一種具有促進成骨細胞增殖活性的乳鐵蛋白肽的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物活性肽的制備方法，具體涉及一種以牛乳鐵蛋白為原料制備 具有促進成骨細胞增殖活性的乳鐵蛋白肽的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨質(zhì)疏松癥在我國是一種常見的多發(fā)疾病，它對中老年人，尤其是絕經(jīng)后婦女的 身體健康造成了十分嚴重的影響。骨質(zhì)疏松可以引起骨折胸廓畸形等多種并發(fā)癥，不僅使 患者本人飽受病痛折磨，還會使患者及家庭承受沉重的生活和經(jīng)濟壓力。據(jù)預(yù)計，到2020 年我國骨質(zhì)疏松和低骨量患者人數(shù)將增加至2. 8億。全國性大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查也顯示， 國內(nèi)骨質(zhì)疏松癥總患病率為12. 4%，老年人患病比例超過50%。骨質(zhì)疏松癥已嚴重威脅中 老年人健康，因此，有關(guān)骨質(zhì)疏松防治的功能性食品開發(fā)已經(jīng)成為當(dāng)今食品界的熱點問題。
[0003] 乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF)是一種具有轉(zhuǎn)鐵功能的糖蛋白，分子量大小約為 78kDa，主要存在于乳清蛋白中，是乳中重要的功能性成分。目前研究表明，乳鐵蛋白在生理 濃度下可以促進骨的合成代謝，LF可以誘導(dǎo)原代成骨細胞體外分化，也可促進成骨細胞系 的增殖，而且還可以作為存活因子，防止由于血清剝奪導(dǎo)致的成骨細胞凋亡，通過抑制破骨 細胞的發(fā)育和活性從而抑制骨吸收，因此LF可以作為一種潛在的骨質(zhì)疏松治療劑和骨修 復(fù)因子。
[0004] 乳鐵蛋白在被人體攝入后，必須要經(jīng)過胃腸道消化吸收。現(xiàn)代生物代謝研究表明， 人體攝取的蛋白質(zhì)經(jīng)消化道多種酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶、腸蛋白酶 等水解后，不是僅以氨基酸的形式吸收，更多的是以小肽的形式直接吸收，且乳鐵蛋白小肽 的生物活性可能要遠高于整個乳鐵蛋白分子。而且目前對乳鐵蛋白生物活性肽的研究，主 要集中在乳鐵蛋白肽的抗菌活性、抗病毒活性以及降血壓功能，但對促進成骨細胞增殖活 性的乳鐵蛋白肽卻未有報道。所以，研究開發(fā)一種具有更高促進成骨細胞增殖活性的乳鐵 蛋白肽具有良好的開發(fā)和應(yīng)用潛力。
[0005] 乳鐵蛋白作為牛乳中重要的功能性成分，對其生物活性肽的研究較多，目前，骨質(zhì) 疏松癥的治療方法較多，但仍以藥物治療為主。常用的藥物有骨吸收抑制劑、骨形成促進劑 和骨礦化物。骨吸收抑制劑是主要針對破骨細胞的藥物，通過抑制破骨細胞的活動而減少 骨的重吸收；骨形成促進劑則是主要針對成骨細胞的藥物，能夠增強成骨細胞的活性，促進 新骨的合成；礦化物是治療骨質(zhì)疏松的基礎(chǔ)用藥，包括鈣劑和維生素 D，可以起到補充骨基 質(zhì)成分的作用。但當(dāng)前治療骨質(zhì)疏松的藥物絕大多數(shù)為骨吸收抑制劑（如雌激素、雙膦酸 鹽、降鈣素等），而骨形成促進劑的種類卻非常少。而具有促進成骨細胞增殖活性的乳鐵蛋 白肽可作為一種潛在的骨形成促進劑用于治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松劑。所以，對乳鐵蛋白促進 成骨細胞增殖活性肽的研究開發(fā)具有廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有缺少從乳鐵蛋白中獲取促進成骨細胞增殖活性的 蛋白肽的方法，從而提供一種具有促進成骨細胞增殖分化活性的乳鐵蛋白肽及其制備方 法。
