得的胚性愈傷組織，具有較高的再生能力，是遺傳轉(zhuǎn)化的 好材料。為了在不影響愈傷的再生能力的情況下，進(jìn)一步獲得更多胚性愈傷組織并延長(zhǎng)胚 性愈傷組織的保存時(shí)間，本發(fā)明通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出最有利于小麥成熟胚長(zhǎng)期繼代培 養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。脯氨酸、水解酪蛋白W及2,4-D為影響因素，分別設(shè)置3個(gè)濃度，共配 置9種不同組合的培養(yǎng)基，切取同樣大小的揚(yáng)麥14成熟胚并分別置于9種培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。繼代5次后，每種培養(yǎng)基的所有愈傷組織均分別轉(zhuǎn)移同樣的分化培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)愈傷的 綠點(diǎn)率W及出苗情況。最終W綠點(diǎn)率為標(biāo)準(zhǔn)，分析各個(gè)因素的貢獻(xiàn)率，W及各因素最佳組 厶 1=1 〇
[0020] 本發(fā)明通過(guò)正交試驗(yàn)確定的最優(yōu)培養(yǎng)基，是MS+k脯氨酸700mg/L+酪蛋白水解物 lOOOmg/L+2，4-D 2mg/L+30g/L薦糖+2.6g/L植物凝膠，P冊(cè).8。該培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織在 長(zhǎng)期繼代的情況下，愈傷組織仍保持淡黃的顏色，而且愈傷組織增長(zhǎng)較快;長(zhǎng)期繼代后，其 它培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織再生能力受到抑制，均未出苗，而最優(yōu)培養(yǎng)基的愈傷組織再生率 最高達(dá)到6.7%。
[0021] 利用本發(fā)明的方法對(duì)揚(yáng)麥14成熟胚誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)繼代1-3次胚性愈傷 組織生成率和再生率均保持上升趨勢(shì);繼代次數(shù)超過(guò)5次則抑制揚(yáng)麥14成熟胚胚性愈傷組 織的再生能力。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1小麥成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖。注:橫坐標(biāo)是愈傷組織培養(yǎng)的時(shí)間，ii 試點(diǎn)分別選取0、3、6、9、12、15天?？v坐標(biāo)是單個(gè)愈傷組織平均重量
[0023] 圖2小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)（0至15天)體式顯微鏡照?qǐng)D。注：圖中分別是愈傷組 織在0、3、6、9、12、15天的形態(tài)，圖片是由體視顯微鏡拍攝。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例：
[00劇一.實(shí)驗(yàn)材料
[00%]供試品種:保存一年揚(yáng)麥14的種子(購(gòu)買(mǎi)于江蘇金±地種業(yè)有限公司）
[0027]培養(yǎng)基:愈傷組織誘導(dǎo)組成為MS基本培養(yǎng)基(具體成分見(jiàn)表l)、30g/L薦糖、2.6g/L 植物凝膠，2mg/L 2，4-D、500mg酪蛋白水解物(表2)。分化培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基、30g/L薦 糖、2.6g/L植物凝膠、0.5mg/L激動(dòng)素、2mg/L玉米素組成。所有培養(yǎng)基PH均為5.8。
[002引表1.
