黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分的提取方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物化學及生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分的提取方法，以及該抗腫瘤活性成分在制備抗肝癌藥物和抗肺癌藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]黃綠蜜環(huán)菌(Armillarialuteo-rivens)，又名黃蘑燕、金蘑燕、黃環(huán)菌，隸屬于擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、蜜環(huán)菌屬。黃綠蜜環(huán)菌子實體中等大，菌蓋扁半球形至平展，直徑5-12cm，菌蓋邊緣內卷，表皮開裂形成近環(huán)狀排列的纖毛狀后磷片。菌褶近似菌蓋色，稍密，彎生，不等長。菌柄柱形，莖部膨大，長2-lOcm，直徑2-2.5cm，白色或或帶黃色，內實。菌環(huán)中位，單層，菌環(huán)以上為白色，菌環(huán)以下為黃色鱗片。在顯微鏡下觀察，擔孢子橢圓形，無色至微黃色，淀粉質，擔孢子棒狀，無色，具4個孢子，菌絲具明顯鎖狀聯(lián)合。菌絲分布在土壤5-lOcm。該菌夏秋季生于針葉林地或草地上，尤其喜生于高山草地上，菌絲可與主要植被為嵩草和高山雜類草等形成菌根。在牧草生長季節(jié)，由黃綠蜜環(huán)菌菌絲頂端生長，在草地上形成或大或小的圓圈、半圓或條帶狀的蘑菇圈。圈的寬度大約為50cm，圈的直徑大約6cm左右(周連玉.黃綠蜜環(huán)菌的研究概述.安徽農(nóng)學通報[J].2010，16(3):52-54)。
[0003]國內對黃綠蜜環(huán)菌營養(yǎng)成分進行了初步分析，富含氨基酸、蛋白質、多糖多肽等營養(yǎng)和藥用成分，具有較高的保健和藥用價值。但目前的蜜環(huán)菌制劑主要以初提混合物為原料，如郭順星等在“蜜環(huán)菌的化學成分及應用研究”(微生物學通報[J].1996, 23(4):239-240)中提出:蜜環(huán)菌糖漿以蜜環(huán)菌培養(yǎng)液(菌絲連同發(fā)酵液)為主要原料，煮沸濃縮制成，主治眩暈頭痛，神經(jīng)衰弱，失眠，美尼爾綜合癥；蜜環(huán)菌浸膏以菌絲體為原料，煮沸、過濾，殘渣醇析，醇析物與濾液合并濃縮制成，用于治療血管性頭痛、神經(jīng)衰弱、冠心病、腦動脈血管硬化等?。幻郗h(huán)菌片以菌絲體烤干后磨成細粉壓片而成，對高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、降低血壓有一定效果。由于蜜環(huán)菌制劑成分一般為混合物，缺乏必要的藥效物質基礎和藥效研究，所以其缺乏合理的質量控制標準，難以確保臨床用藥的有效性、安全性、可持續(xù)性?？梢姡瑢S綠蜜環(huán)菌的化學成分進行進一步提取和研究非常有必要。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術問題是針對上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種黃綠蜜環(huán)菌中生物活性成分的提取方法，該方法采用二維高效液相色譜進行分離純化，得到純度達98%以上的單體化合物，且該單體化合物被證明具有抗肺癌和抗肝癌活性，具有相關藥物制劑開發(fā)潛力。
[0005]本發(fā)明所采用的技術方案為:
[0006]—種黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分的提取方法，該方法包括以下步驟:
[0007](I)以黃綠蜜環(huán)菌子實體為原料，經(jīng)干燥并磨成粉末狀后，用乙酸乙酯以液固比(5-10)mL: Ig進行浸泡，然后過濾取上清，得到乙酸乙酯提取液，并濃縮至膏狀；
[0008](2)使用乙醇體積分數(shù)為10-35%的正己烷-乙醇二元混合溶劑溶解步驟(I)得到的膏狀乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上樣溶液；
[0009](3)對上樣溶液進行一維液相色譜分離:采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱，采用的流動相為二元混合有機相，其中A相為正己烷，B相為乙醇，進樣量為50-150mL/針，流動相流速為550-600mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長210_260nm ;采用的洗脫方式為B相濃度由0% (即按體積百分比B相0%、A相100%混合而成的液體，下同理)至75%進行梯度洗脫45-75min，根據(jù)紫外吸收光譜收集27-32分鐘洗脫液作為目的組分，減壓濃縮至膏狀，得到一維液相組分；
[0010](4)用乙醇體積分數(shù)為2-15 %的乙醇-正己烷二元混合溶劑溶解一維液相組分，溶解至濃度為50-100mg/mL ；
[0011](5)進行二維液相色譜分離:采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱，采用的流動相為二元混合有機相，其中A相為正己烷，B相為乙醇，進樣量為500-2000 μ L/針，流動相流速為10-30mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長210_260nm，采用的洗脫方式為B相濃度3%進行等度洗脫25-35min，根據(jù)紫外吸收光譜收集10-14分鐘洗脫液作為目的組分，旋轉蒸發(fā)濃縮至干，得到目的成分。
