薏苡仁源降壓多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種薏苡仁源降壓多肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 薏該仁為禾本科植物薏該（0〇丨11&(^5〇]1&-」〇13；[1^.￥&1'.11167皿11(1?0111611.)3七&口；0的 干燥成熟種仁，主產(chǎn)于福建、河北、遼寧等地。性甘、淡、微寒，歸脾、胃、肺經(jīng)。具有利水滲濕、 健脾止瀉、清熱排膿、除弊的功效?！侗静菥V目》將其列為上品養(yǎng)心藥。根據(jù)現(xiàn)代藥理研究表 明薏苡仁具有降壓作用并可藥食兼用，薏苡仁在臨床上具有明確的降壓療效。
[0003] 近年來，高血壓患病主體越來越年輕化，患病率呈逐年增加的趨勢。目前我國成人 高血壓患病率已達(dá)到25%_30%，成為世界上高血壓患病大國。治療高血壓的藥物多為化學(xué) 合成藥物，患者長期服用會產(chǎn)生各種各樣的副作用。隨著人們健康意識的不斷提高，具有降 壓作用的非化學(xué)合成替代品日益受到人們的親睞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
[0005] 本發(fā)明的多肽對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶具有抑制作用。
[0006] 本發(fā)明的多肽具有降壓作用。
[0007] 本發(fā)明的多肽可用于制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑。
[0008] 本發(fā)明的多肽可用于制備降壓藥物。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種小分子量多肽提取物，其由如下方法制備：
[0010]將薏苡仁藥材粉碎，脫脂，干燥，然后室溫下使用硼酸鈉緩沖液提取谷蛋白；將獲 得的谷蛋白溶解于胃蛋白酶溶液中，37°C進(jìn)行水解，所述胃蛋白酶與所述谷蛋白的質(zhì)量比 為1:10;反應(yīng)終止后離心，取上清液，過濾;采用截留分子量為3KDa的超濾膜在0.1 Mpa下進(jìn) 行超濾，收集< 3KDa組分，獲得所述小分子量多肽提取物，即下文中所述的< 3KDa組分。
[0011] 本發(fā)明的又一個目的是提供一種多肽提取物，其由如下方法制備：
[0012] 所述的小分子量多肽提取物經(jīng)冷凍干燥，采用Sephadex G-10進(jìn)行凝膠過濾色譜 (1.6 X 60cm)純化;色譜條件為超純水作為洗脫液，流速lmL/min，使用HD-4核酸蛋白檢測儀 在220nm下檢測，收集出峰時間為75-100min的組分，獲得所述多肽提取物，即下文中所述的 組分F5。
[0013] 本發(fā)明的又一個目的是提供一種具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)活性的保健食品，其包含所述 的小分子量多肽提取物。
[0014] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，所述血管緊張素轉(zhuǎn)化 酶抑制劑的活性成分為所述的多肽、所述小分子量多肽提取物或所述多肽提取物。
[0015] 本發(fā)明的又一個目的是提供一種降壓藥物，所述降壓藥物的活性成分為所述的多 肽、所述小分子量多肽提取物或所述多肽提取物。
[0016] 本發(fā)明的多肽、小分子量多肽提取物和多肽提取物對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶具有明顯 的抑制作用，具有顯著的降壓效果。
【附圖說明】
[0017]圖1顯示了 < 3KDa組分凝膠過濾色譜圖。
[0018]圖2顯示了反相-高效液相色譜法(RP-HPLC)的色譜圖，
[0019] 其中，a為HA對照品，b為HHL對照品，c為空白對照，d為卡托普利陽性對照，e為七肽 GAAGGAF〇
[0020] 圖3顯示了七肽GAAGGAF單次給藥SHR大鼠血壓變化圖。
[0021] 圖4顯示了組分F5單次給藥SHR大鼠血壓變化圖。
[0022] 圖5顯示了 < 3KDa組分單次給藥SHR大鼠血壓變化圖。
[0023]圖6顯示了 < 3KDa組分對腹腔巨噬細(xì)胞的ACP活性的影響，
[0024]其中，每個值表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差;不同的字母表示顯著差異(P〈0.05)。
[0025] 圖7顯示了 < 3KDa組分對RAW264.7細(xì)胞中NO生成的影響，
[0026] 其中，不同的字母表示顯著差異(P〈0.05)。
[0027] 圖8顯示了重復(fù)給藥21天后< 3KDa組分對小鼠體重的影響。
【具體實施方式】
[0028] 本發(fā)明的發(fā)明人通過如下研究發(fā)現(xiàn)了可能具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制(ACEI)活 性的七肽GAAGGAF:
[0029] 薏苡仁藥材(產(chǎn)地福建)經(jīng)粉碎，過40目篩，石油醚脫脂，低溫振蕩4h，離心棄上清， 真空干燥。使用0.0125M硼酸鈉緩沖液（1 % SDS，2 % β-巰基乙醇，pH= 10.0)室溫下從干燥后 的薏苡仁粉末中提取谷蛋白。谷蛋白提取液于4°C低溫透析24h，期間換水?dāng)?shù)次，谷蛋白液冷 凍干燥獲得谷蛋白。
[0030] 準(zhǔn)確稱取谷蛋白（作為底物，濃度為2% (w/v)，胃蛋白酶與底物的比為1:10(w/ w))，將其溶于胃蛋白酶溶液(0.01M HC1)中，37°C恒溫水浴48h，反應(yīng)結(jié)束后，100°C煮沸 5min終止反應(yīng)，冰浴至室溫，在lOOOOrmp，4°C離心，取上清液，經(jīng)G4漏斗過濾。
[0031] 經(jīng)過G4漏斗的收集液，置于卷式膜小型實驗機(jī)中進(jìn)行超濾，其中卷式膜的截留分 子量為3KDa，超濾壓力為0 · IMpa，溫度25°C。收集< 3KDa組分。
[0032] 超濾所得的< 3KDa組分冷凍干燥，然后通過Sephadex G_10(l .6X60cm)凝膠過濾 色譜。色譜條件:超純水為洗脫液，恒流栗調(diào)節(jié)流速lmL/min，使用HD-4核酸蛋白檢測儀在 220nm下檢測，根據(jù)洗脫峰收集各組分。收集到分子量不同的5個組分，分別標(biāo)記為組分F1-F5(如圖1所示）。
[0033]使用高效液相色譜法對組分F1-F5進(jìn)行體外ACE I活性的測定。
[0034]檢測體外ACEI活性的原理為人工合成的三肽底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL，美國Sigma公司），在ACE酶的作用下生成馬尿酸，通過228nm檢測馬尿酸的生 成量來評價ACEI活性。當(dāng)ACE抑制劑與ACE作用后，ACE活性受到抑制，與HHL作用生成的馬尿 酸量減少，因此測定加入抑制劑前后馬尿酸的生成量即可反映抑制劑對ACE的抑制程度。 [0035] 反應(yīng)體系：總反應(yīng)液為50yL，其中樣品溶液10yL、ACE溶液20yL(2mU)和HHL溶液20μ L(2mM)。樣品與ACE溶液充分混勻后，于37°C恒溫水浴10min，加入HHL溶液充分混勻繼續(xù)37 °C保溫60min，乙腈終止反應(yīng)。反應(yīng)液經(jīng)Ci8色譜柱(250 X 4.6mm，5μL?，Tianhe)進(jìn)行分析測定， 色譜條件:柱溫30°C，流速lmL/min，流動相：乙腈:水(0.05 %三氟乙酸）=25:75等度洗脫， 進(jìn)樣體積l〇yL，檢測波長228nm，根據(jù)HA的峰面積計算ACE抑制率，公式如下：
[0036] ACE 抑制率（％) = (b_a)/bX100%
[0037] 式中，a為樣品反應(yīng)液HA的峰面積，b為空白對照液HA的峰面積
[0038] 在終濃度為0 · 02mg/mL下，5個組分F1-F5的ACEI活性分別為68 · 60 ±0 · 21 %，77 · 91 ± 1 · 09%，70 · 50 ± 1 · 12 %，75 · 43 ±0 · 37 %，84 · 75 ±0 · 42 %。組分F5具有較高的體外ACEI活 性（Ρ<0·05)，其 IC5〇=14.6±0.58yg/mL〇
[0039] 組分F5經(jīng)RP-HPLC分離。使用Symmetry PrepTM Ci8C〇lumn(7um，7.8X300mm)柱。色 譜條件為:流速2mL/min，檢測波長220nm;流動相A:超純水(含0.1%〇三氟乙酸，v/v)，流動相 B:乙腈;洗脫條件:0-30min，5%-15%B; 30-55min，15%-30%B。根據(jù)洗脫峰收集各組分，冷 凍干燥。
[0040] RP-HPLC分離獲得9個組分分別標(biāo)記為F5-1至F5-9。在終濃度為0.01mg/mL下，F(xiàn)5-3 具有較高的ACEI活性(60.06%)，F(xiàn)5-9具有較低的ACEI活性(9.61%)。進(jìn)一步測得F5-3的 IC50 = 9 · 80 ± 0 · 02yg/mL。
[0041 ] 組分F5-3通過基于Triple T0F5600的LC-ESI-MS/MS進(jìn)行多肽序列分析， 1&^〇丨2.3.02軟件搜索1]1^仰〖和從^11^數(shù)據(jù)庫鑒定出6條多肽序列，分子量范圍在756.40 和1966.95之間。
[0043]對已鑒定的6個多肽進(jìn)行構(gòu)象分析，采用Best的方法（能量收斂值為20 . Okcal/ mol，最大構(gòu)象數(shù)目為255個)得到多肽的多構(gòu)象，進(jìn)而分別與ACE藥效團(tuán)模型進(jìn)行匹配。ACE 藥效團(tuán)模型的特征主要包括一個氫鍵受體，一個氫鍵給體，一個疏水基團(tuán)，一個負(fù)電離子化 基團(tuán)。
[0044]已鑒定的6個多肽分別與ACE藥效團(tuán)模型進(jìn)行匹配，結(jié)果顯示QSGDQQEF和 VGQLGGAAGGAF與藥效團(tuán)模型完全匹配，適合值(Fitvalue)分別為0.97和0.96。
[0045] 將匹配成功的多肽QSGDQQEF和VGQLGGAAGGAF進(jìn)一步與4BZR、1086、4CA5進(jìn)行對接 篩選。4BZR:配體K-26，-CD0CKER_ENERGY= 156 · 907 ; RMSD(A)=0.69，活性口 袋半徑 8.93A ; 1086 :配體