專利名稱:一種纓小蜂體內(nèi)共生沃爾巴克氏細(xì)菌的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及昆蟲體內(nèi)共生菌的分子檢測，具體涉及纓小蜂體內(nèi)共生菌沃爾巴克氏 (Fo^acAia)細(xì)菌的檢測方法。
背景技術(shù)：
纓小蜂隸屬膜翅目纓小蜂科(Mymanidae)，是水稻主要害蟲飛虱卵期一種重要的寄生蜂。纓小蜂群體數(shù)量大、效能高，對(duì)早稻田發(fā)生的灰飛虱、白背飛虱和晚稻田后發(fā)的褐飛虱起顯著的抑制作用。因此，對(duì)纓小蜂的研究在水稻病蟲害生物防治中具有重要意義。現(xiàn)有的研究已經(jīng)表明，寄生蜂體內(nèi)存在著大量的共生微生物，其中沃爾巴克氏(Wolbachia )細(xì)菌分布最廣，它能誘導(dǎo)寄生蜂產(chǎn)雌孤雌生殖和細(xì)胞質(zhì)不親和，引起寄主的生殖行為異常，使寄主后代性比失衡。此外，沃爾巴克氏(rWhdia)細(xì)菌還影響寄生蜂行走和擴(kuò)散能力、寄生率和羽化率、壽命、競爭力和滯育等。對(duì)寄生蜂體內(nèi)共生菌的研究有助于研究人員深入探索寄生蜂和寄主昆蟲之間的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系、攻克寄主防御系統(tǒng)以及調(diào)控寄主生長發(fā)育并正確理解寄生蜂成功進(jìn)化的生態(tài)策略。同時(shí)，對(duì)提高寄生蜂的人工繁育效率、控制農(nóng)林重大害蟲的發(fā)生與危害的潛能均具有重要的理論和實(shí)踐意義。
昆蟲體內(nèi)沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的檢測是最為基礎(chǔ)性的工作，到目前為止， 沃爾巴克氏細(xì)菌(Wolbachia)尚無法在寄主體外進(jìn)行培養(yǎng)，所以很難用傳統(tǒng)微生學(xué)的方法對(duì)沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌進(jìn)行檢測和研究，沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的檢測主要依賴基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的分子生物學(xué)技術(shù)方法。
當(dāng)前常用于研究沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的分子標(biāo)記主要是位于核糖體RNA 基因編碼區(qū)(16S rDNA、23S rDNA、5S rDNA)、核糖體RNA基因非編碼區(qū)(16S和23SrRNA編碼基因間的間隔區(qū)一ITS-I和位于23S和5SrRNA編碼基因間的間隔區(qū)一ITS-2)的序列，以及編碼蛋白的基因序列，如Wsp基因、ftsZ基因等。洪曉月等人公開的中國發(fā)明專利檢測葉螨體內(nèi)共生菌的多重PCR檢測方法(申請(qǐng)?zhí)?009 1 0032015. 5，公開號(hào)CN 101603081 Α)中公開了基于Wsp基因的昆蟲體內(nèi)共生菌沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的檢測方法。上述現(xiàn)有技術(shù)的共同特點(diǎn)在于它們均包含兩個(gè)關(guān)鍵步驟提取昆蟲的總DNA，然后采用適合的分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后可以根據(jù)電泳檢測的結(jié)果或者測序分析的結(jié)果來判斷昆蟲體內(nèi)是否存在共生菌沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌，以及其種類。
現(xiàn)有技術(shù)的缺陷在于影響PCR的因素，如提取的DNA模板質(zhì)量、用于PCR的引物和試劑、PCR反應(yīng)體系、PCR反應(yīng)條件、所用引物對(duì)樣品DNA中目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率等均可能影響到最終的檢測結(jié)果，現(xiàn)有技術(shù)無法在實(shí)驗(yàn)體系中確保檢測結(jié)果不受上述因素的影響， 尤其是在得出陰性的檢測結(jié)果時(shí)。因此，建立一種相對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)幕赑CR的對(duì)昆蟲體內(nèi)沃爾巴克氏(rWhcAia)細(xì)菌檢測的實(shí)驗(yàn)體系，是當(dāng)前研究中需要解決的重要問題。此外，快速、 準(zhǔn)確的確定昆蟲體內(nèi)沃爾巴克氏(Wolbachia )細(xì)菌的種類也是需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
