稻瘟病抗性基因Pi9功能特異性分子標(biāo)記Pi9FNP及方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種稻瘟病抗性基因Pi9功能特異性分子標(biāo)記Pi9FNP及其方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口以稻米為主食。由稻痕病菌{Magnapothe oryzae)引起的稻痕病害是對水稻生產(chǎn)危害最嚴(yán)重的病害之一，幾乎每年都會造成嚴(yán)重的糧食損失。長期的生產(chǎn)實(shí)踐表明，選育與利用抗病品種是防治稻瘟病最為安全有效的方法。況且由于稻瘟病生理小種致病性變異頻繁，導(dǎo)致單一抗性品種的抗性會在種植后的35年時間里逐漸喪失，因此，挖掘和合理利用廣譜抗性基因是獲得持久、廣譜抗病品種的重要途徑。常規(guī)抗性基因分析方法需要大量的接種鑒定、抗性遺傳及基因等位性分析工作，并且由于不同抗性基因在抗譜上有一定的重疊性，因此常規(guī)接種鑒定方法不足以準(zhǔn)確、真正地反映出水稻品種的基因型。近一、二十年來，隨著水稻抗病分子遺傳學(xué)的發(fā)展，眾多的抗性基因得以被精細(xì)定位或被克隆，SSR等連鎖分子標(biāo)記的應(yīng)用大大促進(jìn)了抗性基因遺傳背景的鑒定以及抗病多基因聚合育種的發(fā)展(Hittalmaniet al.，2000 ；Jena and Mackill, 2008)。另一方面，基因克隆的結(jié)果顯示抗病基因往往是成簇存在，且不同復(fù)等位基因之間、功能型序列與非功能型之間序列高度同源，一般的連鎖標(biāo)記仍然難以準(zhǔn)確觀別各種材料的功能抗病基因(Zhou et al., 2006; Ashikawa et al., 2008;Yuan et al., 2011; Zhai et al., 2011; Hua et al., 2012)。因此，直接分析功能等位基因本身的序列并開發(fā)其特異性的分子標(biāo)記來對目標(biāo)基因進(jìn)行選擇，不僅選擇可靠性高，還會大大加快了育種步伐。
[0003]近年來，有關(guān)于Pi2/Pi9等位位點(diǎn)的抗性基因的研究有了很大進(jìn)展，王倩等(2012)發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的基因是東北各地區(qū)抗性最好、抗譜最廣的抗源。張學(xué)堂等(2010)和曾凡松等(2011)在各自的研究中也證實(shí)Pi2/Pi9等位基因是當(dāng)前優(yōu)良的抗性基因。Zhou等(2007)和Dai等(2010)通過對Pi2/Pi9等位位點(diǎn)在5個栽培種及4個野生種的對比研究表明，該位點(diǎn)的基因組結(jié)構(gòu)高度保守，其所屬的NBS-LRR類LRR區(qū)受到過強(qiáng)正向選擇。目前該抗性位點(diǎn)上至今已至少發(fā)現(xiàn)有7個不同抗譜的抗性基因(Liu et al.2010; Zhu eral.2012)，并且有至少5個抗性基因的研究比較清楚，它們分別為Pi2、Piz_t、Pi9、P1-gm和 P1-50 (t) (Qu et al.2006; Zhou et al.2006; Deng et al.2006; Zhu et al.2012),其中Pi2和Piz-t在氨基酸水平上只存在著8個氨基酸殘基的差異，二者與Pi9相比，氨基酸序列一致性分別都高達(dá)96% (Qu et al., 2006; Zhou et al.，2006)o Pi9來源于野生稻，能抵抗來自13個國家和地區(qū)的43個稻瘟病生理小種的侵染(Liu et al.2002)，國際水稻所用超過100個來自菲律賓的稻瘟病生理小種對攜帶有抗性基因Pi9的水稻品種75-1-127進(jìn)行接種鑒定，并沒有發(fā)現(xiàn)親和菌株(Qu et al.2006)。已有研究開發(fā)出一些與Pi9連鎖的基于Pi9基因的功能標(biāo)記和基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記(Liu et al.2002 ;殷得所等，2011)，用于分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)育種或品種鑒定工作。