[0007] 本發(fā)明具有促進成骨細胞增殖活性的乳鐵蛋白肽的制備方法按以下步驟實現(xiàn)：
[0008] -、將乳鐵蛋白與去離子水混合，制備成質(zhì)量濃度為2%~8%的乳鐵蛋白水溶 液，然后用HCl調(diào)節(jié)體系的pH至1. 2~2. 5,得到乳鐵蛋白溶液；
[0009] 二、將胃蛋白酶添加到步驟一得到的乳鐵蛋白溶液中，在35 °C~40 °C水浴3~ IOmin后冰浴冷卻，加入堿性調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)體系的pH至6~7終止反應(yīng)，然后離心處理獲取上 清液，除鹽后得到乳鐵蛋白活性肽的酶解液；
[0010] 三、將乳鐵蛋白活性肽的酶解液進行膜過濾，然后通過SP Sepharose Fast Flow 陽離子交換柱分離純化，采用緩沖溶液A和緩沖溶液B線性梯度洗脫，檢測波長為215nm和 280nm，收集第5個峰的洗脫組分，再經(jīng)過透析除鹽后凍干，得到初步分離純化的乳鐵蛋白 活性肽；
[0011] 四、用去離子水將初步分離純化的乳鐵蛋白活性肽配制成濃度為1~3mg/mL的乳 鐵蛋白活性肽溶液，經(jīng)濾膜過濾后采用Superdex Peptide 10/300GL凝膠過濾層析柱進行 純化，采用緩沖溶液A洗脫，檢測波長為215nm和280nm，收集第1個峰的洗脫組分，超濾濃 縮后得到乳鐵蛋白肽溶液；
[0012] 五、通過真空冷凍干燥或低溫噴霧干燥對乳鐵蛋白肽溶液進行干燥處理，得到具 有促進成骨細胞增殖活性的乳鐵蛋白肽；
[0013] 其中所述的緩沖溶液A為pH = 7. 0~7. 5的磷酸鹽緩沖溶液（PBS)，向緩沖溶液 A中添加 NaCl，得到含有0. 5~2mol/L NaCl的緩沖溶液B。
[0014] 本發(fā)明制備得到的具有促進成骨細胞增殖活性的乳鐵蛋白肽的應(yīng)用是將該具有 促進成骨細胞增殖活性的乳鐵蛋白肽作為功能性組分應(yīng)用于保健食品或功能性食品中。
[0015] 本發(fā)明具有促進成骨細胞增殖活性的乳鐵蛋白肽的制備方法，是以牛乳鐵蛋白為 原料，利用胃蛋白酶對牛乳鐵蛋白進行一定時間的消化處理，制成具有促進成骨細胞增殖 活性的乳鐵蛋白肽粗產(chǎn)品，再經(jīng)陽離子交換層析和凝膠層析對乳鐵蛋白肽進行分離純化， 并采用真空冷凍干燥或低溫噴霧干燥法進行最終產(chǎn)品的制備。本發(fā)明對乳鐵蛋白肽在功能 性食品或者預(yù)防骨質(zhì)疏松藥品中的開發(fā)利用具有重要的意義。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有促進成骨細胞增殖活性的乳鐵蛋白肽的制備方法包 含以下有益效果：
[0017] 1、本發(fā)明中所述的制備牛乳鐵蛋白肽的方法簡單、安全，可大規(guī)模生產(chǎn)，且所產(chǎn)生 的乳鐵蛋白肽具有比完整乳鐵蛋白分子更高的促進成骨細胞增殖的活性。
[0018] 2、本發(fā)明采用陽離子交換層析梯度洗脫的方法，結(jié)合超濾濃縮、凝膠過濾層析等 方法分離出高活性的乳鐵蛋白肽。
[0019] 3、本發(fā)明所涉及的牛乳鐵蛋白為天然可食用成分，對人體無害，對成骨細胞具有 良好的促進其增殖的效果，可作為一種骨質(zhì)疏松癥治療劑，具備實際開發(fā)的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0020] 圖1為實施例一陽離子交換層析的洗脫曲線圖，1 一吸光度，2-電導(dǎo)率；
[0021] 圖2為實施例一凝膠過濾層析的洗脫曲線圖；
[0022] 圖3為不同濃度的乳鐵蛋白肽對成骨細胞增殖活性的柱狀圖。
【具體實施方式】
【具體實施方式】 [0023] 一：本實施方式具有促進成骨細胞增殖活性的乳鐵蛋白肽的制備方 法按以下步驟實現(xiàn)：
