缺失型和α2變異的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于水解探針法的可同時(shí)檢測地中 海貧血-α21·9缺失型和α 2變異的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 地中海貧血也稱珠蛋白合成障礙性貧血，簡稱地貧。地中海貧血是廣西地區(qū)最常 見的單基因遺傳疾病之一，常見的地貧種類有Cl-地貧和β-地貧。中國人群中，α-地貧 的基因型常見的為缺失型一SEA、-α3·7和-α 4Λ 2013年，欽州市婦幼保健院檢測出了一種 命名為'欽州型α地貧缺失型'的罕見地貧基因型，由于該基因型的分子生物學(xué)機(jī)制為α 珠蛋白基因簇（NG_000006. 1)中一段21.9kb的DNA序列的缺失，因此簡寫為-a2L9(Long J, Yan S, Lao K, Pang ff, Ye X, Sun L. The diagnosis and molecular analysis of a novel 21.9kb deletion (Qinzhou type deletion)causing a +thalassemia.Blood Cells Mol Dis. 2014 ;52(4) :225-9.)。此外，在申請人的研究過程中，還發(fā)現(xiàn)一種新 型的α-珠蛋白基因簇（NG_000006. 1)中α2基因的變異基因型，該基因型被描述為 HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC。申請人還發(fā)現(xiàn)該基因型在廣西有一定的分布幾率，為對這 兩種基因型進(jìn)行檢測，需要建立一種可以同時(shí)和快速檢測HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC 等位基因- α 21·9等位基因的試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種基于水解探針法的可同時(shí)檢測地中海 貧血-α21·9缺失型和α2變異的試劑盒。該試劑盒可以實(shí)現(xiàn)單管單次反應(yīng)直接完成 ΗΒΑ2: c. 301-24delinsCTCGGCCC和-α 21·9等位基因的檢測，且具有高度的靈敏性、穩(wěn)定性和 準(zhǔn)確性，以及較高的特異性。
[0004] 本發(fā)明所述的基于水解探針法的可同時(shí)檢測地中海貧血-α 21·9缺失型和α 2變異 的試劑盒，包括擴(kuò)增引物和熒光探針，其中：
[0005] 所述α2變異為α-珠蛋白基因簇（NG_000006. 1)中α2基因的變異基因型，該 基因型被描述為HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC，序列具體為：
[0006] gggttgcgggaggtgtagcgcaggcggcggctgcgggcctgggccCTCGGCCCcactgaccctcttctc tgcacagctcctaagccactgcctgctggtgaccctggccgcccacctccccgccgagttcacccctgcggtgcacg cctccctggacaagttcctggcttctgtgagcaccgtgctgacctccaaataccgttaagctggagcctcggtagcc gttcctcctgcccgctgggcctcccaacgggccctcctcccctccttgcaccggcccttcctggtctttgaataaag tctgagtgggcagcagcctgtgtgtgcctgggttctctctatcccggaatgtgccaacaatggaggtgtttacctgt ctcagaccaagga ；
[0007] 所述的擴(kuò)增引物為：一對可以擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中-α 21·9等位 基因的特征序列的引物21. 9-F和21. 9-R，一對可以擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中 HBA2: c. 30l-24deIinsCTCGGCCC等位基因的特征序列的引物A2V-F和A2V-R，以及一對可以 擴(kuò)增內(nèi)參基因 GAPDH片段的引物GAPDH-F和GAPDH-R ;
[0008] 所述的熒光探針為：一條特異性檢測21. 9-F和21. 9-R擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針 21. 9-Prob，一條特異性檢測A2V-F和A2V-R擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針A2V-Prob，一條特異性檢 測GAPDH-F和GAPDH-R擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針GAPDH-Prob ;
[0009] 其中：
[0010] 所述可以擴(kuò)增α-珠蛋白基因簇中-α 21·9等位基因的特征序列的引物對中，
[0011] 21. 9-F :5' -GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3' ；
[0012] 21. 9-R :5' -TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3' ；
[0013] 所述可以擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中ΗΒΑ2 :c. 301_24delinsCTCGGCCC等位基因的特 征序列的引物對中，
[0014] A2V-F :5'-GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3' ；
[0015] A2V-R :5'-TCCTTGGTCTGAGACAGGTA-3' ；
[0016] 所述可以擴(kuò)增內(nèi)參基因 GAPDH片段的引物對中，
[0017] GAPDH-F :5,-CCCCACACACATGCACTTACC-3,；
[0018] GAPDH-R :5,-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3,；
[0019] 所述特異性檢測21. 9-F和21. 9-R擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針21. 9-Prob為：
[0020] 21. 9-Prob :5, -6-FAM-CTGGGGAAGGGTGGGTGGGAATAACAGC-BHQ-1-3,；
[0021] 所述的特異性檢測A2V-F和A2V-R擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針A2V-Prob為：
[0022] A2V-Prob :5' -6-R0X-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-BHQ-1-3' ；
[0023] 所述的特異性檢測GAPDH-F和GAPDH-R擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針GAPDH-Prob為：
