一種抗偽狂犬病毒合成肽疫苗及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，特別涉及一種抗偽狂犬病毒合成肽疫苗及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗體在抗感染免疫中具有重要的作用?？贵w直接和病原體結(jié)合，阻止病原體感染 正常細(xì)胞；抗體還可以和細(xì)菌毒素作用，阻斷毒素作用于靶細(xì)胞。此外，抗體也可以吸附 于病原體表面，從而激活補(bǔ)體介導(dǎo)的途徑來裂解病原體或增進(jìn)吞噬細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、嗜中 心粒細(xì)胞的吞噬作用以及自然殺傷性細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC作用。另外，抗體，特別是IgG，還 可以穿過母體胎盤進(jìn)入胎兒的循環(huán)系統(tǒng)，從而保護(hù)胎兒在出生初期免受病原體的感染。因 為抗體強(qiáng)大的抗感染作用，不難理解幾乎所有上市的人用疫苗保護(hù)效力都與抗體水平相關(guān) (Vaccines, 6thedition,S.A.Plotkin)〇
[0003] 抗體能夠抗病原侵襲從而對機(jī)體起保護(hù)作用，如何提高疫苗的免疫原性從而增 強(qiáng)抗體的應(yīng)答水平成為疫苗研究與開發(fā)領(lǐng)域的關(guān)鍵性問題?？贵w的分泌細(xì)胞稱為漿細(xì) 胞，其來源于活化的B細(xì)胞，特別是位于淋巴組織生發(fā)中心的B細(xì)胞（Germinal Center B cells，GC B)。GC B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞需要抗原的持續(xù)刺激。滅活疫苗或亞單位疫苗中的 佐劑成分很大程度是通過緩釋抗原，從而向GC B細(xì)胞提供持續(xù)抗原刺激，促進(jìn)其分化成分 泌抗體的漿細(xì)胞。除了抗原刺激，GC B細(xì)胞還需要激活的、同源性（cognate)的⑶4T細(xì)胞 的"幫助"才能分化成漿細(xì)胞。激活的CD4T細(xì)胞在不同的免疫微環(huán)境下分化成功能和表型 不同的亞類，包括THl、TH2以及TH17等，這些激活的⑶4T細(xì)胞通常被稱為輔助性T細(xì)胞 (helper T cell，Th)。其中THl和TH2都具有"幫助" B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞的能力。
[0004] 最新的研究發(fā)現(xiàn)，專業(yè)提供B細(xì)胞"幫助"的輔助性T細(xì)胞是一個不同于THl和TH2 的新型亞類。因該亞類在細(xì)胞表面高度表達(dá)趨化因子受體CXCR5,受趨化因子CXCL13的招 募后，迀移至B細(xì)胞濾泡區(qū)域而被稱為濾泡輔助性T細(xì)胞（Follicular helper T cell)。 在濾泡區(qū)里，活化的Tfh細(xì)胞向GC B細(xì)胞提供CD40L、ICOS、IL-21等"幫助"信號，確保GC B細(xì)胞的存活并促進(jìn)其分化為漿細(xì)胞。而B細(xì)胞欲獲得Tfh細(xì)胞的"幫助"，必須將Tfh的 TCR可識別的表位肽段置于MHC II上，并展示在細(xì)胞表面供TCR結(jié)合以激活Tfh細(xì)胞。綜 上，B細(xì)胞分化成分泌抗體的漿細(xì)胞，先后需要三個步驟：I)B細(xì)胞利用B細(xì)胞受體（B cell receptor, BCR)特異性地識別、結(jié)合抗原，從而激活BCR信號通路，使B細(xì)胞處于活化狀態(tài)， 為隨后的細(xì)胞增值和漿細(xì)胞分化作準(zhǔn)備；2)抗原與BCR結(jié)合后，以內(nèi)吞（Endocytosis)的 方式被吞入B細(xì)胞形成內(nèi)體（Endosomes)，在內(nèi)體低pH條件下，抗原被降解、截斷成 13-25個氨基酸的短肽，這些短肽被置于B細(xì)胞的MHC II分子上，并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，供 Tfh的TCR識別。3) Tfh的TCR識別B細(xì)胞MHC II類分子遞呈的抗原后，通過膜上的共刺 激分子CD28與B細(xì)胞的B7分子結(jié)合而活化，活化的Tfh細(xì)胞上調(diào)表達(dá)CD40L，該分子與B 細(xì)胞膜受體CD40結(jié)合進(jìn)一步刺激B細(xì)胞，使B細(xì)胞完全活化。所以，誘導(dǎo)較高抗體水平的 抗原至少包含兩個部分，一個是可供B細(xì)胞BCR識別的抗原成分，另外則是可以被TCR識別 的T細(xì)胞表位，二者缺一不可。
