牛pparg基因轉(zhuǎn)錄水平熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及牛PPARG基因轉(zhuǎn)錄水平熒光定量PCR檢測(cè)試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR)是DNA體外操作技術(shù)中最常 用的技術(shù)。PCR技術(shù)將模板DNA、特異引物、dNTPs底物、耐熱DNA聚合酶、鎂離子等放在同 一個(gè)緩沖反應(yīng)體系中，進(jìn)行反復(fù)高溫變性、低溫退火、中溫鏈延伸的熱循環(huán)，實(shí)現(xiàn)靶DNA片 段在反應(yīng)液中呈2n倍擴(kuò)增(其中n為熱循環(huán)次數(shù))。
[0003] 熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)和計(jì)算機(jī) 分析技術(shù)所發(fā)展起來(lái)的基因定量方法。熒光定量PCR在普通PCR反應(yīng)體系中加入特定的熒 光標(biāo)記物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)熱循環(huán)后PCR反應(yīng)體系中的熒光值的變化情況來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA 的量變情況，并獲得每個(gè)樣本的熒光定量變化曲線，進(jìn)而獲得每個(gè)反應(yīng)管的Ct值(熒光變 化達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù));同時(shí)，在相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下檢測(cè)2-10個(gè)倍數(shù)稀釋的已 知數(shù)量的靶標(biāo)DNA，獲得其Ct值，以起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn) 曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和各個(gè)標(biāo)本的Ct值對(duì)每個(gè)反應(yīng)的起始DNA模板數(shù)進(jìn)行定量測(cè)定。
[0004] SYBR Green是一種結(jié)合于雙鏈DNA小溝中的結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光 大大增強(qiáng)，這種性質(zhì)使其應(yīng)用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)非常理想。SYBR Green的最大吸收波長(zhǎng)約 為497nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約為520 nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR 熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而沒(méi)有摻入鏈中的SYBR染料分子不 會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
[0005] Northern blot技術(shù)可檢測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄水平，但整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作比較復(fù)雜。 Northern blot實(shí)驗(yàn)中一個(gè)主要的問(wèn)題是RNA容易降解，所以Northern Blot中所有的實(shí) 驗(yàn)用品都需要經(jīng)過(guò)除去RNA酶的過(guò)程，如高溫烘烤、DEPC處理等，這使實(shí)驗(yàn)過(guò)程變得比較繁 瑣。另外，Northern Blot中很多實(shí)驗(yàn)用品如甲醛、EB、DEPC、紫外燈等等對(duì)人體都有一定的 傷害。
[0006] 基因芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)雖然降低了實(shí)驗(yàn)人員的工作量，并可以在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè) 幾千個(gè)基因表達(dá)量變化，但是其靈敏度較低。
[0007] SYBR Green在核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)方面有很多優(yōu)點(diǎn)，由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié) 合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此設(shè)計(jì)的程序通用性好，且價(jià)格相對(duì)較低。此外，由于 一個(gè)PCR產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合，因此SRYB Green的靈敏度很高。但是，由于SYRB Green與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引 起的假陽(yáng)性會(huì)影響定量的精確性。通過(guò)測(cè)量升高溫度后熒光值的變化可以幫助降低非特異 產(chǎn)物對(duì)定量結(jié)果的影響。由解鏈曲線來(lái)分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBR Green得到 的定量結(jié)果。
[0008] 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 y (Peroxisome Proliferator-Activated Rec印tor Gamma，PPARG)又稱格列酮受體，存在于動(dòng)物的巨噬細(xì)胞、結(jié)腸和脂肪組織中，主 要功能為調(diào)節(jié)脂肪酸存儲(chǔ)和葡萄糖代謝，參與動(dòng)物的脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)代謝、糖代謝和 炎癥反應(yīng)。PPARG通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因刺激脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)攝取和脂肪形成。因此，對(duì)動(dòng)物 PPARG基因的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)有助于監(jiān)測(cè)動(dòng)物的糖類和脂類的代謝水平，進(jìn)一步對(duì)動(dòng)物的生 長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)有所了解。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種操作簡(jiǎn)便、快速， 且能夠定量檢測(cè)不同牛種(包括奶牛、黃牛和牦牛）過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體Y (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma，PPARG)基因轉(zhuǎn)錄水平的焚光定 量PCR檢測(cè)試劑盒。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：用于檢測(cè)牛PPARG基因轉(zhuǎn)錄水平 的引物對(duì)，是由引物一和引物二組成的，所述引物一如序列表中序列1所示，所述引物二如 序列表中序列2所示。
