豬德?tīng)査跔畈《緹晒舛縫cr檢測(cè)試劑盒及非診斷性檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及豬德?tīng)査跔畈《緹晒?定量PCR檢測(cè)試劑盒及非診斷性檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬丁型冠狀病毒又稱(chēng)豬德?tīng)査跔畈《荆≒DCoV)，是一種新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒， 2009-2010年H)CoV在中國(guó)香港首次報(bào)道該病毒。2014年初，在美國(guó)首次報(bào)道發(fā)病豬群，此后 至少有19個(gè)州有該新型冠狀病毒的報(bào)道。
[0003] 目前檢測(cè)豬德?tīng)査跔畈《舅捎玫姆椒ㄖ饕€是傳統(tǒng)常規(guī)的病毒分離培養(yǎng)觀(guān) 察鑒定、Elisa方法及普通PCR檢測(cè)。傳統(tǒng)常規(guī)的分離培養(yǎng)鑒定法，操作煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、漏診率 高;ELISA方法相對(duì)簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)于微量或雜質(zhì)較多的樣品，其特異性和靈敏度較低，可 能造成誤判。PCR作為一種新型的分子生物學(xué)技術(shù)，自誕生以來(lái)，由于它的特異性、敏感性 高，能在短時(shí)間內(nèi)得到大量的目的片段，使之成為當(dāng)今發(fā)明研究的重要手段之一。但常規(guī)的 PCR在操作中容易造成污染，假陽(yáng)性較高，使之在檢測(cè)上受到一些限制。因此，有必要建立一 種快速、靈敏、準(zhǔn)確度高的豬德?tīng)査跔畈《緳z測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供豬德?tīng)査跔畈《緹晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，使其能夠 快速、有效地對(duì)豬德?tīng)査跔畈《具M(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確性、特異性和敏感性高，穩(wěn)定性好。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 豬德?tīng)査跔畈《緹晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括 具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探針:上游引物:5 ' -AGCCACCCACCAAACCAA-3 '，下游引 物：5 ' -TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3 '，Taqman探針：5 ' -TAAGGACAAGAAGCCTGAC-3 '。
[0007] 作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述Taqman探針的核苷酸序列的3'端標(biāo)記MGB焚光淬滅基團(tuán)。
[0008] 所述Taqman探針的核苷酸序列的5 '端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)。
[0009] 所述試劑盒還包括酶混合物，所述酶混合物包含HotMaster Taq DNA polymerase 和Quant RTase〇
[0010] 所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為豬德?tīng)査跔畈《净蚪McDNA。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供熒光定量PCR檢測(cè)豬德?tīng)査跔畈《镜姆窃\斷性方 法，可對(duì)豬德?tīng)査跔畈《究焖?、有效檢測(cè)，且準(zhǔn)確性、特異性和敏感性高。采用如下技術(shù)方 案：
[0012] 豬德?tīng)査跔畈《緹晒舛縋CR非診斷性檢測(cè)方法，采用具有如下核苷酸序列的 引物和Taqman探針進(jìn)行熒光定量PCR:上游引物：5 ' -AGCCACCCACCAAACCAA-3 '，下游引物： 5 ' -TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3 '，Taqman探針：5 ' -TAAGGACAAGAAGCCTGAC-3 ' 〇
[0013] 作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述Taqman探針的核苷酸序列的3'端標(biāo)記MGB焚光淬滅基團(tuán)。
[0014] 所述Taqman探針的核苷酸序列的5'端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)。
[0015] 所述熒光定量PCR的20μ1反應(yīng)體系包括:上游引物0.4μ1;下游引物0.4μ1; Taqman 探針0·8μ1;檢測(cè)樣品RNA lyl;2XQuant One Step Probe qRT-PCR Master Mix 10μ1; HotMaster Taq DNA polymerase 0·8μ1;Quant RTase 0·28μ1;余量為滅菌去離子水。
[0016] 所述熒光定量PCR反應(yīng)條件為：50 °C 30min，為第一步循環(huán);92 °C 3min，為第二步循 環(huán);92°(：108,601€208,68 1€208為第三步45個(gè)循環(huán)，所述第三步每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行 熒光信號(hào)檢測(cè)。
[0017] 由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0018] (1)本發(fā)明根據(jù)國(guó)內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的CH/SXD1/2015豬德?tīng)査跔畈《局辏℅enbank: KT021234.1)的N基因序列設(shè)計(jì)引物，合成特異性引物及Taqman-MGB探針，采用熒光定量PCR 方法快速靈敏地檢測(cè)豬德?tīng)査跔畈《荆覝?zhǔn)確性、特異性和敏感性高，穩(wěn)定性好。
