貝類中諾如病毒檢測質(zhì)控試劑盒和非診斷性檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種貝類中諾如病毒檢測質(zhì)控試劑盒和非診斷性非診斷性檢測方法， 屬于食品安全、環(huán)境監(jiān)測和食源性病毒檢測的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 諾如病毒是杯狀病毒科呈二十面體對稱球形單股正鏈RNA病毒，又稱為諾羅 病毒、諾沃克病毒或膿融病毒，是一種引起非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病毒，以腸道傳 播為主，可通過污染的水源、食物、物品、空氣等傳播。諾如病毒基因組全長約7. 7kb，包 含3個開放閱讀框（ORFs)，ORFl編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括RNA聚合酶（RNA-cbpendent RNA polymerase，RdRp) ;0RF2和0RF3分別編碼主要（VPl)和次要（VP2)衣殼蛋白；根據(jù)VPl序 列的同源性，諾如病毒可分為GI~GV五個基因群（Genogroup)，其中引起人類感染的主要 是G I和G II群
[0003] 由于該病毒多以食物尤其是濾食性雙殼貝類如牡蠣等水產(chǎn)品作為傳播載體，加之 人們生食貝類的習(xí)慣由來已久，由貝類中的諾如病毒引起的食品安全性問題越來越受到世 界各國的重視。開展貝類中諾如病毒的快速檢測及滅活研究，對保障我國人民食品安全，提 高出口食品質(zhì)量以及創(chuàng)造經(jīng)濟價值都至關(guān)重要。在我國及世界上大多數(shù)國家，對于食品類 產(chǎn)品中諾如病毒檢測缺乏標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制體系，原因主要在于缺乏有效，簡單、快速、可靠的 技術(shù)用于濃縮和檢測這些病原。實時熒光RT-PCR等分子檢測方法由于其高度靈敏、特異的 特點，是目前用于檢測樣本中食源性病毒的最有效方法，

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種貝類中諾如病毒檢測質(zhì)控試劑盒和非診 斷性非診斷性檢測方法，能夠監(jiān)控整個檢測過程并保證檢測結(jié)果的有效性。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] 本發(fā)明提供的貝類中諾如病毒檢測質(zhì)控試劑盒包括NV G I +G II分型2XRT-PCR mix、MS2 2 X RT-PCR mix、無 RNase水、NV G I +G II陽性對照、大腸桿菌噬菌體 MS2(2.5X101Qpfu/mL)各一管。
[0007] NV G I +G II分型 2XRT-PCR mix、MS2 2XRT-PCR mix 中涉及的檢測引物和探針 如下：
[0008] (1)諾如病毒檢測引物和探針
[0009] 諾如病毒G I :
[0010] 正向引物 NVGl-F :5' -CGYTGGATGCGNTTYCAT-3'
[0011] 反向引物 NVGl-R :5' -CCTTAGACGCCATCATCATTYAC-3'
[0012] 探針 NVGl-P :5' -Cy5-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-BHQ-3'
[0013] 諾如病毒G II:
[0014] 正向引物 NVG2-F : 5 ' -ATGTTCYGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3 '
[0015] 反向引物 NVG2-R :5' -TCGACGCCATCTTCATTCACA-3'
[0016] 探針 NVG2-P : 5 ' -FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-BHQ-3 '
[0017] (2)大腸桿菌噬菌體MS2檢測引物和探針
[0018] MS2-TM3-F : 5' -GGCTGCTCGCGGATACCC-3
[0019] MS2-TM3-R : 5' -TGAGGGAATGTGGGAACCG-3
[0020] MS2-TM2J0E :5' -J0E-ACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGT-NFQ-3'
[0021] 除了引物，NV G I +G II分型 2XRT - PCR mix、大腸桿菌噬菌體 MS2 2XRT - PCR mix中其他的試劑，例如酶、dNTP等均為現(xiàn)有的公知試劑。
