專利名稱:一種基于兩階段溶氧控制策略生產(chǎn)凝乳酶的方法
一種基于兩階段溶氧控制策略生產(chǎn)凝乳酶的方法技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]一種基于兩階段溶氧控制策略生產(chǎn)凝乳酶的方法，具體的說是在發(fā)酵過程中，不同的發(fā)酵階段采取不同的體積傳質(zhì)系數(shù)(κ^)，從而提高凝乳酶的發(fā)酵水平，本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
[0002]凝乳酶是乳酪生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶，它使原奶凝固分為兩個(gè)階段酪蛋白微膠粒中 α-酪蛋白和酪蛋白在κ-酪蛋白作用下不會(huì)發(fā)生自發(fā)凝結(jié)，首先凝乳酶專一性的將 κ -酪蛋白分解為ρ- κ -酪蛋白和一種巨肽，使酪蛋白的微膠粒失去穩(wěn)定性；然后在Ca2+作用下ρ-Κ-酪蛋白及α-酪蛋白和β-酪蛋白之間形成化學(xué)鍵從而形成沉淀。[0003]目前凝乳酶的主要來源有動(dòng)物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶。傳統(tǒng)上，凝乳酶是利用牛犢第四胃(皺胃)提取制作，隨著乳酪產(chǎn)業(yè)不斷擴(kuò)大，單純靠宰殺幼畜的方法來生產(chǎn)凝乳酶已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代工業(yè)對(duì)凝乳酶的需求。動(dòng)物性凝乳酶的短缺以及植物性凝乳酶自身特性的缺點(diǎn)，使得微生物凝乳酶成為未來凝乳酶行業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。微生物凝乳酶又可分為真菌和細(xì)菌來源的凝乳酶，與真菌固體發(fā)酵相比，細(xì)菌液體發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶具有生長周期短、生產(chǎn)成本低、易于控制生長條件等諸多優(yōu)點(diǎn)，近幾年得到研究者更多的關(guān)注。但是，如何提高發(fā)酵水平，縮短發(fā)酵時(shí)間還處在進(jìn)一步的研究當(dāng)中。
發(fā)明內(nèi)容
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種基于兩階段溶氧控制策略的用以提高解淀粉芽孢桿 ■ iBaciUus amyloliquefacines)產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵水平、縮短發(fā)酵時(shí)間的方法。[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案一種基于兩階段溶氧控制策略生產(chǎn)凝乳酶的方法，采用解淀粉芽孢桿菌(feci/^As amyloliquefacines) CCTCC NO =M 2011045 為生產(chǎn)菌株，所用發(fā)酵培養(yǎng)基以克/升計(jì)為葡萄糖15，麩皮25，氯化鈉6，七水硫酸鎂4. 5，磷酸二氫鉀1，碳酸鈣3，用自來水配制，pH值自然，121 °C滅菌30 min;接種量為體積百分比0. ，發(fā)酵溫度為 35°C ；發(fā)酵第一階段0-1 將氧體積傳質(zhì)系數(shù)控制在72. 2 h—1，發(fā)酵第二階段16 h以后，將氧體積傳質(zhì)系數(shù)K^控制在33. 9 h—1。[0006]本發(fā)明采用的菌種為解淀粉芽孢桿菌(Mcillus amyloliquefacines^ JNU002, 在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)CCTCC NO =M 2011045。該菌株由本發(fā)明的部分發(fā)明人選育，該菌株以及利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法已申請(qǐng)中國專利，申請(qǐng)?zhí)?201110091892. 7，公開號(hào)CN 102191203 A。[0007]本發(fā)明中Kp值的測(cè)定采用參考文獻(xiàn)(倫世儀主編，堵國成副主編，《生化工程(第二版)》，中國輕工出版社，2008年)所述的動(dòng)態(tài)法用溶氧電極測(cè)定K^。[0008]本發(fā)明所涉及的培養(yǎng)與發(fā)酵所用的斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基，以及斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)的條件采用公開號(hào)為CN 102191203 A所提供的方法。[0009]本發(fā)明在發(fā)酵過程中所采用的發(fā)酵溫度為35°C，接種量為0. 2%(體積百分比)。[0010]凝乳酶活力的測(cè)定用O.Olmol/L氯化鈣溶液配制質(zhì)量濃度12%脫脂奶粉溶液，室溫放置40min后使用，當(dāng)天配制。取5 mL 12%的脫脂奶粉溶液在35°C水浴鍋中保溫lOmin， 加適量35°C預(yù)熱IOmin的酶液(發(fā)酵液5000rpm離心5min獲得之清液)，立即搖勻，開始計(jì)時(shí)，把試管傾斜45°，旋轉(zhuǎn)試管，觀察壁上出現(xiàn)絮狀沉淀時(shí)為凝乳終點(diǎn)，記錄凝乳時(shí)間。 40min凝固ImL脫脂乳的酶量定義為一個(gè)索氏單位(Soxhlet Unit，SU)。te—.4·, 2400>: Κ iHBftitiiIR (isl)秘聯(lián)位粘‘賭乳對(duì)同(u ^tsM ^mL)[0011]本發(fā)明的有益效果采用本發(fā)明提供的方法，可以有效的提高解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶水平，同時(shí)縮短發(fā)酵時(shí)間18小時(shí)以上。此外，氧體積傳質(zhì)系數(shù)(Kp)是本領(lǐng)域進(jìn)行規(guī)模放大的重要參數(shù)，本發(fā)明以氧體積傳質(zhì)系數(shù)(Kp)作為控制指標(biāo)所建立的溶氧控制策略， 同其它的溶氧控制方法相比，在實(shí)際的工業(yè)放大過程中提供了一種更為有效的方法。
具體實(shí)施方式