[0005] 所有有核細(xì)胞表面都分布MHCI類分子，而MHCII類分子主要分布于專職抗原遞 呈細(xì)胞膜，如B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。MHCII類分子以一定的親和力與抗原肽結(jié) 合為復(fù)合物（PMHC)并遞呈于細(xì)胞表面，Tfh細(xì)胞利用TCR特異性的識別、結(jié)合該復(fù)合物而 被激活。威脅人類的病原體種類繁多，并時常變異，因而MHC基因的高度多態(tài)性和多基因性 極大擴(kuò)展了個體對抗原肽遞呈的范圍，提高個體對不利環(huán)境的抵御能力，有利于維持種群 生存與延續(xù)。最新研究發(fā)現(xiàn)，抗原肽與MHCII類分子的親和力越高，兩者的結(jié)合范圍越廣， TCR識別、結(jié)合pMHC的能力越強(qiáng)，則生成效應(yīng)性Tfh細(xì)胞群就越多，產(chǎn)生的免疫效力更強(qiáng)。 因此，研制一種對MHCII類分子具有普遍親和力的T細(xì)胞表位抗原肽，成為當(dāng)前疫苗研制 的重大課題。
[0006] 早期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，抗體的生成需要⑶4T細(xì)胞的"幫助"。以此為基礎(chǔ)，通常把 B細(xì)胞表位或其它化學(xué)小分子類的半抗原成分共價偶聯(lián)到載體蛋白，如KLH、BSA、0VA上，這 些載體蛋白在BCR識別和結(jié)合抗原后，隨目標(biāo)抗原一起被內(nèi)吞到B細(xì)胞內(nèi)，從而被加工、展 示于MHCII上，繼而遞呈給CD4T細(xì)胞，使CD4T細(xì)胞活化，相應(yīng)的B細(xì)胞在獲得活化CD4T 細(xì)胞幫助后，分化成漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體。另外，在疫苗學(xué)領(lǐng)域，通常將B細(xì)胞表位和CD4T細(xì)胞 表位的組合物作為抗原接種機(jī)體，使B細(xì)胞在CD4T細(xì)胞的幫助下產(chǎn)生抗體，從而起到免疫 保護(hù)的作用。盡管動物用包含CD4T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位的口蹄疫合成肽疫苗已經(jīng)上市， 但此類合成肽疫苗大部分還處于試驗(yàn)階段，免疫效果還有待商榷。迄今為止，尚未有人用合 成肽疫苗上市，一個重要的原因是對Tfh細(xì)胞及B細(xì)胞相互關(guān)系的認(rèn)識還處于初級階段，所 設(shè)計的合成肽疫苗刺激能幫助的B細(xì)胞的CD4T細(xì)胞（即Tfh)的數(shù)量和質(zhì)量有待提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一方面提供了一種多肽，其包含T1-B-T2或T2-B-T1構(gòu)型排列的氨基酸 序列，
[0008] 其中，Tl為修飾后的SEQIDNO:1 ;
[0009] B為SEQIDNO: 10 ;
[0010] T2 為修飾后的SEQIDNO:2。
[0011] TUB或T2可以通過間隔序列來功能性連接，其中間隔序列可以是任何不影響T1、 B或T2結(jié)構(gòu)或者功能的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，間隔序列為eK。
[0012] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述修飾包括置換、添加和/或缺失原來的細(xì)胞表位中的 一個或多個氨基酸，且修飾后的細(xì)胞表位與所述原來的細(xì)胞表位具有相同免疫功能。
[0013] 在本發(fā)明的代表實(shí)施例中，所述SEQIDNO: 1的修飾可以包括下列的一個或多個 修飾：
[0014] (1)第1位氨基酸絲氨酸置換為疏水性氨基酸；
[0015] (2)第2位氨基酸谷氨酸置換為帶正電的氨基酸；
[0016] (3)第12位氨基酸谷氨酸置換為疏水性氨基酸；和
[0017] (4)第13位氨基酸甘氨酸置換為疏水性氨基酸。
[0018] 在本發(fā)明的代表實(shí)施例中，所述SEQIDNO:2的修飾包括下列的一個或多個修 飾：
[0019] (1)第1位氨基酸脯氨酸置換為疏水性氨基酸；
[0020] (2)第3位氨基酸酪氨酸置換為其他芳香族氨基酸；
[0021] (3)第6位氨基酸谷氨酰胺置換為疏水性氨基酸；
[0022] (4)第7位氨基酸天冬酰胺置換為帶正電或芳香族的氨基酸；和
[0023] (5)第13位氨基酸蘇氨酸置換為疏水性氨基酸。
[0024] 在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，Tl表位包含SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。
[0025] 在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，T2表位包含SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。