[0022] 本發(fā)明還提供一種利用本發(fā)明的試劑盒來檢測貝類中諾如病毒的方法，包括以下 步驟：
[0023] ①貝類中諾如病毒的富集
[0024] a、貝類樣品須是活的或者冷凍未破壞，泥土等必須去掉，不能重新浸泡在水里。冰 上操作，用鑷子、手術(shù)刀等打開貝類外殼，分離消化腺（digestive glands)，取10個貝（不 足10個全部取樣）的樣品，用無菌剪刀將內(nèi)臟團剪碎混合；取混合樣2g±0. 2g到50mL離 心管（或其他無菌離心管）中作為提取RNA的樣品，其余-80°C留存。
[0025] b、分別加 ImL的蛋白酶K工作液和100 μ L過程控制物質(zhì)大腸桿菌噬菌體MS2,漩 渦混勻。
[0026] c、37°C搖床孵育 lh，320r/min ;60°C水浴 15min。
[0027] d、4°C，3000Xg離心5min，取上清，并記錄上清液體積為VI，分裝500 yL提取 RNA，其余上清液-80°C保存留樣。
[0028] ②病毒RNA提取
[0029] ③大腸桿菌噬菌體MS2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0030] 取制備好的大腸桿菌噬菌體MS2質(zhì)控樣品，稀釋至2. 5X 101° pfu/mL，取100 μ L 進行提取病毒RNA，最終稀釋于100 μ L無 RNA酶H2O中；取20 μ L稀釋于180 μ L無 RNA酶 H2O,梯度稀釋10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍，則病毒濃度分別代表2. 5 X 109、 2. 5X10S、2. 5Χ107、2· 5Χ106、2· 5Χ105、2· 5X104pfu/mL，分別進行熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)， 應(yīng)用Ct值和噬菌體濃度建立回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0031] ④諾如病毒、大腸桿菌噬菌體MS2檢測
[0032] 諾如病毒、大腸桿菌噬菌體MS2兩種目標(biāo)分別檢測，每個檢測目標(biāo)反應(yīng)體系包括： 2XRT-PCR mix 12. 5 μ L、樣品5 μ L、水補齊至25 μ L，每個樣品做原倍提取液和IOX稀釋 提取液，同時設(shè)置陽性對照和陰性對照。
[0033] ⑤病毒RNA回收率確定
[0034] 根據(jù)MS2熒光定量RT -PCR反應(yīng)獲得的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計算出MS2濃 度，除以加樣時的病毒濃度，乘以100%即為回收率，通過回收除以0.5,并乘以總檢測勻漿 體積，來計算提取效率
[0036] ⑥結(jié)果判定
[0037] 檢測結(jié)果判定必須在陽性對照和陰性對照成立的情況下做如下判定：
[0038] 根據(jù)MS2的回收效率判定結(jié)果的有效性；若病毒RNA回收率大于或等于1 %測試 有效，根據(jù)檢測情況判定甲型肝炎病毒和諾如病毒結(jié)果；若病毒RNA回收率小于1%，則需 要重新進行檢測。
[0039] 本發(fā)明所述的大腸桿菌噬菌體MS2及其大腸桿菌噬菌體MS2質(zhì)控樣品依據(jù)發(fā)明專 利號是2015102273402,發(fā)明名稱是《大腸桿菌噬菌體MS2標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法》的公開 內(nèi)容制備。
[0040] 本發(fā)明的有益效果：
[0041] 本發(fā)明設(shè)計了大腸桿菌噬菌體MS2與諾如病毒G I和G II的RT-PCR檢測引物。
[0042] 本發(fā)明利用大腸桿菌噬菌體MS2與諾如病毒在形態(tài)、大小、對環(huán)境的耐受力與病 毒粒子相似以及對人體無危害等特性，構(gòu)建了貝類中諾如病毒檢測質(zhì)控試劑盒和非診斷性 非診斷性檢測方法，即通過特定濃度的大腸桿菌噬菌體MS2監(jiān)控整個處理和檢測過程，并 提供標(biāo)準(zhǔn)的樣品處理濃縮方法和實時熒光RT-PCR方法，從樣品中病毒濃縮、病毒RNA提取、 回收效率和結(jié)果判定等步驟進行全過程的質(zhì)量控制，使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確、更有效、更穩(wěn)定， 準(zhǔn)確監(jiān)控病毒顆粒裂解效率和核酸提取等整個檢測過程的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)體系，對貝類加工 企業(yè)產(chǎn)品和食源性病毒的監(jiān)測和質(zhì)量控制具有重要意義，彌補了現(xiàn)行檢測技術(shù)的不足。