[0029]
[0030]
[00川二.實(shí)驗(yàn)方法
[0032] 1.制作成熟胚愈傷組織生長(zhǎng)曲線(xiàn)確定繼代周期
[0033] 取實(shí)驗(yàn)室上一年保存的揚(yáng)麥14的種子，挑選巧粒飽滿(mǎn)的小麥種子，置于滅完菌干 凈的Ξ角瓶。經(jīng)75%酒精滅菌5min后，用0.1 %升隸浸泡30min，最后用滅菌水沖洗3~5遍。 超凈工作臺(tái)上用解剖刀撥取直徑直徑1mm大小的幼胚，盾片朝上接種至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上 (MS基本培養(yǎng)基，添加500mg/L酪蛋白水解物W及2mg/L 2，4-D)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基每皿接種30個(gè)。 (25±irC暗培養(yǎng)，分別在0至15天內(nèi)，每隔3天取出30個(gè)愈傷組織置于干凈的吸水紙上，去 除多余愈傷組織表面沾有的培養(yǎng)基，并稱(chēng)取總重求得平均單個(gè)愈傷組織重量。每次處理共 重復(fù)3次取平均值，作生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖并拍照。
[0034] 2.確定繼代次數(shù)
[0035] 揚(yáng)麥14成熟胚材料處理按照2.1進(jìn)行，每皿放置30個(gè)。按照1步驟中確定的繼代周 期范圍，愈傷組織分別在繼代1至5次后，轉(zhuǎn)移置分化培養(yǎng)基，每個(gè)Ξ角瓶接種15個(gè)愈傷組 織，每個(gè)處理重復(fù)4次，共60個(gè)愈傷組織，25±rC光照培養(yǎng)一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)出苗率。
[0036] s.結(jié)果與分析
[0037] 數(shù)據(jù)處理公式：
[0040] 3.1揚(yáng)麥14成熟胚愈傷組織生長(zhǎng)曲線(xiàn)W及確定最佳繼代周期
[0041] 從圖1中可W看到0-9天，愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，9天W后逐步趨于平緩，此時(shí)生長(zhǎng)緩 慢可能受到培養(yǎng)基激素或者營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏影響;0-15內(nèi)的愈傷組織整體顏色呈現(xiàn)白色偏黃 且結(jié)構(gòu)緊致，如圖2所示，所W選擇9至15天更換培養(yǎng)基比較合適。（揚(yáng)麥14成熟胚愈傷生長(zhǎng) 圖見(jiàn)圖2)
[0042] 1.2確定繼代次數(shù)對(duì)小麥成熟胚誘導(dǎo)影響
[0043] 表2小麥愈傷組織繼代后出苗統(tǒng)計(jì)表(n = 60)
[0044]
[0046]從表2中可W得到：隨著繼代次數(shù)的上升，胚性愈傷組織的比率不斷上升。在一定 范圍內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基誘導(dǎo)的小麥成熟胚胚性愈傷組織隨著繼代次數(shù)的增加，出苗率不斷 上升；當(dāng)繼代次數(shù)達(dá)到4次W上，胚性愈傷組織的出苗率下降；繼代5次時(shí)，出苗率為0%。繼 代實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明：揚(yáng)麥14在本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)可W促進(jìn)胚性愈傷組織的生 成;但是繼代4次W上后，胚性愈傷組織的再生率明顯被抑制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種揚(yáng)麥14成熟胚的胚性愈傷組織培養(yǎng)方法，其特征在于：以揚(yáng)麥14成熟胚為材料， 在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25±1°C，暗培養(yǎng)，10天為繼代周期的條件下，繼代1-3次獲得具有較高再 生率的胚性愈傷組織;所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為:MS+500mg/L酪蛋白水解物+2mg/L 2，4-D+ 30g/L蔗糖+2 · 6g/L植物凝膠;培養(yǎng)基PH5 · 8。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種揚(yáng)麥14成熟胚的胚性愈傷組織培養(yǎng)方法，該方法以揚(yáng)麥14成熟胚為材料，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25±1℃，暗培養(yǎng)，10天為繼代周期的條件下，繼代1-3次獲得具有較高再生率的胚性愈傷組織。本發(fā)明以揚(yáng)麥14成熟胚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+500mg/L酪蛋白水解物+2mg/L？2，4-D+30g/L蔗糖+2.6g/L植物凝膠，PH5.8)為培養(yǎng)條件，25±1℃，10天為繼代周期，對(duì)揚(yáng)麥14成熟胚誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)繼代1-3次胚性愈傷組織生成率和再生率均保持上升趨勢(shì)；繼代次數(shù)超過(guò)5次則抑制揚(yáng)麥14成熟胚胚性愈傷組織的再生能力。
【IPC分類(lèi)】A01H4/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105594598
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610188353
【發(fā)明人】陳建民, 劉慧君, 高勇, 劉霜, 居鵬, 王雨竹, 張冬平
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年5月25日
【申請(qǐng)日】2016年3月29日