[0024] GAPDH-Prob :5, -CY5-AAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGC-BHQ-2-3, 〇
[0025] 本發(fā)明所述的熒光探針中，F(xiàn)AM指羧基熒光素，ROX指羧基-X-羅丹明，CY5是指花 青染料分子5, BHQ-I和BHQ-2是指熒光淬滅基團(tuán)。
[0026] 本發(fā)明所述的試劑盒，還包括一些現(xiàn)有試劑盒中常規(guī)且必須的組分，如緩沖液、酶 液、MgCljP dNTP。具體地，酶液為Taq聚合酶體系，包括可用于水解探針法的熱啟動酶體 系等；所述緩沖液為常規(guī)的PCR緩沖液。當(dāng)酶液選擇采用康為世紀(jì)所生產(chǎn)的GoldStar Taq DNAPolymerase時(shí)，緩沖液則優(yōu)選為與GoldStar Taq DNAPolymerase配套的緩沖液。
[0027] 采用上述試劑盒快速檢測HBA2 :c. 301_24delinsCTCGGCCC和-α 21·9等位基因的 方法，包括以下步驟：
[0028] 1)抽提樣本基因組DNA，制備DNA模板；
[0029] 2)配制反應(yīng)體系，具體為：
[0030] 將引物 21. 9-F、21. 9-R、A2V-F、A2V-R、GAPDH-F 和 GAPDH-R，熒光探針 21. 9-Prob、 A2V-Prob和GAPDH-Prob ;以及PCR緩沖液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板配制成反應(yīng)體 系；
[0031] 3)樣本檢測：分別將配制的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，記錄每個PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒 光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)Cq(Cq值的大小可以反映所檢測模板數(shù)的多 少）；
[0032] 4)數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判定：根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶的分析軟件分析判讀結(jié) 果，當(dāng)CY5通道有Cq值讀數(shù)，則該樣本被正常擴(kuò)增；
[0033] 在CY5通道有讀數(shù)的前提下，若ROX通道有讀數(shù)，則表示該樣本攜帶 HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC 等位基因；
[0034] 在CY5通道有讀數(shù)的前提下，若ROX通道沒有Cq值讀數(shù)，則表示該樣本不攜帶 HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC 等位基因；
[0035] 在CY5通道有讀數(shù)的前提下，若FAM通道有Cq值讀數(shù)，則表示該樣本攜帶-α 21·9等位基因；
[0036] 在CY5通道有讀數(shù)的前提下，若FAM通道沒有Cq值讀數(shù)，則表示該樣本不攜 帶_α21·9等位基因。
[0037] 上述方法的步驟1)中，采用現(xiàn)有常規(guī)方法制備DNA模板。
[0038] 上述方法的步驟2)中，反應(yīng)體系中各組分的濃度優(yōu)選為：待檢測DNA :1~3ng/ yL ;各引物：0. 3~0. 5ymol/L ;各熒光探針濃度為0. 3~0. 5ymol/L ;DNA模板：20~ 200ng ;鎂離子：1. 5~I. 9mmol/L ;反應(yīng)體系的終體積優(yōu)選為20 μ L。
[0039] 上述方法的步驟3)中，PCR擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性8~12分鐘，然后95°C 15~ 30秒，60 °C退火50~70秒，39~49個循環(huán)，于60 °C退火步驟末采集熒光信號。
[0040] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的特點(diǎn)在于：
[0041] 1、本發(fā)明所述試劑盒可以實(shí)現(xiàn)單管單次反應(yīng)直接完成 HBA2: c. 301-24delinsCTCGGCCC和-α 21·9等位基因的檢測，且具有高度的靈敏性、穩(wěn)定性和 準(zhǔn)確性，以及較高的特異性。
[0042] 2、無需開管操作，極大限度地降低了實(shí)驗(yàn)室PCR產(chǎn)物污染的可能；
[0043] 3、采用水解探針的實(shí)驗(yàn)方案比現(xiàn)有其他方法所需時(shí)間少，對設(shè)備要求也不高。
【附圖說明】
[0044] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中1#樣本的擴(kuò)增曲線；
[0045] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中2#樣本的擴(kuò)增曲線；
[0046] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中3#樣本的擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述，以更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，但 本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。
[0048] 實(shí)施例1 :采用本發(fā)明所述試劑盒在已知基因型樣本中的檢測結(jié)果
[0049] 1、試劑盒的組成：
[0050] (1)可以擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中-α 21·9等位基因的特征序列的引物對21. 9-F和 21. 9-R ：
[0051] 21. 9-F :5'-GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3'（SEQ ID NO :1);
[0052] 21. 9-R :5,-TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3'（SEQ ID NO :2);
[0053] (2)可以擴(kuò)增α -珠蛋白基因簇中HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC等位基因（所 述 HBA2:c. 301_24delinsCTCGGCCC 等位基因的序列具體為：gggttgcgggaggtgtagcgcaggcg gcggctgcgggcctgggccCTCGGCCCcactgaccctcttctctgcacagctcctaagccactgcctgctggtgacc ctggccgcccacctccccgccgagttcacccctgcggtgcacgcctccctggacaagttcctggcttctgtgagcac cgtgctgacctccaaataccgttaagctggagcctcggtagccgttcctcctgcccgctgggcctcccaacgggccc tcctcccctccttgcaccggcccttcctggtctttgaataaagtctga