然而，前者由于為顯性標(biāo)記，不能鑒別分離世代材料的陽性單株基因型是否純合；后者與目標(biāo)基因存在著一定的物理距離，因此，在減數(shù)分裂過程中存在著與目標(biāo)基因發(fā)生交換的風(fēng)險(xiǎn)，在抗性育種工作中容易發(fā)生錯選或漏選的情況。為了能更準(zhǔn)確有效地將稻瘟病廣譜抗性基因Pi9應(yīng)用到水稻抗性育種工作中，將兩者的優(yōu)勢結(jié)合起來，開發(fā)出準(zhǔn)確有效的Pi9功能特異性分子標(biāo)記顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的稻瘟病抗性基因Pi9基因功能特異性分子標(biāo)記Pi9FNP。
[0005]本發(fā)明的另一發(fā)明目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因Pi9基因特異性分子標(biāo)記Pi9FNP的檢測方法。
[0006]本發(fā)明的再一發(fā)明目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因Pi9基因特異性分子標(biāo)記Pi9FNP的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種稻瘟病抗性基因Pi9基因特異性分子標(biāo)記Pi9FNP，其特點(diǎn)是:通過引物對SEQ ID N0.1和SEQID N0.2從水稻基因組DNA中擴(kuò)增出的核苷酸序列I，用限制性內(nèi)切酶Hae II對前述核苷酸片段I進(jìn)行酶切后，所獲得的與非稻瘟病抗性基因Pi9呈特異性帶型的核苷酸片段II ;
SEQ ID N0.1 (5，-3，): CGAATTGTAAATAAATGTGGTC ；
SEQ ID N0.2 (5’ -3’): CATAGAATTTCTCCCATTCTGGCGC ；
所述的核苷酸片段I的序列如下，其中下劃線處是Pi9特異堿:基iCGAATTGTAAATAAATGTGGTCGTCTACCATTAGCAATACTTACAATAGGAGCTGTGCTTGCAACTAAACATGTGTCAGAATGGGAGAAATTCTATG
所述的核苷酸片段II的序列如下:
CGAATTGTAAATAAATG TGGTCGTCTA CCATTAGCAA TACTTACAAT AGGAGCTGTGCTTGCAACTAAACAGGTGTC AGAATGGGAGAAATTCTATG。
[0008]以上所述的本發(fā)明稻瘟病抗性基因Pi9基因特異性分子標(biāo)記Pi9FNP技術(shù)方案中，進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案是:其所涉及的水稻品種為選自抗性品種IRBL9-W(Pi9)、C101A51(Pi2)、抗性品種IRBLzt-T (Piz-t)、抗性品種谷梅4號(Pigm)、感病品種日本晴(Nip)、感病品種LTH、感病品種9311。
[0009]以上所述的本發(fā)明稻瘟病抗性基因Pi9基因特異性分子標(biāo)記Pi9FNP技術(shù)方案中，進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案是:所述的與稻瘟病抗性基因Pi9呈特異性帶型的核苷酸片段II具體如下:用限制性內(nèi)切酶Hae II酶切核苷酸片段I后，得到分子量大小為97bp核苷酸片段；而非稻瘟病基因Pi9則被切成分別為72bp和25bp的核苷酸片段。
[0010]本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明還公開了一種如以上技術(shù)方案中任何一項(xiàng)所述的稻瘟病抗性基因Pi9特異性分子標(biāo)記Pi9FNP的檢測方法，其特點(diǎn)是:其步驟如下:
(1)通過常規(guī)PCR法擴(kuò)增，獲得多個Pi9等位位點(diǎn)抗性基因和非抗性基因的DNA序列；