[0012]在下面所述的所有具體實(shí)施例中，所有的發(fā)酵均在7升發(fā)酵罐中進(jìn)行 (Bioflo-415 New Brunswick Scientific Co., U. S. A)，在發(fā)酵過程中攪拌轉(zhuǎn)速保持在 500 轉(zhuǎn)/分鐘。如無特殊說明，所用方法均為本領(lǐng)域常用方法。[0013]對(duì)照實(shí)施例1 解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO =M 2011045在氧體積傳質(zhì)系數(shù)(Kp)為 33. Qh-1條件下發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶。[0014](1)斜面培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO =M 2011045接種于斜面培養(yǎng)基上，在 32°C下培養(yǎng)M小時(shí)。所用斜面培養(yǎng)基為(單位為克/升):葡萄糖20，酵母膏10，瓊脂條20， 用自來水配制，pH值自然，115°C滅菌20分鐘。[0015](2)種子培養(yǎng)將斜面長好的菌種用接種環(huán)取一環(huán)接入種子培養(yǎng)基中，在35°C培養(yǎng)12小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘。所用種子培養(yǎng)基為(單位為克/升)麩皮30，氯化鈉 5，七水硫酸鎂5，磷酸二氫鉀2，碳酸鈣3，用自來水配制，pH值自然；每250毫升三角瓶裝 30毫升種子培養(yǎng)基，121°C滅菌30分鐘。[0016](3)液體發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子9毫升接入發(fā)酵罐中，其中發(fā)酵培養(yǎng)基為4. 5 升，控制氧體積傳質(zhì)系數(shù)(Kp)在33. 9 h—1，在35°C培養(yǎng)。所用發(fā)酵培養(yǎng)基為(單位為克/升): 葡萄糖15，麩皮25，氯化鈉6，七水硫酸鎂4. 5，磷酸二氫鉀1，碳酸鈣3，用自來水配制，pH 值自然，121 °C滅菌30 min0發(fā)酵培養(yǎng)60 h，發(fā)酵液中的凝乳酶活力達(dá)到最高值6366 SU/mLo[0017]對(duì)照實(shí)施例2 解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO =M 2011045在氧體積傳質(zhì)系數(shù)(Kp)為 72. 2 h—1條件下發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶。[0018]將培養(yǎng)好的種子9毫升接入發(fā)酵罐中，其中發(fā)酵培養(yǎng)基為4. 5升，控制氧體積傳質(zhì)系數(shù)(Kp)在72. 2 h—1。其他條件同對(duì)照實(shí)施例1。發(fā)酵培養(yǎng)M h，發(fā)酵液中凝乳酶活力達(dá)到最高值5896 SU/mL。[0019]實(shí)施例解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO =M 2011045在二級(jí)溶氧控制條件下發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶。[0020]將培養(yǎng)好的種子9毫升接入發(fā)酵罐中，其中發(fā)酵培養(yǎng)基為4. 5升，發(fā)酵前16 h控制氧體積傳質(zhì)系數(shù)(Kp)在72. 21^,16 h后控制氧體積傳質(zhì)系數(shù)(Kp)在33. 9 h—1。其他條件同對(duì)照實(shí)施例1。發(fā)酵培養(yǎng)36 h，發(fā)酵液中凝乳酶活力達(dá)到最高值6590 SU/mL。 以上已詳細(xì)描述了本發(fā)明的實(shí)施方案，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很顯然可以做很多改進(jìn)和變化而不會(huì)背離本發(fā)明的基本精神。所有這些變化和改進(jìn)都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種基于兩階段溶氧控制策略生產(chǎn)凝乳酶的方法，其特征在于采用解淀粉芽孢桿菌 {Bacillus amyloliquefacines)CCTCC NO =M 2011045 為生產(chǎn)菌株，所用發(fā)酵培養(yǎng)基以克 / 升計(jì)為葡萄糖5-20，麩皮10-30，氯化鈉6，七水硫酸鎂4. 5，磷酸二氫鉀1，碳酸鈣3，用自來水配制，PH值自然，121 °C滅菌30 min;接種量為體積百分比0.2%，發(fā)酵溫度為35°C;發(fā)酵第一階段0-1 將氧體積傳質(zhì)系數(shù)K盧控制在72. 2 h—1，發(fā)酵第二階段16 h以后，將氧體積傳質(zhì)系數(shù)Kp控制在33. 9 h—1。
專利摘要
一種基于兩階段溶氧控制策略生產(chǎn)凝乳酶的方法，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明采用解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefacines)CCTCCNOM2011045為生產(chǎn)菌株，所用發(fā)酵培養(yǎng)基以克/升計(jì)為葡萄糖5-20，麩皮10-30，氯化鈉6，七水硫酸鎂4.5，磷酸二氫鉀1，碳酸鈣3，用自來水配制，pH值自然，121℃滅菌30min；在發(fā)酵第一階段(0-16h)將氧體積傳質(zhì)系數(shù)(KLa)控制在72.2h-1，發(fā)酵第二階段(16h以后)，將氧體積傳質(zhì)系數(shù)(KLa)控制在33.9h-1。采用本發(fā)明提供的方法，可以有效的提高解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶水平，縮短發(fā)酵時(shí)間18小時(shí)以上，同時(shí)也為在實(shí)際的工業(yè)放大過程中提供了一種更為有效的方法。
文檔編號(hào)C12R1/07GKCN102517269SQ201110420007
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月15日
發(fā)明者丁明亮, 丁重陽, 張梁, 王博達(dá), 石貴陽, 顧正華 申請(qǐng)人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan