：94°C 5s 預變性，94°C 10s，55°C 20s 循環(huán)擴增 25 次，72°C 30s 延長。
[0034] 從而獲得表位替換的重組DNA分子。
[0035] (2)將重組GPC3/HBsAg的DNA分子克隆至pBSSK+載體
[0036] 將重組DNA分子用酚/氯仿法抽提1次，用乙醇/醋酸鈉沉淀。純化的DNA用T4 連接酶，按常規(guī)方法連至PBSSK+載體。具體操作參照pBSSK+Vector說明書。轉(zhuǎn)化DH5 a 感受態(tài)細胞，藍白斑篩選，挑取單克隆培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，進行PCR鑒定，EcoR I、BamH I雙酶 切鑒定。鑒定正確的克隆PBSSK/GPC3用Plasmid midi法抽提質(zhì)粒后，送測序。測序結果 顯示HBsAg基因中內(nèi)源性表位序列位置已被GPC3 CTL表位序列替換，且原序列中無錯配堿 基。
[0037] 本實施例中，編碼HBsAg內(nèi)源性表位和GPC3 CTL表位的核苷酸序列如下：
[0038] 表3 HBsAg蛋白中內(nèi)源性CTL表位及編碼表位的DNA序列
[0041]表4 GPC3 CTL表位及編碼表位的DNA序列


[0046] 實施例3重組DNA分子的蛋白表達
[0047] (1)將實施例2制備的重組DNA分子克隆入分泌型表達載體pPICZ a A，構建 GPC3-HBsAg 表達質(zhì)粒 pPICZ a A-GPC3-HBsAg。
[0048] (2)表達質(zhì)粒pPICZ a A-GPC3_HBsAg傳入畢赤酵母GS115中，用不同濃度G418篩 選出不同拷貝重組質(zhì)粒的畢赤酵母GS115,篩選出表達量最高的一株
[0049] (3)含高效分泌表達質(zhì)粒？?扣2€^-6?03-耶8六8的畢赤酵母63115高密度發(fā)酵，上 罐發(fā)酵表達達到200mg/L。
[0050] (4) GPC3_HBsAg重組蛋白分離及純化。濃縮，硫酸銨分級沉淀，phenyl疏水層析和 Q離子交換，得到高純度的GPC3-HBsAg重組蛋白。SDS-PAGE檢測純度大于95%。氨基酸測 序表明GPC3-HBsAg重組蛋白序列如SEQ ID NO :2-5和16-20所示。
[0051] 實施例4重組蛋白的體外免疫活性試驗
[0052] 取HLA-A2. 1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠，隨機分組，分別免疫實施例5制備的重組蛋白，免疫 方法如下：第一次用重組蛋白（20mg/只）；腹腔注射小鼠；1周后（第8天）用重組蛋白 (20mg/只）腹部皮下多點注射小鼠，2周后（第15天）用重組蛋白（20mg/只）皮下多點 注射免疫；3周后（第22天）用重組蛋白（IOmg/只）尾靜脈注射加強免疫一次；對照組給 予生理鹽水，免疫方法同上。具體如下：
[0053] 最后一次免疫后第7天，以淋巴細胞分離液分離脾細胞，以免疫后小鼠的脾細胞 為殺傷細胞，表達GPC3的腫瘤細胞為靶細胞，進行細胞毒試驗，大致方法如下：將靶細胞 置96孔板，加入[3H]-TdR(37kBq/孔）于37°C、5% CO2培養(yǎng)24h ;加入殺傷細胞，使殺傷 細胞和靶細胞比例為50 : 1，于37°C、5%C02培養(yǎng)24h;分別收集每孔細胞，以液閃計數(shù)儀 (1205Betaplate TM liquid scintillation counter)檢測每分鐘計數(shù)（CPM)。
[0054] 效應細胞對靶細胞的殺傷率表達為：殺傷率=(細胞毒實驗前靶細胞cpm-細胞毒 實驗后活祀細胞cpm)/細胞毒實驗前祀細胞cpmX100%
[0055] 結果如下：
[0056]
[0057] 附注：Huh7、IfepG2及WM35腫瘤細胞均表達GPC3,LOVO及H0S8603細胞均不表達 GPC3〇
[0058] 另外，處死小鼠前，分別測定小鼠體重、肝臟及腎臟重量，計算小鼠肝臟指數(shù)和腎 臟指數(shù)，結果表明，本發(fā)明的重組蛋白與對照組小鼠相比，小鼠肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)無明顯 變化。
[0059] 實施例5重組蛋白的體內(nèi)抗腫瘤試驗
[0060] 收集對數(shù)生長期的H印G2細胞，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5 X l〇7ml，經(jīng) 檢疫觀察1周的HLA-A2. 1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠于右側背部碘伏消毒，在每只皮下接種IXIO7細 胞懸液，以皮下結節(jié)直徑超過〇. 5cm為成瘤標準。皮下接種1周后均成瘤，成瘤率100%。 然后尾靜脈注射重組蛋白的生理鹽水（5mg/kg)溶液，5天后以相同劑量在注射一次重組蛋 白，模型組給予等量的生理鹽水，末次給藥14天后，處死小鼠，測定裸鼠腫瘤體積和腫瘤重 量，具體結果如下：
