一種抗凝血肽的酶解制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食源性蛋白深加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以大豆或大豆蛋白為原料制備具有抗凝血活性多肽的工藝方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由于現(xiàn)代人們過度飲食、嗜煙和酗酒等不良的生活習(xí)慣，這種動(dòng)態(tài)平衡被打破，觸發(fā)了血液中的凝血系統(tǒng)，使得血液在血管中凝固形成了血栓。心腦血管血栓性疾病現(xiàn)已成為人類的頭號(hào)殺手，目前，心血管疾病在歐洲每年造成180萬人過早死亡，在我國(guó)心血管疾病流行趨勢(shì)也不容樂觀。據(jù)調(diào)查，我國(guó)心血管疾病患病率男性為1.78%，女性1.10%，且患病率隨年齡升高而增加。
[0003]目前用來治療血栓的藥物主要有肝素、華法林等，但這些藥物都存在一定的副作用，如血小板減少和引起出血等。認(rèn)識(shí)到到這些抗血栓藥物的缺點(diǎn)，人們開始研究開發(fā)更安全健康的抗凝血、抗血栓藥物。在這種背景下，生物活性肽憑借吸收性好、安全性高的特性開始進(jìn)入眾多研究者的視野。目前，一些肽類化合物已被發(fā)現(xiàn)具有顯著的抗凝血活性，按抗凝血活性肽的來源不同可將其分為非食源性肽和食源性肽兩大類，其中非食源性抗凝肽已有較長(zhǎng)的研究歷史，而食源性抗凝肽的研究近年來才引起廣泛的關(guān)注。
[0004]目前，研究熱點(diǎn)主要集中在前兩個(gè)方面。而且從預(yù)防的角度來說，抑制凝血因子或者抑制凝血酶活性是公認(rèn)較為理想的選擇。
[0005]水蛭素與凝血酶分子表面上堿性氨基酸組成的纖維蛋白原識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，使凝血酶構(gòu)型發(fā)生輕微改變，進(jìn)而水蛭素與凝血酶的酶活性中心結(jié)合，從而抑制凝血酶的催化活性，阻止凝血酶和纖維蛋白原相互作用。采采蠅凝血酶抑制劑TTI是從采采蠅的唾液腺提取物中分離得到的，比較N -端氨基酸順序發(fā)現(xiàn)其與己經(jīng)鑒定的絲氨酸蛋白酶抑制劑及其他天然抗凝劑無同源性。壁虱抗凝肽TAP是由60個(gè)氨基酸組成的單鏈酸性肽，可以與凝血酶的催化位點(diǎn)結(jié)合，分子結(jié)構(gòu)與水蛭素類似，其通過與Xa因子結(jié)合，從而阻止凝血激酶復(fù)合物的形成，以抑制凝血酶原的激活。線蟲抗凝肽是一系列小分子多肽，通過與凝血因子活性位點(diǎn)結(jié)合，來抑制凝血原酶或凝血酶合成。比伐盧定是一種合成的凝血酶抑制劑，屬于水蛭素衍生出的小分子多肽。比伐盧定同凝血酶結(jié)合形成1:1復(fù)合物，直接抑制凝血酶活性，從而起到抗凝作用，但其抑制凝血酶活性的持續(xù)時(shí)間較短。美拉加群是一種纖維蛋白二肽類似物，其抗凝機(jī)制是與凝血酶活性位點(diǎn)結(jié)合，可以競(jìng)爭(zhēng)性直接抑制凝血酶。
[0006]目前已報(bào)道的各類具有抗凝血功能的活性肽，有些本身是動(dòng)物唾液或毒液的有效成分，盡管抗凝效果良好，但同時(shí)也可能具有強(qiáng)烈的副作用，存在安全隱患；有些抗凝血肽在天然生物體內(nèi)含量極少，分離和純化成本高，所以大多數(shù)多肽難以規(guī)?；a(chǎn)；還有的抗凝血肽活性周期短、有的不能口服等。這些弊端促使研究者們極力開發(fā)食源性的抗凝血肽，而且這些抗凝血物質(zhì)的開發(fā)都是從臨床藥物的角度進(jìn)行的。對(duì)于血栓的早期預(yù)防，從功能性食品組分的角度入手是較為理想的手段。
[0007]多數(shù)食物蛋白質(zhì)中都存在生物活性肽序列，通過酶解作用可將食物蛋白序列中的肽釋放出來，得到多種具有生物功能或生理效應(yīng)的活性肽。食源性抗凝血活性肽是指以天然動(dòng)植物蛋白為前體物質(zhì)，直接提取或進(jìn)行再加工獲得的具有抗凝活性的肽。