[0006]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，建立一種相對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)幕赑CR的檢測纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏(rwhdia)細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)體系，同時(shí)，該檢測方法的結(jié)果同時(shí)可以快速、準(zhǔn)確的確定昆蟲體內(nèi)沃爾巴克氏(Wolbachia )細(xì)菌的種類。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
以提取獲得的纓小蜂總DNA為模板，采用巢式PCR與DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)，即變性梯度凝膠電泳，技術(shù)結(jié)合的方式進(jìn)行共生菌沃爾巴克氏 (Fo^acAia)細(xì)菌的檢測，具體技術(shù)路線圖如附圖1所示。
在一個(gè)優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的方法為一種纓小蜂體內(nèi)共生沃爾巴克氏細(xì)菌的檢測方法，包括提取纓小蜂總DNA ；擴(kuò)增沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段；對(duì)獲得德沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段進(jìn)行變性梯度凝膠電泳分析；其特征在于所述沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段的擴(kuò)增采用巢式PCR，其具體步驟為 (1)、以提取獲得的纓小蜂DNA為模板，用沃爾巴克氏細(xì)菌的16S rDNA引物99F/994R或者 315F/6^R擴(kuò)增獲得相應(yīng)的基因片段，用細(xì)菌的16S rDNA引物27F/1492R和27F/REUB分別擴(kuò)增獲得纓小蜂體內(nèi)總細(xì)菌和不含沃爾巴克氏細(xì)菌的總細(xì)菌的相應(yīng)基因片段。
在一個(gè)優(yōu)選的方式中，該方法還包括步驟(2)以(1)中擴(kuò)增獲得的纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏細(xì)菌、總細(xì)菌、不含沃爾巴克氏細(xì)菌的總細(xì)菌的16S rDNA的基因片段為模板，采用帶有GC夾子的細(xì)菌16S rDNA V3高變區(qū)引物341F/517R擴(kuò)增相應(yīng)的用于變形梯度凝膠電泳分析的16S rDNA基因片段；所述擴(kuò)增獲得沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段的變性梯度凝膠電泳分析在完全相同的條件下進(jìn)行，以總細(xì)菌的DGGE圖譜作為纓小蜂DNA的提取效果、沃爾巴克氏細(xì)菌的16S rDNA基因片段PCR擴(kuò)增效果的控制性對(duì)照，且以沃爾巴克氏細(xì)菌的16S rDNA基因片段的DGGE圖譜中條帶的測序分析結(jié)果作為纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏細(xì)菌的檢測結(jié)果。優(yōu)選的，GC夾子的序列為SQ10。
優(yōu)選的，所述的方法還包括所述擴(kuò)增獲得的沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段的變性梯度凝膠電泳分析結(jié)果中，以纓小蜂體內(nèi)總細(xì)菌和不含沃爾巴克氏細(xì)菌的總細(xì)菌的相應(yīng)基因片段的變性梯度凝膠電泳的圖譜是否有條帶的差異來初步判斷纓小蜂體內(nèi)是否存在沃爾巴克氏細(xì)菌。
在一些具體的方式中，如下方法巢式PCR擴(kuò)增纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏 iVo Ibachia )細(xì)菌具體步驟為1、用沃爾巴克氏(Jolbachia )細(xì)菌的16S rDNA弓丨物 99F/994R或者315F/6^R擴(kuò)增獲得沃爾巴克氏(Zfo^acAia)細(xì)菌的16S rDNA的基因片段； 用細(xì)菌的16S rDNA引物27F/1492R和27F/REUB分別擴(kuò)增獲得纓小蜂體內(nèi)總細(xì)菌和不含沃爾巴克氏(Fo^acAia)細(xì)菌的總細(xì)菌的16S rDNA的基因片段，其中27F/REUB引物的擴(kuò)增產(chǎn)物再次作為模板，用引物27F/1492R擴(kuò)增獲得不含沃爾巴克氏(rWhdia)細(xì)菌的總細(xì)菌的16S rDNA的基因片段。所述引物的序列為