[0012]所述步驟(3)中的Silica正相娃膠色譜柱的尺寸為直徑150mm、柱長250mm，其中硅球粒徑為10-50 μ m，使用時柱溫為室溫或25-40 °C。
[0013]所述步驟(5)中的Silica正相娃膠色譜柱的尺寸為直徑20mm、柱長250mm，其中硅球粒徑為10-50 μ m，使用時柱溫為室溫或25-40 °C。
[0014]本發(fā)明還進一步提供上述提取得到的黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分在制備抗肺癌藥物中的應用。該黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注射，與藥學上的可接受載體或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如:片劑、膠囊、注射劑等。
[0015]本發(fā)明進一步提供上述提取得到的黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分在制備抗肝癌藥物中的應用。該黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注射，與藥學上的可接受載體或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如:片劑、膠囊、注射劑等。
[0016]本發(fā)明采用二維液相色譜技術進行從黃綠蜜環(huán)菌中分離純化抗腫瘤活性成分:
[0017]首先:選用乙酸乙酯進行粗提，根據(jù)相似相溶原則該溶劑可以盡可能多地提取與其極性相近的小極性物質，且乙酸乙酯為脂溶性溶劑，與其相似相溶的目的組分也應該具備進入生物活性細胞所必需的脂溶性特性，從而具有更高的進入細胞參與細胞內作用的可能性；
[0018]其次，在一維分離的條件選擇上:多次試驗結果顯示，Silica正相硅膠色譜柱對所提物質分離效果較好，而通過考察不同流動相組成和不同洗脫方式、流速及進樣量后，結果顯示采用本發(fā)明乙醇-正己烷0% -75%梯度洗脫分離效果最佳，且進樣量在50-150mL/針范圍內、流動相在550-600mL/min范圍內時重復性良好，得到的一維液相組分中目的化合物純度高達91.0%，近乎單體化合物的純度，且目的峰清晰、峰容量較大、無拖尾吸收等現(xiàn)象，與其他峰之間分離非常好，無交叉或重疊等現(xiàn)象，非常有利于分離操作和后續(xù)進一步提純；
[0019]再次，在二維分離的條件選擇上:由于一維得到的組分中目的化合物含量已相當高，再使用Si I ica正相硅膠色譜柱，在洗脫條件選擇為B相濃度3 %等度洗脫時能將少部分極性接近的雜質分離開，得到純度達98%以上的單體化合物。
[0020]在液相色譜的溶劑選擇上，一維色譜分離、二維色譜分離以及中間提取物的溶解，均采用正己烷、乙醇兩種溶劑混合液，可以通過改變乙醇的比例來調節(jié)有效成分的溶解能力和流動相的洗脫能力，且整個色譜分離僅使用兩種溶劑，有利于提取溶劑的回收再利用。
[0021]與現(xiàn)有技術中相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和顯著效果:
[0022](I)提取方法工藝簡單，成本低，試劑耗費量小，制備量大，穩(wěn)定可控，重復性好，批次間一致性高，經(jīng)工藝放大后可以運用于工業(yè)生產(chǎn)；
[0023](2)得到的單體化合物純度高，穩(wěn)定性好，且具備良好的生物活性，通過細胞在線實時監(jiān)測的方法觀測其在體外的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)其對肺癌A549細胞和肝癌Hep-G2細胞具有良好的抑制作用，具有抗腫瘤藥物開發(fā)潛力，該單體化合物拓寬了抗腫瘤藥物的原料來源；
[0024](3)由于產(chǎn)物為高純度的單體化合物，質量品質和用藥更為可控，能夠確保臨床用藥的有效性、安全性、可持續(xù)性。
【附圖說明】
[0025]圖1所示的是本發(fā)明實施例1黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分提取的一維色譜圖；
[0026]圖2所示的是本發(fā)明實施例1黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分提取的二維色譜圖；
[0027]圖3所示的是本發(fā)明實施例2黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分提取的一維色譜圖；
[0028]圖4所示的是本發(fā)明實施例2黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分提取的二維色譜圖；
[0029]圖5所示的是本發(fā)明實施例3黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分提取的一維色譜圖；
[0030]圖6所示的是本發(fā)明實施例3黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分提取的二維色譜圖；
[0031]圖7所示的是本發(fā)明實施例4中目的成分對肺癌A549細胞的抑制作用；
[0032]圖8所示的是本發(fā)明實施例5中目的成分對肝癌!fep-G2細胞的抑制作用。<