(2)將步驟(I)所得的序列對比，篩查Pi9特異的、能區(qū)別于該位點(diǎn)其他稻瘟病等位抗性基因的特異性單堿基SNP差異位點(diǎn)；
(3)利用步驟(2)獲得的SNP信息，根據(jù)dCAPS標(biāo)記的設(shè)計(jì)原理，在所述SNP位點(diǎn)處設(shè)計(jì)帶有錯配堿基的基因特異性下游引物，下劃線是引入的錯配堿基，在該SNP位點(diǎn)下游50100bp處設(shè)計(jì)基因特異性上游引物，引物對堿基序列如下:
SEQ ID N0.1 (5，-3，): CGAATTGTAAATAAATGTGGTC ；
SEQ ID N0.2 (5，-3’): CATAGAATTTCTCCCATTCTGGCGC ；
(4)以攜帶有稻瘟病抗性基因Pi9的稻瘟病抗性品種的總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hae II酶切后，進(jìn)行電泳檢測的DNA片段，未被酶切開的即為稻瘟病抗性基因Pi9基因特異性分子標(biāo)記Pi9FNP。
[0011 ] 以上所述的本發(fā)明稻瘟病抗性基因Pi9特異性分子標(biāo)記Pi9FNP的檢測方法，其進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案是:步驟(3)所述引物是根據(jù)dCAPS標(biāo)記原理，在SNP處設(shè)計(jì)帶有錯配堿基的功能特異性下游引物SEQ ID N0.2，在SNP上游50_100bp處設(shè)計(jì)功能特異性上游引物 SEQ ID N0.1 ο
[0012]以上所述的本發(fā)明稻瘟病抗性基因Pi9特異性分子標(biāo)記Pi9FNP的檢測方法，其進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案是:步驟(4)中所述的PCR的反應(yīng)體系如下:
10 X PCR buffer ( Mg2+Plus): 2.5 μ IdNTPs (2.5mM each): 2.0 μ ISEQ ID N0.1 (10 μ Μ):1 μ ISEQ ID N0.2 (10 μ Μ):1 μ ITaKaRa Taq?(5 U/μ I): 0.2 μ IDNA 模板(< 0.2 μ g/ μ I):1 μ IddH20 補(bǔ)至 25 μ I ；
所述的PCR的反應(yīng)條件如下:預(yù)變性94°C 5分鐘；94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 20秒，擴(kuò)增35個循環(huán)；72°C 7分鐘;10°C保存。
[0013]本發(fā)明所述的一種稻瘟病抗性基因Pi9特異性分子標(biāo)記Pi9FNP的應(yīng)用，包括在水稻種質(zhì)資源中快速、直接地鑒定該抗性基因，以及在分子標(biāo)記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果主要體現(xiàn)在:
(I)本發(fā)明提供的分子標(biāo)記特異性高:Pi9所在的基因組區(qū)域存在著包括Pi9在內(nèi)的6個具有抗性基因特征的候選基因，這些候選基因在序列上高度同源，相互之間在核苷酸水平上的序列一致性范圍為71.8%98.6% (Qu et al.，2006);此外，Pi9與該位點(diǎn)上非功能基因的序列也高度同源(Zhu et al., 2012) ο本發(fā)明提供的Pi9特異性分子標(biāo)記Pi9FNP能明顯地將Pi9與存在于該基因組區(qū)域內(nèi)非Pi9基因進(jìn)行區(qū)分。
[0015](2)本發(fā)明提供的分子標(biāo)記在實(shí)際應(yīng)用中，低成本、高通量:目前，檢測SNP的方法有測序法、熒光檢測法、DNA芯片、質(zhì)譜檢測法等，而這些方法大部分成本高，效率低。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記只需PCR結(jié)合酶切，成本低、通量高、加上特異性高(即準(zhǔn)確度高)，特別適用于生產(chǎn)實(shí)踐中。
[0016](3)本發(fā)明是第一個針對Pi9基因內(nèi)部功