名稱序列序列編號(hào)99F5’ -TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT-3’SQl994R5’ -GMTAGGTATGATTTTCATGT-3’SQ2315F5’ -GCATGAGTGAAGAAGGCC-3SQ3628R5’ -AGATAGACGCCTTCGCCA-3’SQ427F5’ -GTGCTGCAGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’SQ5REUB5’ -GCCAAGGCATCCACC-3’SQ61492R5’ -CACGGATCCTACGGGTACCTTGTTACGACTT-3’SQ7
4PCR 反應(yīng)總體系為 25 μ L,包括 2. 5 μ L 10XPCR Buffer (包含 20 mmol/L 的 MgCl2), 1 U 的 Taq DNA Polymerase, 2 μ L dNTPs (2. 5 mmol/L each)，正反向弓|物各 0· 4 μ L (10 μ mol/L), DNA 模板 10-20 ng,用 ddH20 補(bǔ)加到 25 μ L。
PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C 4 min，94°C 1 min，51°C 45 s (其中，用 27F/1492R、27F/ REUB引物擴(kuò)增相應(yīng)基因片段時(shí)為55°C )，72°C 45 s (其中，用27F/1492R、27F/REUB引物擴(kuò)增相應(yīng)基因片段時(shí)為1.5 min)，第2 — 4步進(jìn)行31個(gè)循環(huán)，在72°C延伸8 min后停止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測。
2、以步驟1中獲得的纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏(Fo^acAia)細(xì)菌的16S rDNA的基因片段、總細(xì)菌和不含沃爾巴克氏(rWhcAia)細(xì)菌的總細(xì)菌的16S rDNA的基因片段為模板，用帶有GC夾子的細(xì)菌16S rDNA V3高變區(qū)引物341F和517R擴(kuò)增相應(yīng)的16S rDNA V3 高變區(qū)基因片段。其中，所述引物的序列為
34IF 5'-CTACGGGAGGCAGCAG-3' SQ8 517R 5' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3' SQ9 ； 所述GC夾子的序列為
5 ‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCC-3‘ SQlO0
PCR 反應(yīng)總體系為 25 μ L,包括 2. 5 μ L 10XPCR Buffer (包含 20 mmol/L 的 MgCl2), 1 U 的Taq DNA Polymerase, 2 μ L dNTPs(2. 5 mmol/L each)，正反向弓|物各0. 4 μ L (10 μ mol/L), DNA 模板 10-20 ng,用 ddH20 補(bǔ)加到 25 μ L。
PCR 反應(yīng)的程序?yàn)?94°C 4 min，94°C 1 min，55°C 30 s，72°C 40 s，第 2— 4 步進(jìn)行33個(gè)循環(huán)，在72°C延伸8 min后停止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測。
在以上方法中，DGGE分析的具體步驟為
制備聚丙烯酰胺變性梯度膠，分析所用的PAGE(聚丙烯酰胺)膠濃度為8% (質(zhì)量濃度)， 變性梯度為40 %作為對(duì)檢測樣品中是否含有沃爾巴克氏(ro^acAia)細(xì)菌的初步判斷，可以通過比較纓小蜂體內(nèi)總細(xì)菌和不含沃爾巴克氏(Fo^acAia)細(xì)菌的總細(xì)菌的16S rDNA V3 高變區(qū)基因片段產(chǎn)物的DGGE圖譜中條帶的差異來判斷，如果樣品中不含有沃爾巴克氏 (rWhcAia)細(xì)菌，它們的DGGE圖譜應(yīng)完全一致，如果它們的DGGE圖譜有條帶的差異，則可初步判斷纓小蜂體內(nèi)存在沃爾巴克氏OVolbachia)細(xì)菌。
本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果在于采用巢式PCR-DGGE的實(shí)驗(yàn)體系檢測纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌過程中，對(duì)總細(xì)菌的擴(kuò)增和分析結(jié)果是對(duì)影響PCR的因素的控制性對(duì)照，用于表明提取DNA的質(zhì)量、PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系等對(duì)檢測的結(jié)果沒有影響。