[0008]近年來，從不同食物蛋白中尋找具有抗凝血功能蛋白水解物的研究逐漸受到關(guān)注。Shimizu等利用木瓜蛋白酶(Papain)水解豬肉，分離得到的肽組分對(duì)老鼠給藥后顯示較好的抗血栓活性。楊萬根等利用Alcalase 2.4L和Protease N水解蛋清蛋白，得到了具有抗凝血活性的水解產(chǎn)物。Rajapakse等從魚肉蛋白酶解物中獲得了具有抗凝血和抑制血小板聚集的單鏈單體蛋白。Rojas - Ronquillo等利用乳酸菌發(fā)酵牛乳酪蛋白，研究表明發(fā)酵產(chǎn)物具有抗凝血活性，且在發(fā)酵27h時(shí)對(duì)凝血酶抑制性最強(qiáng)，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)HPLC純化后得到多個(gè)活性肽。還有研究發(fā)現(xiàn)來源自k-酪蛋白的抗血栓活性肽能夠減少凝血酶引起的血小板聚合，并呈顯著的量效關(guān)系。聶毅磊等使用胰蛋白酶水解明膠，發(fā)現(xiàn)明膠水解物的抗凝效果顯著。
[0009]酶解法制備活性多肽是利用蛋白酶水解蛋白的特定氨基酸位點(diǎn)，從而得到具有生物活性的多肽。該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、生產(chǎn)條件溫和、產(chǎn)品安全性高，是獲得食品級(jí)生物活性肽的常用方法。我國(guó)目前對(duì)植物蛋白的開發(fā)利用率非常低，許多制油工藝得到的餅柏(含有豐富的蛋白)僅作為飼料或肥料，資源浪費(fèi)嚴(yán)重。以植物蛋白為來源采用酶法制備凝血酶抑制肽正日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，盡管其活性不一定能夠滿足臨床治療的要求，但如果將其進(jìn)一步開發(fā)作為功能性食品配料用于預(yù)防血栓性疾病，則會(huì)具有廣闊的市場(chǎng)前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有以植物蛋白為來源制備得到的凝血酶抑制肽的抑制率較低的問題，而提供一種抗凝血肽的酶解制備方法。
[0011]本發(fā)明抗凝血肽的酶解制備方法按下列步驟實(shí)現(xiàn):
[0012]—、將大豆分離蛋白溶于蒸餾水中，制備得到大豆蛋白溶液；
[0013]二、將步驟一得到的大豆蛋白溶液加熱至60?90°C處理5?lOmin，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)體系的pH，然后加入蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)，滅酶處理后得到酶解溶液；
[0014]三、對(duì)酶解溶液進(jìn)行離心處理，收集上清液，然后采用截留分子量小于500的過濾膜進(jìn)行過濾，得到過濾后的酶解溶液；
[0015]四、將過濾后的酶解溶液在60?65°C、15?30MPa的條件下進(jìn)行均質(zhì)處理，得到均質(zhì)后的酶解溶液；
[0016]五、對(duì)均質(zhì)后的酶解溶液進(jìn)行殺菌處理，得到殺菌后的酶解溶液；
[0017]六、將殺菌后的酶解溶液進(jìn)行干燥處理，得到大豆抗凝血肽；
[0018]其中當(dāng)步驟二所述的蛋白酶為胃蛋白酶時(shí)，水解反應(yīng)過程是用酸性調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)體系的pH至1.2?2.5，在30?40 °C恒溫水浴條件下加入E/S 2.0%?5.0%的胃蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)0.5?4h ;
[0019]當(dāng)步驟二所述的蛋白酶為胰蛋白酶時(shí)，水解反應(yīng)過程是用堿性調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)體系的pH至7.0?8.0，在30?40°C恒溫水浴條件下加入E/S 2.0%?5.0 %胰蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)0.5?4h ;
[0020]當(dāng)步驟二所述的蛋白酶為堿性蛋白酶時(shí)，水解反應(yīng)過程是用堿性調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)體系的pH至7.5?9.0，在50?65 °C恒溫水浴條件下加入E/S 2.0%?5.0 %堿性蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)0.5?4h，并在水解反應(yīng)過程中加入堿性調(diào)節(jié)劑維持體系pH值恒定；