[0043] 附圖或附表說明：
[0044] 圖1為本發(fā)明實施例1中大腸桿菌菌體MS2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖中，橫坐標(biāo)為大腸桿 菌噬菌體MS2的濃度（pfu/mL)，縱坐標(biāo)為實時熒光RT-PCR Ct值。
[0045] 圖2為本發(fā)明實施例1中大腸桿菌噬菌體MS2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖中，橫坐標(biāo)為實時熒 光RT-PCR Ct值，縱坐標(biāo)為實時熒光RT-PCR熒光強度。
[0046] 圖3為本發(fā)明實施例2中貝類樣品添加大腸桿菌噬菌體MS2的回收效率測定結(jié) 果，圖中，橫坐標(biāo)為實時熒光RT-PCR Ct值，縱坐標(biāo)為實時熒光RT-PCR熒光強度。
[0047] 圖4為本發(fā)明實施例3中貝類樣品諾如病毒G I的檢測結(jié)果；圖中，橫坐標(biāo)為實時 熒光RT-PCR Ct值，縱坐標(biāo)為實時熒光RT-PCR熒光強度。
[0048] 圖5為本發(fā)明實施例3中貝類樣品諾如病毒G II的檢測結(jié)果；圖中，橫坐標(biāo)為實時 熒光RT-PCR Ct值，縱坐標(biāo)為實時熒光RT-PCR熒光強度。
【具體實施方式】：
[0049] 下面通過具體實施例并結(jié)合附圖或附表進一步闡述本發(fā)明。
[0050] 實施例1 :大腸桿菌噬菌體MS2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0051] 1、取試劑盒中的大腸桿菌噬菌體MS2質(zhì)控樣品（2. 5X lO'fu/mL)，取100 μ L進 行提取病毒RNA，最終稀釋于100 μ L無 RNA酶H2O中；取20 μ L RNA提取液稀釋于180 μ L 無 RNA酶Η20,梯度稀釋10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍，則病毒濃度分別代 表 2· 5Χ109、2· 5X10S、2. 5Χ107、2· 5Χ106、2· 5Χ105、2· 5X104pfu/mL，分別進行熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。
[0052] 2、對Ct值和噬菌體濃度建立回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線。儀器根據(jù)賦值和Ct值自動生成標(biāo)準(zhǔn) 曲線（見圖1和2) :y = 58. 716-3. 3521nx(y為Ct值，X為大腸桿菌噬菌體MS2濃度（pfu/ mL))，R2= 0.982,擴增效率為 98. 74%。
[0053] 實施例2 :貝類樣品添加大腸桿菌噬菌體MS2的回收效率測定
[0054] 1、材料和方法
[0055] (1)菌株和毒株
[0056] 大腸桿菌噬菌體MS2標(biāo)準(zhǔn)樣品：來源于ATCC，實驗室大量制備。
[0057] (2)試劑
[0058] PBS 緩沖液（ρΗ7· 0)。
[0059] 蛋白酶K工作溶液（蛋白酶K(30U/mg)，20±0.1 mg;水，200±2mL;將蛋白酶K溶 解于水中，混勻；于-20°C儲存常用的工作體積，保存期6個月；一旦解凍，儲存于4°C，保質(zhì) 期1周）。
[0060] 病毒 RNA 提取試劑盒：QIAGEN RNeasy mini Kit (Cat No 74106)。
[0061] RT - PCR 試劑盒：THE RNA COMPANY AMBION AgPath - ID? One - step RT - PCR Kit(P/N ：AM1005) 〇
[0062] (3)實驗儀器和材料
[0063] 熒光定量 PCR 儀：ABI 7500 ;
[0064] 離心管：50mL、2mL、I. 5mL，WHATS0N 公司；
[0065] DK - 8D型電熱恒溫水槽：上海森信實驗儀器有限公司；
[0066] ZD - 85丨旦溫振蕩器：國華；
[0067] 赤貝樣品：青島市團島水產(chǎn)市場購買。
[0068] (4)方法
[0069] ①貝類中諾如病毒的富集
[0070] a、貝類樣品須是活的或者