一種人類糞便甲基化dna的pcr檢測引物體系的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，即人類糞便甲基化DNA的PCR檢測引物體系。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA甲基化是指DNA鏈上CpG位點的胞嘧啶(C)殘基的5’碳上被修飾了一個甲基。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修飾之一，是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分。DNA甲基化特征性地發(fā)生在DNA鏈上的CpG 二核苷酸的胞嘧啶(C)殘基上，這常見于基因5’端表達(dá)調(diào)控序列。DNA甲基化在基因表達(dá)的調(diào)控中具有重要作用，參與了動物胚胎發(fā)育、基因印記和X染色體失活等過程。研究表明，DNA甲基化的改變能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)互相作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。
[0003]人類異常的DNA甲基化多發(fā)生在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，引起相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)閉，使基因喪失功能。多種癌癥的發(fā)生與DNA異常甲基化有關(guān)，通過對DNA甲基化的檢測，可以提供體內(nèi)是否存在癌細(xì)胞的信息。一般的，糞便中甲基化DNA的存在，可能與大腸癌的發(fā)生有關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)許多個與大腸癌發(fā)生有關(guān)的甲基化基因。這些甲基化基因的改變，發(fā)生在細(xì)胞癌變的早期，其中一些基因的甲基化只發(fā)生在癌變的細(xì)胞，因而可用于檢測癌癥的基因標(biāo)志。對糞便中這些甲基化基因的檢測，將有助于發(fā)現(xiàn)大腸癌的早期信號。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在提供一種人類糞便甲基化DNA的PCR檢測引物體系，該引物體系及用該引物體系進(jìn)行的鑒定方法可快速準(zhǔn)確的檢測人類糞便的DNA
是否發(fā)生變化。
[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供的一種人類糞便甲基化DNA的PCR檢測引物體系采用了如下的技術(shù)方案:
一種人類糞便甲基化DNA的PCR檢測引物體系，其特征在于:所述的引物體系由以下12個甲基化DNA的PCR擴增引物對組成:
(1)SNCA基因引物對1:
正向引物:5 ’ -TGCGGGTTGTAGCGTAGATTTCG-3 ’
反向引物:5’ -CCGCTATAAACCGACGACGC-3’ ；
(2)SPG20基因引物對I1:
正向引物:5 ’ -TGACGCGAAGCGTTCGAGAG-3 ’
反向引物:5’ -ACGCTCGCCGAAAACCGATC-3’ ；
(3)ADAMTSI基因引物對II1:
正向引物:5 ’ -AGGATCGTTCGGTTGTTCGGT-3 ’
反向引物:5’ -AAACGCTCTAAAACGCCTCCG-3’ ；
(4)SFRP5基因引物對IV:正向引物:5 ’ -GCGTACGGCGAGGTTCGGGT-3 ’
反向引物:5’ -CTCGATACCCGACGACCCAAAT-3’ ；
(5)SLC5A8基因引物對V:
正向引物:5 ’ -TAGCGGGTCGATTTTTCGAGG-3 ’
反向引物:5’ -CTAACGCGCAAACGTAACGTC-3’ ；
(6)IGFBP3基因引物對VI:
正向引物:5’ -GTTTTCGTAGTCGTGTTTGCGT-3’
反向引物:5’ -ACTCGCATCTAAACGACCCGA-3’ ；
(7)GALR2基因引物對VII:
正向引物:5 ’ -GATTTCGGATTTTGCGTGTGCG-3 ’
反向引物:5’ -CTCGACGATCCCGAAATATCC-3’ ；
(8)SLC16A12基因引物對VID:
正向引物:5 ’ -AGTTTTCGGCGGAGTTGGCG-3 ’
反向引物:5’ -CGAACTAAACGAAAACGCCGAC-3’ ；
(9)SP0CK2基因引物對IX:
正向引物:5 ’ -TGCGGATTTACGTTTCGGAAGCG-3 ’
反向引物:5’ -TAACCGCGACAACCCTAACCGA-3’ ；
(10)TLX2基因引物對X:
正向引物:5 ’ -TGTATTCGGAGTAGTCGCGTTCG-3 ’
反向引物:5’ -ACCCGAACCGATCCGTCAATCA-3’ ；
(11)HLTF基因引物對XI:
正向引物:5 ’ -GTTTTTGATTCGGCGTTCGGAA-3 ’