[0021]當(dāng)步驟二所述的蛋白酶為胃蛋白酶與胰蛋白酶的復(fù)合蛋白酶時(shí)，水解反應(yīng)過程是先用酸性調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)體系的pH至1.2?2.5，在30?40°C恒溫水浴條件下加入E/S
2.0%?5.0%胃蛋白酶進(jìn)行水解0.5?2h，然后用堿性調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)體系的pH至7.0?8.0，再加入E/S2.0%?5.0 %胰蛋白酶水解I?3h ;
[0022]當(dāng)步驟二所述的蛋白酶為中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的復(fù)合蛋白酶時(shí)，水解反應(yīng)過程是先滴加酸性調(diào)節(jié)劑或堿性調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)體系的pH至5.0?9.0，在30?60°C的溫度下加入E/S2 %?5 %作為內(nèi)肽酶的中性蛋白酶酶解I?3h，然后再加入E/S 2 %?5 %作為外肽酶的風(fēng)味蛋白酶酶解I?3h。
[0023]本發(fā)明所述的具有抗凝血活性的大豆肽的制備方法，以大豆蛋白為原料，選取合適的蛋白酶，在一定條件下酶解制備大豆抗凝血肽粗產(chǎn)品，然后采用膜技術(shù)進(jìn)行濃縮，并采用真空冷凍干燥技術(shù)或者低溫噴霧干燥技術(shù)，最終制備得到大豆抗凝血肽。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明抗凝血肽的酶解制備方法包含以下有益效果:
[0025]1、以大豆為原料開發(fā)抗凝血肽的技術(shù)，目前并未見相關(guān)專利文獻(xiàn)，本發(fā)明所述的酶解制備方法有效填補(bǔ)該領(lǐng)域空白。
[0026]2、采用大豆蛋白為原料開發(fā)蛋白肽，原料非常豐富，價(jià)格低廉，可滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。對(duì)于大豆蛋白產(chǎn)品多樣化、大豆生物活性肽在功能性食品、保健食品或者藥品中的開發(fā)利用具有重要的意義。
【具體實(shí)施方式】
[0027]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式抗凝血肽的酶解制備方法按下列步驟實(shí)施:
[0028]—、將大豆分離蛋白溶于蒸餾水中，制備得到大豆蛋白溶液；
[0029]二、將步驟一得到的大豆蛋白溶液加熱至60?90°C處理5?lOmin，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)體系的pH，然后加入蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)，滅酶處理后得到酶解溶液；
[0030]三、對(duì)酶解溶液進(jìn)行離心處理，收集上清液，然后采用截留分子量小于500的過濾膜進(jìn)行過濾，得到過濾后的酶解溶液；
[0031]四、將過濾后的酶解溶液在60?65°C、15?30MPa的條件下進(jìn)行均質(zhì)處理，得到均質(zhì)后的酶解溶液；
[0032]五、對(duì)均質(zhì)后的酶解溶液進(jìn)行殺菌處理，得到殺菌后的酶解溶液；
[0033]六、將殺菌后的酶解溶液進(jìn)行干燥處理，得到大豆抗凝血肽；
[0034]其中當(dāng)步驟二所述的蛋白酶為胃蛋白酶時(shí)，水解反應(yīng)過程是用酸性調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)體系的pH至1.2?2.5，在30?40 °C恒溫水浴條件下加入E/S 2.0%?5.0%的胃蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)0.5?4h ;
[0035]當(dāng)步驟二所述的蛋白酶為胰蛋白酶時(shí)，水解反應(yīng)過程是用堿性調(diào)節(jié)劑調(diào)