[0019] (2)本發(fā)明一方面采用了高拷貝的靶基因，一方面采用Taqman-MGB探針熒光定量 PCR檢測(cè)法，使得利用Taqman-MGB探針?lè)晒舛縋CR檢測(cè)豬德?tīng)査跔畈《镜撵`敏度約是 普通PCR的100倍。
[0020] (3)由于采用定量檢測(cè)技術(shù)-Taqman-MGB熒光定量PCR(Real-time PCR)，該方法 (Real-time PCR)具有單管封閉操作防污染、自動(dòng)化程度高、特異性強(qiáng)、可實(shí)時(shí)監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)， 有效地解決了傳統(tǒng)方法只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限。
[0021] (4)由于探針的3'端的淬滅基團(tuán)為不發(fā)光的熒光基團(tuán)，并且與報(bào)告基團(tuán)在空間上 的位置更接近，實(shí)驗(yàn)靈敏度更高，特異性更強(qiáng)。
[0022] (5)Taqman_MGB探針?lè)晒舛縋CR方法簡(jiǎn)便、快速，整個(gè)過(guò)程(包括加樣)可在一 個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，計(jì)算機(jī)自動(dòng)報(bào)告結(jié)果，無(wú)需電泳及其他后續(xù)的工作，即方便了操作又減少了 污染。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 上述僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，以下 結(jié)合附圖與【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0024]圖1是檢測(cè)豬德?tīng)査跔畈《镜臒晒舛縋CR擴(kuò)增曲線(xiàn)。
[0025]圖2是豬德?tīng)査跔畈《綯aqman-MGB探針?lè)晒舛縋CR特異性檢測(cè)結(jié)果；圖中， 1:豬德?tīng)査跔畈《?2:滅菌的去離子水;3:豬流行性腹瀉病毒;4:豬傳染性胃腸炎病毒。 [0026]圖3是豬德?tīng)査跔畈《綯aqman-MGB探針?lè)晒舛縋CR的敏感性檢測(cè)結(jié)果；圖 中，1:1 X 108PFU/mL; 2:1 X 107PFU/mL; 3:1 X 106PFU/mL; 4:1 X 105PFU/mL; 5:1 X 104PFU/mL; 6:1 X 103PFU/mL; 7:1 X 102PFU/mL; 8:1 X lO^FU/mL; 9:陰性樣品（滅菌的去離子水）。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 除非特別指明，以下實(shí)施例中所用毒株由北京億森寶生物科技有限公司保存。
[0028] 除非特別指明，以下實(shí)施例中所用的試劑均為分析純級(jí)試劑，且可從正規(guī)渠道商 購(gòu)獲得。
[0029] 實(shí)施例1熒光定量PCR檢測(cè)豬德?tīng)査跔畈《镜姆窃\斷性方法
[0030] 1、設(shè)計(jì)引物和Taqman-MGB探針
[0031 ] 根據(jù)國(guó)內(nèi)已發(fā)現(xiàn)CH/SXD1 /2015豬德?tīng)査跔畈《局?Genbank: KT021234.1)的N基 因序列，找出豬德?tīng)査跔畈《净蛐蛄械奶禺愋员Ｊ匦蛄?，并設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針。經(jīng)過(guò) 比對(duì)篩選，最終確定一組最佳引物和一條Taqman-MGB探針，目的片段為63bp，其核苷酸序列 為序列表中序列4。
[0032] 上游引物(PDCoV-F) :5'-AGCCACCCACCAAACCAA-3'（序列 1)
[0033] 下游引物(PDCoV-R) :5'-TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3'（序列2)
[0034] Taqman探針（PDCoV-MGB) :5'FAM-TAAGGACAAGAAGCCTGAC-MGB_3'（序列 3) 〇
[0035] 其中探針的5'端標(biāo)記FAM報(bào)告熒光基團(tuán)，也可以選擇HEX等其他基團(tuán)。焚光探針的 3 '端標(biāo)記MGB淬滅熒光基團(tuán)。淬滅熒光基團(tuán)選擇MGB的原因在于，TaqMan-MGB探針與傳統(tǒng)的 TaqMan-TAMRA探針比較具有以下優(yōu)勢(shì)：（1)提高TM值一平均15bases可提高18°C，這樣可以 使探針的長(zhǎng)度縮短，尤其對(duì)AT含量高的序列設(shè)計(jì)有很大的幫助，并且提高配對(duì)與非配對(duì)模 板間的TM值差異。（2)提高信噪比一由于在探針的3'端的淬滅基團(tuán)為不發(fā)光的熒光基團(tuán)，并 且與報(bào)告基團(tuán)在空間的位置更接近，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更精確，分辨率更高。
[0036] 2、豬德?tīng)査跔畈《綬NA提取
[0037]利用總RNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司，貨號(hào)DP419)提取豬德?tīng)査?狀病毒基因組RNA。放置于-20 °C備用。
[0038] 3、熒光定量PCR擴(kuò)增：
[0039] 按照如下反應(yīng)體系進(jìn)行Taqman-MGB探針?lè)晒舛縋CR:
[0040]
[0041]
[0042] 將一定量的檢測(cè)樣品即豬德?tīng)査跔畈《綬NA模板加入PCR管中（1次重復(fù)），放置 于熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，陰性對(duì)照為滅菌的去離子水。
[0043] 熒光定量PCR反應(yīng)條件如下:50 °C30min，為第一步循環(huán);92°C 3min，為第二步循環(huán)； 92°(：108,601€208,681€20 8為第三步45個(gè)循環(huán)，所述第三步每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒 光信號(hào)檢測(cè)。
[0044]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1，結(jié)果顯示豬德?tīng)査跔畈《綬NA使用熒光定量PCR檢測(cè)為