[0024] -、將乳鐵蛋白與去離子水混合，制備成質(zhì)量濃度為2%~8%的乳鐵蛋白水溶 液，然后用HCl調(diào)節(jié)體系的pH至1. 2~2. 5,得到乳鐵蛋白溶液；
[0025] 二、將胃蛋白酶添加到步驟一得到的乳鐵蛋白溶液中，在35°C~40°C水浴3~ IOmin后冰浴冷卻，加入堿性調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)體系的pH至6~7終止反應(yīng)，然后離心處理獲取上 清液，除鹽后得到乳鐵蛋白活性肽的酶解液；
[0026] 三、將乳鐵蛋白活性肽的酶解液進行膜過濾，然后通過SP Sepharose Fast Flow 陽離子交換柱分離純化，采用緩沖溶液A和緩沖溶液B線性梯度洗脫，檢測波長為215nm和 280nm，收集第5個峰的洗脫組分，再經(jīng)過透析除鹽后凍干，得到初步分離純化的乳鐵蛋白 活性肽；
[0027] 四、用去離子水將初步分離純化的乳鐵蛋白活性肽配制成濃度為1~3mg/mL的乳 鐵蛋白活性肽溶液，經(jīng)濾膜過濾后采用Superdex Peptide 10/300GL凝膠過濾層析柱進行 純化，采用緩沖溶液A洗脫，檢測波長為215nm和280nm，收集第1個峰的洗脫組分，超濾濃 縮后得到乳鐵蛋白肽溶液；
[0028] 五、通過真空冷凍干燥或低溫噴霧干燥對乳鐵蛋白肽溶液進行干燥處理，得到具 有促進成骨細胞增殖活性的乳鐵蛋白肽；
[0029] 其中所述的緩沖溶液A為pH = 7. 0~7. 5的磷酸鹽緩沖溶液（PBS)，向緩沖溶液 A中添加 NaCl，得到含有0. 5~2mol/L NaCl的緩沖溶液B。
[0030] 本實施方式所述的堿性調(diào)節(jié)劑為NaOH溶液、碳酸氫鈉溶液或碳酸氫鉀溶液。
【具體實施方式】 [0031] 二：本實施方式與一不同的是步驟二將胃蛋白酶添加 到步驟一得到的乳鐵蛋白溶液中，使酶活力與乳鐵蛋白的比值為lOOU/g~250U/g。其它步 驟及參數(shù)與一相同。
【具體實施方式】 [0032] 三：本實施方式與一或二不同的是步驟二在37°C水 浴5min。其它步驟及參數(shù)與一或二相同。
【具體實施方式】 [0033] 四：本實施方式與一至三之一不同的是步驟二以 5000~1000 Orpm的速度離心處理獲取上清液。其它步驟及參數(shù)與一至三之 一相同。
【具體實施方式】 [0034] 五：本實施方式與一至四之一不同的是步驟三所述的 膜過濾的孔徑為〇. 1 μπι或者0. 22 μπι。其它步驟及參數(shù)與一至四之一相同。
【具體實施方式】 [0035] 六：本實施方式與一至五之一不同的是步驟三所述的 陽離子交換柱分離純化過程如下：先使用緩沖溶液A洗脫3~7個柱體積（CV)，再用緩沖 溶液B洗脫3~5個柱體積，洗脫流速控制為3~7mL/min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方 式一至五之一相同。
[0036]
【具體實施方式】七：本實施方式與【具體實施方式】一至六之一不同的是步驟四所述的 凝膠過濾層析進行純化過程如下：先使用緩沖溶液A進行平衡，然后再使用緩沖溶液A洗脫 1~3個柱體積，洗脫流速為0. 2~lmL/min。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至六之一 相同。
【具體實施方式】 [0037] 八：本實施方式與一至七之一不同的是步驟四所述的 超濾濃縮是采用截留分子量為500D的再生纖維素膜進行濃縮。其它步驟及參數(shù)與具體實 施方式一至七之一相同。
【具體實施方式】 [0038] 九：本實施方式與一至八之一不同的是步驟五所述的 真空冷凍干燥過程中控制冷阱溫度為-73~-40°C，真空度為0. 01~0. 5mbar，干燥時間為 3~24h。其它步驟及參數(shù)與一至八之一相同。
【具體實施方式】 [0039] 十：本實施方式與一至九之一不同的是步驟五所述 的低溫噴霧干燥控制