；其中，GA和GDH的展示個數(shù)比例為3:1。

上述順序酶表面共展示系統(tǒng)的制備參照公開號為105624077A，名稱為一種順序酶表面共展示系統(tǒng)及其應用的申請案中記載的方式獲得。

首先，將2mg MWNTs加入至1mL DMF中，超聲至分散均勻。裸玻碳電極(內(nèi)徑3mm)依次用0.3μm和0.05μm的氧化鋁粉末拋光打磨至鏡面，拋光打磨后用去離子水沖洗后在體積比1:1混合的無水乙醇和超純水溶液中超聲洗滌，超聲洗滌后用超純水沖洗干凈，并于氮氣條件下晾干，待用。

然后將4μL MWNTs分散液滴涂在預處理的電極表面，室溫晾干，得到MWNTs修飾的玻碳電極。

其次將上述MWNTs修飾的玻碳電極浸泡于0.2mM亞甲基藍溶液中，使亞甲基藍吸附于MWNTs表面，3小時后轉(zhuǎn)移至超純水中再浸泡5min，除去結(jié)合松散的亞甲基藍分子。將得到的電極置于0.2M磷酸緩沖溶液(pH＝6.0)中，在0.85V(vs.SCE)的恒電壓下電聚合60分鐘，在電極表面得到聚亞甲基藍-MWNTs納米復合材料。再將3μL GA&GDH-E.coli滴涂在該電極表面，于4℃冰箱過夜晾干。最后，在最外層滴涂5μL殼聚糖(0.2wt％)用于電極的固定。得到基于GA&GDH-E.coli的生物陽極。

該生物陽極催化淀粉反應的循環(huán)伏安曲線如圖2，在0.4V處得到的氧化電流可達1.96±0.02mA cm^-2。

2)生物陰極的制備

取4μL上述制備生物陽極制備中用到的MWNTs分散液滴涂在預處理的玻碳電極表面，室溫晾干后滴加5μL 0.05wt.％Nafion乙醇溶液，并晾干，然后將4μL漆酶水溶液(10mg mL^-1)滴涂到修飾好的電極上，而后再滴加2μL戊二醛(1wt％)交聯(lián)處理，交聯(lián)后置于4℃冰箱過夜，干燥后得到基于漆酶的生物陰極。

將上述獲得生物陰極進行半電池測試在0.2M檸檬酸-Na₂HPO₄緩沖溶液(pH＝4.8)中進行，并加入0.5mM 2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)作電子介體。

該生物陰極催化氧氣還原的循環(huán)伏安曲線如圖3，氧氣還原的起始電位0.62V，并表現(xiàn)出較高的還原電流。

實施例2

淀粉/氧氣燃料電池的構(gòu)筑和測試

淀粉/氧氣燃料電池的組裝是將修飾好的生物陽極和生物陰極同時浸沒于含有4mM NAD⁺、0.5mM ABTS以及1.0％(w/w)淀粉的0.2M檸檬酸-Na₂HPO₄(pH＝4.8)緩沖溶液中。其能量密度和穩(wěn)定性的測量是在氧氣飽和上述溶液中完成。

檢測過程中上述構(gòu)筑的淀粉/氧氣燃料電池基于GA&GDH-E.coli固定在聚亞甲基藍修飾的MWNTs上作生物陽極，漆酶固定在MWNTs上作生物陰極。淀粉燃料在生物陽極上被GA&GDH-E.coli催化，逐級被分解、氧化為葡萄糖酸內(nèi)酯，放出電子，而氧氣在生物陰極上被漆酶還原產(chǎn)生正電荷。電池對外電路供電，實現(xiàn)淀粉燃料的能量轉(zhuǎn)化。該淀粉/氧氣燃料電池的開路電位可達0.74V，并在0.44V處獲得了30.1±2.8μW cm^-2的最大輸出能量密度。電池連續(xù)運行8小時，仍能保持其85％以上的最大輸出能量密度(圖4)。由于GA&GDH-E.coli較純酶具有更高的穩(wěn)定性，導致該淀粉/氧氣燃料電池亦表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。

綜上所述，本發(fā)明基于GA&GDH-E.coli的淀粉/氧氣燃料電池，其中，GA&GDH-E.coli順序酶高效地將淀粉逐級分解、氧化，提高了淀粉燃料在生物陽極的催化氧化效率，實現(xiàn)了淀粉的高效利用，進一步提高了生物燃料電池的輸出功率密度和穩(wěn)定性。本發(fā)明實現(xiàn)了淀粉中能量的高效利用，是一種清潔、可再生的能源，為實現(xiàn)自然界中其它生物質(zhì)燃料的高效利用提供了一條有效途徑。

上面結(jié)合附圖對本發(fā)明優(yōu)選的具體實施方式和實施例作了詳細的說明，但是本發(fā)明并不限于上述實施方式和實施例，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。