[0011] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供用于檢測(cè)牛PPARG基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑盒，包括有以 下試劑：2XSYBR GREEN MIX、標(biāo)準(zhǔn)PPARG基因模板、上述的引物對(duì)和超純水。
[0012] 進(jìn)一步的，上述的用于檢測(cè)牛PPARG基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑盒，所述試劑盒中， 2XSYBR GREEN MIX、標(biāo)準(zhǔn)PPARG基因模板、上述的引物對(duì)和超純水的配比為5mL :500 y L : 500 u L ：5mL〇
[0013] 進(jìn)一步的，上述的用于檢測(cè)牛PPARG基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑盒，所述2 XSYBR GREEN MIX由以下試劑組成：Taq DNA聚合酶0? 1U/ y L、dNTPs底物0? 4 mmol/L、Mg2+ 5. 0mmol/L、 KC1 100mmol/L、Tris.HCl 20mmol/L、明膠0.02%、SYBR Green染料。
[0014] 進(jìn)一步的，上述的用于檢測(cè)牛PPARG基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑盒，所述標(biāo)準(zhǔn)PPARG基因 模板如序列表中序列3所示，標(biāo)準(zhǔn)PPARG基因模板的濃度為0. 8 y mol/L。
[0015] 進(jìn)一步的，上述的用于檢測(cè)牛PPARG基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑盒，上述的引物對(duì)組成 的引物混合液中，引物一的濃度為8 ymol/L，引物二的濃度為8 ymol/L〇
[0016] 進(jìn)一步的，上述的用于檢測(cè)牛PPARG基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑盒，所述超純水的純度 大于 18. 25 MQ. cm。
[0017] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了用于檢測(cè)牛PPARG基因轉(zhuǎn)錄水平的熒光定量PCR檢 測(cè)方法，包括以下步驟： 1) 配制熒光定量PCR反應(yīng)預(yù)混液：取2XSYBR GREEN MIX 1000 yL、上述的引物對(duì)組成 的引物混合液100 y L、超純水800 y L充分混勻，配制得到1900 y L的熒光定量PCR反應(yīng)預(yù) 混液； 2) 將步驟1)得到的熒光定量PCR反應(yīng)預(yù)混液按19 y L/管分裝成100小管，加至熒光 定量專用PCR反應(yīng)管或反應(yīng)板中； 3) 配制10E-l、10E-2、10E-3、10E-4、10E-5系列稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)PPARG基因模板，以及未 稀釋的標(biāo)準(zhǔn)PPARG基因模板，共6種，每種10 y L，用于檢測(cè)基因的擴(kuò)增效率； 4) 熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增：每個(gè)裝有19 y L熒光定量PCR反應(yīng)預(yù)混液的反應(yīng)管或反應(yīng) 板中分別加入1 y L待測(cè)cDNA、作為陰性對(duì)照的超純水或作為陽(yáng)性對(duì)照和計(jì)算擴(kuò)增效率標(biāo) 準(zhǔn)的PPARG基因模板，震蕩混勻，瞬時(shí)離心后上機(jī)到熒光定量PCR儀中，95°C下變性30秒， 然后按95 °C 5秒，55. 2°C 20秒熱循環(huán)40次，并在55. 2°C時(shí)檢測(cè)記錄熒光信號(hào)； 5) PCR反應(yīng)結(jié)束后，讀取各個(gè)反應(yīng)的Ct值用以定量分析；同時(shí)于3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行 PCR產(chǎn)物電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)下觀察，灰度掃描分析記錄各PCR反應(yīng)的結(jié)果。
[0018] 進(jìn)一步的，上述的用于檢測(cè)牛PPARG基因轉(zhuǎn)錄水平的熒光定量PCR檢測(cè)方法，所述 步驟4)中，裝有19 yL熒光定量PCR反應(yīng)預(yù)混液的100個(gè)小管中，其中1管加入作為陰性 對(duì)照的超純水、6管加入作為陽(yáng)性對(duì)照和計(jì)算擴(kuò)增效率標(biāo)準(zhǔn)的PPARG基因模板，其余小管加 入待測(cè)cDNA。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的試劑盒，可以有效檢測(cè)不同牛種、不同組織、 不同時(shí)期的PPARG基因的mRNA表達(dá)狀態(tài)和表達(dá)量，同時(shí)可以鑒定該基因與動(dòng)物的糖類和脂 類的代謝水平的相關(guān)性，以滿足生命科學(xué)、動(dòng)物醫(yī)學(xué)和動(dòng)物科學(xué)研究者的檢測(cè)需要。與現(xiàn)有 技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了方便快捷的檢測(cè)PPARG基因轉(zhuǎn)錄水平的目 的；2、本發(fā)明在檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平方面具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、實(shí)驗(yàn)成本低的優(yōu)勢(shì)。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為PPARG基因轉(zhuǎn)錄水平熒光檢測(cè)結(jié)果的擴(kuò)增曲線。
[0021] 其中，橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)為相對(duì)焚光量值（Relative Fluorescence Units，RFU)，擴(kuò)增曲線結(jié)果表明PPARG基因熒光信號(hào)值符合標(biāo)準(zhǔn)的"S"型曲線。
[0022] 圖2為PPARG基因轉(zhuǎn)錄水平熒光檢測(cè)結(jié)果的熔解曲線。