尤其是當(dāng)樣品中未擴(kuò)增出沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的16S rDNA基因片段產(chǎn)物，而擴(kuò)增獲得了總細(xì)菌和除沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌外總細(xì)菌的16S rDNA基因片段產(chǎn)物，則表明其中確實(shí)不存在沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌。該實(shí)驗(yàn)體系相對(duì)于當(dāng)前其它基于PCR的沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌檢測方法是相對(duì)而言更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臋z測體系。此外，經(jīng)DGGE檢測確定沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的存在后，直接對(duì)DGGE條帶切膠回收、克隆和測序，還可以快速、準(zhǔn)確的提供昆蟲體內(nèi)感染的沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌種類數(shù)和種屬信息，在沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性的分析中也更有實(shí)用價(jià)值。


圖1 巢式PCR-DGGE檢測纓小蜂體內(nèi)共生菌沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌的技術(shù)路線。
圖2 不同纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏(Wolbachia)細(xì)菌、總細(xì)菌、除沃爾巴克氏 (Wolbachia)細(xì)菌外總細(xì)菌16S rDNA V3高變區(qū)基因片段的DGGE結(jié)果。其中，圖中泳道編號(hào)為不同樣品，Tl和T2為采集自浙江纓小蜂在不同溫度下培養(yǎng)物，P5為采集自菲律賓的纓小蜂；分組標(biāo)記表示用于DGGE分析的16S rDNA V3高變區(qū)產(chǎn)物的模板來源于該引物擴(kuò)增基因組DNA的PCR產(chǎn)物；途中條帶的編號(hào)表示切膠的條帶。
圖3 以圖2中切膠回收的條帶1 (band 1)和條帶2 (band 2)的測序結(jié)果構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但應(yīng)該理解本發(fā)明并不受這些內(nèi)容所限制。
實(shí)施實(shí)例
1、本實(shí)施實(shí)例所用的纓小蜂蟲源為稻虱纓小蜂，Tl和T2采自浙江，為不同溫度下培養(yǎng)的樣品，P5采自菲律賓國際水稻研究所試驗(yàn)農(nóng)場稻田，采集的樣品保存于_72°C冰箱備用。
2、基因組DNA提取將低溫保存的稻虱纓小蜂樣品取出，置于潔凈工作臺(tái)解凍。每種稻虱纓小蜂樣品分別取10頭裝入無菌的2 ml離心管中，加入1 mL 70%的乙醇，輕輕晃動(dòng)5 min,隨后用無菌水漂洗3次，重復(fù)該步驟3次以去除稻虱纓小蜂表面的細(xì)菌。
采用DNeasy Blood & Tissue Kit (購買自 Qiagen Corp.)提取稻虱纓小蜂樣品的基因組DNA。將去除表面細(xì)菌的稻虱纓小蜂樣品置于新的無菌的2 mL離心管中，加入 ISOyL的ATL buffer，用無菌的玻璃棒研磨樣品直至肉眼看不到蟲體組織。向離心管中加入20 UL的蛋白酶K，充分混合后放入水浴搖床中，56 °C條件下水浴過夜。隨后步驟參照試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行。提取獲得的DNA樣品用NanoDrop-2000 (Thermo Corp.)測定濃度后置于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>3、稻虱纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏(Jolbachia )細(xì)菌、總細(xì)菌、不含沃爾巴克氏 (Wolbachia)細(xì)菌的總細(xì)菌的16S rDNA V3高變區(qū)基因片段的擴(kuò)增。參照?qǐng)D1中的路線圖， 以提取獲得的Tl、T2、P5樣品總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為25 μ L，包括 2. 5μ L IOXPCR Buffer (包含 20 mmol/L 的 MgCl2), 1 U 的 TransTaq-T DNA Polymerase (TransGen Corp. ),2 μ L dNTPs (2.5 mmol/L each)，正反向引物各 0. 4 μ L( 10 ymol/L),
6DNA 模板 10-20 ng，用 ddH20 補(bǔ)加到 25 μ L。
PCR 反應(yīng)的程序?yàn)?94°C 4 min，94°C 1 min，51°C 45 s (該溫度為用 99F/994R、 315F/628R引物擴(kuò)增相應(yīng)基因片段時(shí)的褪火溫度，用27F/1492R、27F/REUB、GC+341/517R 引物擴(kuò)增相應(yīng)基因片段時(shí)為)，72°C 45 s (該時(shí)間度為用99F/994R、315F/6^R、 GC+341/517R引物擴(kuò)增相應(yīng)基因片段時(shí)的延伸時(shí)間，用27F/1492R、27F/REUB引物擴(kuò)增相應(yīng)基因片段時(shí)為1.5 min)，第2 — 4步進(jìn)行31個(gè)循環(huán)，在72°C延伸8 min后停止反應(yīng)。
PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測，電泳圖經(jīng)Quantity One軟件(Bio-Rad Corp.)數(shù)字化處理，參照電泳時(shí)Marker對(duì)應(yīng)條帶的DNA含量進(jìn)行相對(duì)定量。
4、PCR產(chǎn)物的DGGE分析前述擴(kuò)增獲得的稻虱纓小蜂樣品Tl、T2、P5的沃爾巴克氏(Zfo^acAia)細(xì)菌、總細(xì)菌、除沃爾巴克氏(Zfo^acAia)細(xì)菌外總細(xì)菌的16S rDNA V3 高變區(qū)基因片段產(chǎn)物PCR產(chǎn)物用基因突變檢測系統(tǒng)(Bio-Rad Dcode, USA)分析，用于DGGE 分析的PAGE (聚丙烯酰胺)膠濃度為8 % (質(zhì)量濃度)，變性梯度為40 %5、DGGE條帶的回收、克隆、測序、分析DGGE凝膠中的主要條帶切下后用dd H2O沖洗，搗碎后用30 μ L TE buffer在4°C浸泡過夜，PCR回收的切下的條帶中的DNA。回收條帶的PCR產(chǎn)物再次經(jīng)DGGE檢測以確?；厥諚l帶PCR產(chǎn)物的正確。PCR產(chǎn)物用Sarfr印柱式DNA 膠回收試劑盒(Sangon Corp.)純化后連入PMD18-T載體，轉(zhuǎn)入E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞， 采用菌落PCR檢測陽性克隆，每個(gè)樣品隨機(jī)挑選3個(gè)載有插入片段的陽性克隆送交上海生工公司測序。測序結(jié)果在GenBank中比對(duì)分析，之后用MEGA 4. 1軟件以Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支的bootstrap置信度用1000次自導(dǎo)復(fù)制來評(píng)價(jià)。
6、稻虱纓小蜂樣品T1、T2、P5中沃爾巴克氏(Fo^acAia )細(xì)菌的檢測結(jié)果稻虱纓小蜂樣品Τ1、Τ2、Ρ5的沃爾巴克氏(Fo^acAia)細(xì)菌16S rDNA基因片段的DGGE圖譜顯示， 3個(gè)樣品均有明顯的1個(gè)優(yōu)勢(shì)條帶，如圖2所示。其中，對(duì)圖2中編號(hào)為條帶1 (band 1)和 2 (band 2) DNA進(jìn)行割膠回收、克隆后的測序結(jié)果條帶1的序列(SQ11) (band 1)為
5’-CTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCATGAGTG AAGAAGGCCTTTGGGTTGTAAAGCTCTTTTAGTGAGGAAGATAATGACGGTACTCACAGAAGAAGTCCTGGCTAACT CCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT-3'
條帶2的序列(band 2)為(SQ12)
5’-CTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCATGAGTG AAGAAGGCCTTTGGGTTGTAAAGCTCTTTTAGTGAGGGAGATAATGACGGTACTCACAGAAGAAGTCCTGGCTAACT CCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT-3'
經(jīng)GenBank中比對(duì)分析后用MEGA 4. 1軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹， 如圖3所示，條帶1 (band 1)和2 (band 2)均與已知的沃爾巴克氏(Zfo^acAia)細(xì)菌16S rDNA序列相似，表明band 1和band 2代表的細(xì)菌是沃爾巴克氏(Fo^acAia)細(xì)菌，由此可以確定稻虱纓小蜂樣品Tl、T2、P5中均含有沃爾巴克氏(Fo^acAia)細(xì)菌。