[0061]

[0062] 另外，經(jīng)BALB/c小鼠的毒理學實驗顯示，本發(fā)明制備的GPC3_HBsAg重組蛋白對其 生長、發(fā)育、生殖及重要器官的結構和功能均無不良影響。
[0063] 此外，本發(fā)明采用實施例2-5類似的方法，對重組蛋白進行了研究，區(qū)別僅在于采 用的 GPC3 CTL 表位不同；具體為采用 FFQRLQPGL、FYSALPGYI 或 IYDMENVLL 等 GPC3 CTL 表 位來替換HBsAg內(nèi)源性表位，獲得的重組蛋白活性與實施例4和5的結果類似，替換IPQ表 位的重組蛋白的活性明顯優(yōu)于其他表位替換的重組蛋白，結果存在統(tǒng)計學差異。
[0064] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技 術方案中所記載的技術特征可以與任意的一個或多個技術方案相組合，這些經(jīng)組合而得到 的技術方案也在本申請保護范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術方案已經(jīng)在本發(fā)明公開 內(nèi)容中具體記載一樣。
【主權項】
1. 一種GPC3-HBsAg重組蛋白，其以重組的乙肝表面抗原（HBsAg)為分子骨架，利用外 源CTL表位替換HBsAg內(nèi)源性CTL表位；所述其他外源CTL表位為GPC3的CTL表位。2. 根據(jù)權利要求1所述的GPC3-HBsAg重組蛋白，其特征在于，在所述重組的乙肝表面 抗原（HBsAg)中，一個、二個、三個或更多個HBsAg內(nèi)源性CTL表位被一個、二個、三個或更 多個GPC3的CTL表位所替換。3. 根據(jù)權利要求2所述的GPC3-HBsAg重組蛋白，其特征在于，所述重組的乙肝表面抗 原（HBsAg)的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。4. 根據(jù)權利要求1所述的GPC3-HBsAg重組蛋白，其特征在于，所述HBsAg內(nèi)源性CTL 表位選自包含IPQ表位的一個或更多個表位，進一步地所述HBsAg內(nèi)源性CTL表位選自IPQ 以及FLL、LLC、LLD、LLV、SIL和/或LLP表位中的一個、二個、三個或更多個表位。5. 根據(jù)權利要求1所述的GPC3-HBsAg重組蛋白，其特征在于，所述GPC3的CTL表位選 自EHLSLEEL、FFQRLQPGL、FYSALPGH和 / 或IYDMENVLL中一個或多個表位。6. 根據(jù)權利要求1所述的GPC3-HBsAg重組蛋白，其特征在于，所述重組蛋白序列如SEQ IDNO:2所示，其為采用GPC3CTL表位EYILSLEEL替換HBsAg內(nèi)源性CLT表位IPQ、LLD和 SIL得到的重組蛋白。7. 根據(jù)權利要求1所述的GPC3-HBsAg重組蛋白，其特征在于，所述重組蛋白序列如SEQ IDNO:3所示，其為采用GPC3CTL表位EYILSLEEL替換HBsAg內(nèi)源性CLT表位IPQ和LLD 得到的重組蛋白。8. -種編碼權利要求' 7任一項所述GPC3-HBsAg重組蛋白的核苷酸。9. 權利要求1-7任一項所述GPC3-HBsAg重組蛋白在制備腫瘤疫苗中的應用。10. 權利要求1-7任一項所述GPC3-HBsAg重組蛋白在制備治療/預防腫瘤藥物中的應 用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領域，具體涉及GPC3-HBsAg重組蛋白及其腫瘤疫苗中的應用。所述重組蛋白為重組的乙肝表面抗原(HBsAg)，具體是HBsAg內(nèi)源性CTL表位被其他外源CTL表位替換的重組蛋白；所述其他外源CTL表位為GPC3的CTL表位。
【IPC分類】C12N15/62, C07K19/00, A61P35/00, A61K39/00, A61P35/02
【公開號】CN105175547
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】李明松
【申請人】李明松, 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院, 廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司, 東莞市長大生物科技有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年8月11日