反向引物:5’ -TCCAAACCGTTAAACCGAACGC-3’ ；
(12)HPPl基因引物對XII:
正向引物:5 ’ -GTTTTTCGCGTTTTCGGCGTAG-3 ’
反向引物:5 ’ -AACATCCCGCGAACGACGAC-3 ’。
[0006]優(yōu)選的，所述的每條引物序列中包含2-3個CpG位點。
[0007]優(yōu)選的，所述的引物體系的基因的每個引物序列的長度，呈梯度分布。
[0008]優(yōu)選的，所述的每條引物PCR擴增產(chǎn)物的變性溫度在82-84°C。
[0009]優(yōu)選的，提供了一種人類糞便甲基化DNA的PCR檢測試劑盒，其特征在于:包括一組甲基化DNA的PCR擴增引物和相應(yīng)的PCR擴增體系。
[0010]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明設(shè)計獨特的甲基化基因PCR擴增引物，克服目前的甲基化基因檢測技術(shù)靈敏度不夠高、檢測穩(wěn)定性差缺點，提供一種人類糞便甲基化DNA的PCR檢測引物體系，該引物體系及用該引物體系進(jìn)行的鑒定方法可快速準(zhǔn)確的檢測人類糞便的DNA是否發(fā)生變化。本發(fā)明在甲基化DNA特異性多重PCR擴增技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過對引物序列的選擇，使設(shè)計的引物不僅保證PCR產(chǎn)物的長度呈梯度分布；各？0?產(chǎn)物的退火溫度保持接近，實現(xiàn)多重PCR條件下的非甲基化DNA的PCR產(chǎn)物在特定溫度下的部分變性，從而可以被單鏈DNA特異性外切核酸酶消化移除，使甲基化DNA的檢測靈敏度得到提高；通過使用毛細(xì)管電泳檢測PCR產(chǎn)物，有效提高甲基化DNA檢測的穩(wěn)定性和重復(fù)性；多重PCR —次性檢測多個甲基化基因，提高檢測效率；本試劑盒包括一組甲基化DNA的PCR擴增引物和相應(yīng)的PCR擴增體系。由于人糞便DNA含有大量人類腸道細(xì)菌DNA，一般的PCR擴增體系不能滿足人源性DNA的PCR擴增的條件需要，所以本試劑盒的檢測體系是為檢測人糞便甲基化DNA所優(yōu)化的。
【附圖說明】
[0011 ] 圖1大腸癌患者糞便中甲基化DNA檢測實例。
【具體實施方式】
[0012]為了更清楚的理解本發(fā)明提供的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體的實施例對技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明。
實施例
[0013]近年來的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞癌變與基因的異常甲基化改變有關(guān)，通過對樣品中甲基化基因的檢測，可以提示相應(yīng)樣品中癌細(xì)胞的存在。對甲基化基因的檢測，通常是用重亞硫酸鹽處理樣品DNA，將DNA鏈上所有不發(fā)生甲基化的C堿基轉(zhuǎn)變?yōu)閁，而一般DNA聚合酶識別U為T。根據(jù)重亞硫酸鹽處理過的DNA序列，可以設(shè)計甲基化DNA特異的PCR擴增引物。本發(fā)明設(shè)計獨特的甲基化基因PCR擴增引物，克服目前的甲基化基因檢測技術(shù)靈敏度不夠高、檢測穩(wěn)定性差缺點，提供一種人類糞便甲基化基因檢測新方法和相應(yīng)的試劑盒。
[0014]本發(fā)明旨在提供一種人類糞便甲基化DNA的PCR檢測引物體系，該引物體系及用該引物體系進(jìn)行的鑒定方法可快速準(zhǔn)確的檢測人類糞便的DNA是否發(fā)生變化。甲基化基因PCR擴增引物的設(shè)計，是根據(jù)相應(yīng)基因的序列，經(jīng)重亞硫酸鈉處理轉(zhuǎn)化后的DNA序列。
[0015]本發(fā)明的技術(shù)方案具體方案如下:
篩選出一組12個基因，根據(jù)目標(biāo)檢測區(qū)域甲基化DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理轉(zhuǎn)化后是的序列，設(shè)計PCR引物。使每條引物序列中包含2-3個CpG位點，以提高引物對甲基化DNA的偏向性擴增；使這一組基因的每個PCR擴增產(chǎn)物的長度，呈梯度分布；使每個PCR擴增產(chǎn)物的變性溫度在82-84度。各個基因啟動子區(qū)域的甲基化DNA擴增PCR引物序列如下:
(1)SNCA基因引物對1:
正向引物:5 ’ -TGCGGGTTGTAGCGTAGATTTCG-3 ’
反向引物:5’ -CCGCTATAAACCGACGACGC-3’ ；
(2)SPG20基因引物對I1:
正向引物:5 ’ -TGACGCGAAGCGTTCGAGAG-3 ’
反向引物:5’ -ACGCTCGCCGAAAACCGATC-3’ ；
(3)ADAMTSI基因引物對II1:
正向引物:5 ’ -AGGATCGTTCGGTTGTTCGGT-3 ’
反向引物:5’ -AAACGCTCTAAAACGCCTCCG-3’ ；