稻虱纓小蜂Tl、T2、P5中總細(xì)菌和除沃爾巴克氏(Zfo^acAia)細(xì)菌外總細(xì)菌的DGGE圖譜(如圖2)顯示，它們大多數(shù)條帶完全相同，但在對(duì)應(yīng)切膠條帶1和2的位置有一定的差異，其中樣品P5的差異較為明顯，這與稻虱纓小蜂樣品中沃爾巴克氏(rWhdia) 細(xì)菌的含量有一定的關(guān)系。從各樣品總細(xì)菌和除沃爾巴克氏(Volbachia )細(xì)菌外總細(xì)菌的 DGGE圖譜的差異，可以初步判斷各樣品中存在沃爾巴克氏(rWhcAia)細(xì)菌，這與最終的測序分析結(jié)果也是一致的。
權(quán)利要求
1.一種纓小蜂體內(nèi)共生沃爾巴克氏細(xì)菌的檢測方法，包括提取纓小蜂總DNA;擴(kuò)增沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段對(duì)獲得沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段進(jìn)行變性梯度凝膠電泳分析；其特征在于所述沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA 基因片段的擴(kuò)增采用巢式PCR，其具體步驟為(1)、以提取獲得的纓小蜂DNA為模板，用沃爾巴克氏細(xì)菌的16S rDNA引物99F/994R或者315F/628R擴(kuò)增獲得相應(yīng)的基因片段，用細(xì)菌的16S rDNA引物27F/1492R和27F/REUB分別擴(kuò)增獲得纓小蜂體內(nèi)總細(xì)菌和不含沃爾巴克氏細(xì)菌的總細(xì)菌的相應(yīng)基因片段。
2.根據(jù)權(quán)力要求1所述的方法，該方法還包括步驟(2):以(1)中擴(kuò)增獲得的纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏細(xì)菌、總細(xì)菌、不含沃爾巴克氏細(xì)菌的總細(xì)菌的16S rDNA的基因片段為模板， 采用帶有GC夾子的細(xì)菌16S rDNA V3高變區(qū)引物341F/517R擴(kuò)增相應(yīng)的用于變形梯度凝膠電泳分析的16S rDNA基因片段；所述擴(kuò)增獲得沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌16S rDNA基因片段的變性梯度凝膠電泳分析在完全相同的條件下進(jìn)行，以總細(xì)菌的DGGE圖譜作為纓小蜂DNA 的提取效果、沃爾巴克氏細(xì)菌的16S rDNA基因片段PCR擴(kuò)增效果的控制性對(duì)照，且以沃爾巴克氏細(xì)菌的16S rDNA基因片段的DGGE圖譜中條帶的測序分析結(jié)果作為纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏細(xì)菌的檢測結(jié)果。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述擴(kuò)增獲得的沃爾巴克氏細(xì)菌和細(xì)菌 16S rDNA基因片段的變性梯度凝膠電泳分析結(jié)果中，以纓小蜂體內(nèi)總細(xì)菌和不含沃爾巴克氏細(xì)菌的總細(xì)菌的相應(yīng)基因片段的變性梯度凝膠電泳的圖譜是否有條帶的差異來初步判斷纓小蜂體內(nèi)是否存在沃爾巴克氏細(xì)菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，GC夾子的序列為SQ10。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，制備聚丙烯酰胺為所述的變性梯度膠，分析所用的聚丙烯酰胺膠濃度為8% (質(zhì)量濃度)，變性梯度為40 %專利摘要
本發(fā)明提供一種纓小蜂體內(nèi)共生菌沃爾巴克氏細(xì)菌群的檢測方法，具體包括以下幾個(gè)步驟提取纓小蜂樣品的總DNA，采用巢式PCR擴(kuò)增纓小蜂樣品中沃爾巴克氏細(xì)菌、總細(xì)菌和除沃爾巴克氏細(xì)菌外總細(xì)菌的16SrDNAV3高變區(qū)的基因片段，然后進(jìn)行DGGE(變性梯度凝膠電泳)分析，通過DGGE圖譜的分析和DGGE條帶的回收、克隆和測序分析，可以檢測纓小蜂樣品中的沃爾巴克氏細(xì)菌。該方法提供了一種相對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)幕赑CR的檢測纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏細(xì)菌的技術(shù)方法，還可以快速、準(zhǔn)確的確定纓小蜂體內(nèi)沃爾巴克氏細(xì)菌的種類，對(duì)當(dāng)前昆蟲體內(nèi)共生沃爾巴克氏細(xì)菌的檢測和相關(guān)研究具有重要促進(jìn)意義和實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/04GKCN102443635SQ201110368959
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年11月18日
發(fā)明者劉淑平, 呂仲賢, 徐紅星, 楊亞軍, 湯江武, 王新, 鄭許松 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan