一種揚麥14成熟胚的胚性愈傷組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于作物遺傳育種和植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體設(shè)及成熟胚體外繼代誘導(dǎo)胚 性愈傷組織的方法。
【背景技術(shù)】
[000^ 1.小麥的育種目標(biāo)
[0003] 小麥(Triticum aestivum)是世界主要糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)關(guān)系到社會 經(jīng)濟(jì)生活。隨著人口增加 W及國家經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，需要更多的糧食滿足人們的生活需求。但是 水±流失導(dǎo)致農(nóng)田不斷減少W及全球氣候變暖使得近幾年的糧食產(chǎn)量增長并不明顯。據(jù)相 關(guān)數(shù)據(jù)分析，分析近幾年的全球小麥單產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)小麥單產(chǎn)不穩(wěn)定，且增幅較小，小麥的增產(chǎn) 已經(jīng)成為人們關(guān)注的問題之一。
[0004] 面對如此大的挑戰(zhàn)，任何可W提高糧食產(chǎn)量的方法都值得去利用。針對糧食作物 品種改良，人們主要采取傳統(tǒng)育種和轉(zhuǎn)基因的方式。兩者的本質(zhì)區(qū)別是:前者通過去雄雜交 促進(jìn)親本基因組的變異，后期W優(yōu)良性狀為指標(biāo)，利用田間試驗，篩選獲得所需優(yōu)良性狀的 小麥品種。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)引起植物基因定向變異并產(chǎn)生優(yōu)良性狀，相比于傳統(tǒng)雜交育種， 轉(zhuǎn)基因技術(shù)可打破生殖隔離，進(jìn)一步擴(kuò)大植物基因變異的范圍。植物組織培養(yǎng)是小麥轉(zhuǎn)基 因技術(shù)的關(guān)鍵，傳統(tǒng)育種在自然條件下進(jìn)行，所W周期長、受氣候環(huán)境影響大。轉(zhuǎn)基因技術(shù) 利用組織培養(yǎng)，整個過程可在培養(yǎng)箱和溫室進(jìn)行，有效避免環(huán)境因素的影響。轉(zhuǎn)基因技術(shù)主 要包括:基因克隆、目的基因功能鑒定、目的基因插入植物基因組并通過生理鑒定獲得品種 改良并具有商業(yè)價值的植株。植物基因組插入外源基因的方法有基因槍法和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 和花粉管通道法等。
[0005] 2.小麥轉(zhuǎn)化方法
[0006] 小麥為異源六倍體植物、基因組大、基因調(diào)控困難，同時小麥外植體所誘導(dǎo)的愈傷 組織普遍存在愈傷胚性差、分化率低、轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生困難等問題，是舉世公認(rèn)的最難轉(zhuǎn)化的 栽培作物?？茖W(xué)家通過各種方法實現(xiàn)對小麥的轉(zhuǎn)化，但目前最主要的小麥轉(zhuǎn)化技術(shù)是基因 槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)。世界第一株轉(zhuǎn)基因小麥?zhǔn)荲asil在1992年通過基因槍法將gus、bar基因 導(dǎo)入小麥品種化VOIU1997年化eng首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GUS和npt Π 轉(zhuǎn)入了小麥。除了 基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，花粉管通道法、顯微注射法、激光微束穿刺法、PEG法和電擊法等也 受到越來越多的關(guān)注。
[0007] 3.小麥愈傷組織誘導(dǎo)：
[000引根據(jù)Christy在1987年對小麥組織培養(yǎng)形成愈傷組織分類，可將其分為3類:胚性 愈傷組織化）、非胚性愈傷組織(肥)和可轉(zhuǎn)化成胚性愈傷組織的光滑緊致愈傷（SC) "E型愈 傷顏色呈白色或淡黃色，有光澤，結(jié)節(jié)狀，一觸易碎成顆粒狀，細(xì)胞球形狀;肥型愈傷易碎， 顏色呈褐色或者灰色;SC型愈傷主要特征是光滑緊致，而且具有很強(qiáng)的增生能力，可轉(zhuǎn)化為 E型愈傷。成熟胚的E型愈傷主要是從SC型愈傷組織轉(zhuǎn)化而來，小麥幼胚的胚性愈傷組織可 直接從胚誘導(dǎo)出E類愈傷。另外小麥的胚相比于其它組織，SC型愈傷比率更高，運也一方面 說明用小麥胚作為外植體的優(yōu)勢。胚狀體可w直接由單個細(xì)胞分化成完整植株、生命力旺 盛，大大縮短成苗周期。
[0009] 4.胚性愈傷組織誘導(dǎo)：
[0010] 胚性愈傷組織即植物體細(xì)胞胚狀體的形成主要通過兩個途徑:染色體上參與染色 質(zhì)模型重建基因突變引起與胚發(fā)育相關(guān)基因的異常的過表達(dá)，已分化的細(xì)胞通過形成感受 態(tài)細(xì)胞形式變成脫分化細(xì)胞，最終形成胚狀體;另一方面，在體外培養(yǎng)條件下，植物細(xì)胞與 周圍組織經(jīng)過切割形成生理隔離，同時培養(yǎng)環(huán)境中的外在生長因子對植物細(xì)胞造成生長壓 力，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)源生長因子的改變，細(xì)胞經(jīng)過植物干細(xì)胞的形式間接實現(xiàn)體細(xì)胞胚狀體生 成。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要是利用第二種方式獲得愈傷組織。
[0011] 從生理角度可W將胚狀體的體外誘導(dǎo)分為四個階段:第一階段，體外植物激素將 植物組織誘導(dǎo)形成愈傷組織；第二階段，經(jīng)過一段時間外源因子作用，愈傷組織形成球形 胚;第Ξ階段，球形胚轉(zhuǎn)化為魚雷形胚;第四階段，魚雷形胚逐漸發(fā)育成熟，最終進(jìn)人發(fā)芽階 段；
[0012] 5.影響胚性愈傷組織誘導(dǎo)因素：
[0013] 5.1基因型不同品種由于基因型不一樣會影響產(chǎn)生胚性愈傷能力，運在小麥、水 稻和玉米等植物的組織培養(yǎng)過程中，均可發(fā)現(xiàn)。明鳳等在2000年對迂10、7742、7757、新克旱 9和Roblin小麥繼代后，統(tǒng)計生成胚性愈傷組織比率，迂10小麥在接種414天后，78%的胚性 愈傷組織生成，而新克旱9愈傷組織已經(jīng)褐化。2005年高武軍等W6種玉米自交系為材料，發(fā) 現(xiàn)基因型對玉米胚性愈傷組織生成啟著顯著影響，GY237的胚性愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到71.3%，而 農(nóng)藝性狀較好的材料卻很難誘導(dǎo)出胚性愈傷。同樣，劉書梅等2011年發(fā)現(xiàn)釉稻品種龍?zhí)仄?較梗稻品種日本晴更容易誘導(dǎo)出結(jié)構(gòu)緊密，顏色鮮黃的胚性愈傷組織。
[0014] 5.2外植體類型許雪梅等2009年W紅皮云杉未成熟胚的不同部位為材料，研究其 對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同部位的外植體對胚性愈傷誘導(dǎo)有很大的影響， 全胚和胚軸上部的誘導(dǎo)率最高分別達(dá)81.27%和75.96%。
[0015] 5.3培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基不僅為植物細(xì)胞體外培養(yǎng)提供營養(yǎng)物質(zhì)，也為細(xì)胞的脫分 化、再分化提供外源誘導(dǎo)因子和壓力。植物脫分化時期主要受生長素和細(xì)胞分裂素的作用， 所W對于胚性愈傷組織的生成，激素的調(diào)節(jié)是關(guān)鍵之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明的目的是提供一種揚麥14成熟胚的胚性愈傷組織培養(yǎng)方法。
[0017] 本發(fā)明所述的方法，是在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+500mg/L酪蛋白水解物+2mg/L 2,4-D+ 30g/L薦糖+2.6g/L植物凝膠，P冊.8)，25 ± rC，暗培養(yǎng)，10天為繼代周期的條件下，繼代1-3 次可獲得具有較高再生率的胚性愈傷組織。
[0018] 通過對0到15天的愈傷組織進(jìn)行稱重，并繪制揚麥14愈傷組織相關(guān)的生長曲線圖， 確定愈傷組織在培養(yǎng)到10天，適合更換培養(yǎng)基。W同樣的誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼代1至3次，愈傷組織 的質(zhì)量不斷提高，并且出現(xiàn)再生能力強(qiáng)的胚性愈傷組織。繼代超過3次后，愈傷組織的再生 能力明顯受到抑制。本發(fā)明的目的是提供一種有利于小麥成熟胚長期繼代培養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng) 基。
[0019] 小麥成熟胚長期繼代獲