[0026] 其中，上述表位組合通過人工合成、通過原核或真核細(xì)胞表達(dá)、或通過基因重組技 術(shù)嵌入病原體而獲得。
[0027] 在本發(fā)明的另一個方面中，提供了 一種分離的多核苷酸，其包含選自下組中的一 種：
[0028] a)編碼如前面所述的多肽；或者
[0029] b)與多核苷酸a)互補(bǔ)或嚴(yán)格雜交的多核苷酸。
[0030] 在本發(fā)明的另外一個方面中，提供了一種疫苗，其包含至少一種前面所述的多肽。
[0031] 在本發(fā)明中，本發(fā)明的疫苗還包含醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的遞送載體或佐劑。
[0032] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，疫苗施用途徑選自眼內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、注射、口服、腹腔內(nèi)、皮 下、局部、皮內(nèi)和透皮遞送。
[0033] 在本發(fā)明的一個方面中，提供了一種疫苗佐劑，其包含至少一種前面所述的多肽。
[0034] 此外，本發(fā)明的多肽在制備用于抗偽狂犬病毒的預(yù)防性疫苗、治療性疫苗中的用 途。以及根據(jù)本發(fā)明的分離的多肽用于生產(chǎn)多核苷酸的用途也是在本發(fā)明的范疇內(nèi)。
[0035] 在本發(fā)明中，本發(fā)明的多肽在制備單克隆或多克隆抗體中的用途。
[0036] 在本發(fā)明中，本發(fā)明的多核苷酸在制備多肽中的用途。
[0037] 在本發(fā)明中，本發(fā)明的疫苗在制備用于抗偽狂犬病毒的預(yù)防性疫苗、治療性疫苗 中的用途。
[0038] 在本發(fā)明中，本發(fā)明的疫苗佐劑在制備用于抗偽狂犬病毒的預(yù)防性疫苗、治療性 疫苗中的用途。
[0039] 本發(fā)明的有益效果通過實(shí)施例，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)T1-B-T2誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力比 單一的Tl-B或T2-B或B高5-10倍，此發(fā)現(xiàn)說明本發(fā)明的序列組合可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng) 的Tfh應(yīng)答，更重要的是，增強(qiáng)Tfh的應(yīng)答能力可以大幅度地促進(jìn)相應(yīng)的抗體產(chǎn)生。本發(fā)明 所述的包含表位組合產(chǎn)物可以廣泛地使用于抗病原感染或腫瘤或自身免疫性疾病的預(yù)防 性疫苗、治療性疫苗，以誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的抗體；本序列組合也可用于生產(chǎn)多克隆或單克隆 抗體，用于診斷、治療以及科研。因?yàn)楸景l(fā)明為人工合成產(chǎn)物，具有成分明確、質(zhì)量可控、靶 標(biāo)清楚的特點(diǎn)，用于合成肽疫苗具有較強(qiáng)的優(yōu)勢。
[0040] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。從下文的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述 方面和本發(fā)明的其他方面將是明顯的。
【附圖說明】
[0041] 圖1示出PCV疫苗免疫小鼠后血清稀釋倍數(shù)的結(jié)果。
[0042] 圖2示出不同⑶4T細(xì)胞和B細(xì)胞表位組合誘導(dǎo)Tfh的頻率。
[0043] 圖3示出不同⑶4T細(xì)胞和B細(xì)胞表位組合誘導(dǎo)Tfh的數(shù)量。
[0044] 圖4示出PRSV疫苗免疫兔后產(chǎn)生的抗體稀釋倍數(shù)的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 除非特別說明，本發(fā)明的術(shù)語具有本領(lǐng)域通常使用的含義。
[0046] 表位可以分類為B細(xì)胞型、T細(xì)胞型或B細(xì)胞型和T細(xì)胞型兩者，取決于它們引起 的免疫應(yīng)答的類型。B細(xì)胞或T細(xì)胞表位的定義不是明確的；例如，一種肽表位能夠誘導(dǎo)抗 體產(chǎn)生，但同時該表位能夠具有一種序列，該序列能夠結(jié)合于人HLA分子，使得它容易到達(dá) CTL，因此對于該特定表位為雙B細(xì)胞和T細(xì)胞分類。"T輔助細(xì)胞"或"Tfh"是在被特異性 抗原刺激時釋放促進(jìn)B細(xì)胞和殺傷T細(xì)胞的活化和功能的細(xì)胞因子的任何T細(xì)胞。<