br>【具體實施方式】
[0033]以下結合實施例對本發(fā)明作進一步具體描述。應該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發(fā)明提供進一步的說明。除非另有說明，本發(fā)明使用的所有科學和技術術語具有與本發(fā)明所屬技術領域人員通常理解的相同含義。
[0034]1.原料、材料:
[0035]黃綠蜜環(huán)菌子實體采摘自青海祁連并經(jīng)過鑒定；人肺癌A549細胞由中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院提供；人肝腫瘤Hep-G2細胞由中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院提供。
[0036]2.試劑:
[0037]無水乙醇購自天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；色譜級乙酸乙酯、正己烷購自Honeywell 公司；F_12K培養(yǎng)基購自 Life Technologies Corporat1n ;MEM培養(yǎng)基購自 LifeTechnologies Corporat1n ;DMS0購自天津康科德科技有限公司。
[0038]3.儀器設備:
[0039]超微粉碎機購自山東三清不銹鋼設備有限公司；臺式冷凍離心機購自Thermo公司；30升中藥提取罐購自上海順儀實驗設備有限公司；恒溫鼓風干燥箱購自上海一恒科學儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)儀上海亞容生化儀器廠；silica正相硅膠色譜柱購自博納艾吉爾有限公司；制備型高效液相色譜儀購自江蘇漢邦科技有限公司；iCELLigenCe實時無標記細胞功能分析儀購自艾森生物(杭州)有限公司。
[0040]實施例1:
[0041]本實施例黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分的提取，包括以下步驟:
[0042](I)以黃綠蜜環(huán)菌子實體為原料，室溫陰干處理后，在70°C烘干脫水，然后在_20°C超微粉碎Imin，即得黃綠蜜環(huán)菌超微粉。
[0043](2)取上述黃綠蜜環(huán)菌超微粉3kg，經(jīng)過三次乙酸乙酯浸泡，第一次浸泡:3kg黃綠蜜環(huán)菌超微粉加入15L乙酸乙酯，25°C浸泡48h，浸泡結束后，20°C、4，OOOrpm離心30min，分別收集上清液和殘渣，上清液通過旋轉蒸發(fā)濃縮后轉移至60°C恒溫鼓風干燥箱中干燥至恒重。第二次乙酸乙酯浸泡:第一次的殘渣加入15L乙酸乙酯，25°C浸泡36h。(浸泡結束，按第一次浸泡方法進行處理，其中水體乙酸乙酯上清可與第一次提取上清混合，烘干至恒重)。第三次浸泡:第二次浸泡殘渣加入15L乙酸乙酯，25°C浸泡24h，浸泡結束，按第一次浸泡處理方法進行處理，將三次浸泡上清合并，旋蒸濃縮后烘干至恒重。
[0044](3)將干燥至恒重的乙酸乙酯上清用乙醇體積分數(shù)為25%的正己烷-乙醇二元混合溶劑溶解配制成lOOmg/mL的溶液，溶解后過0.45 μ m的有機濾膜，得到黃綠蜜環(huán)菌子實體小分子提取物的一維上樣溶液。
[0045](4)對一維上樣溶液進行一維液相色譜分離:采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱(150mmX 250mm，娃膠粒徑10 μ m)，采用的流動相為二元混合有機相，其中A相為正己燒，B相為乙醇，進樣量為10mL/針，流動相流速為580mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長21nm ；乙醇活化色譜柱3?10倍柱體積，正己烷平衡3倍柱體積，一維上樣溶液上樣，采用B相濃度由0%至75%進行梯度洗脫50min。得到的一維液相色譜圖如圖1所示，得到如圖10個主要粗組分，收集28.5-32min洗脫液(圖中8號峰)作為目的組分，減壓濃縮至膏狀，得到一維液相組分，稱重為6.11克。
[0046](5)用乙醇體積分數(shù)為15 %的乙醇-正己烷二元混合溶劑溶解一維液相組分，溶解至濃度為100mg/mL，溶解后過0.45 μ m的有機濾膜，得到二維上樣溶液。
[0047](6)對二維上樣溶液進行二維液相色譜分離:采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱(20mmX 250mm，娃膠粒徑10 μ m)，采用的流動相為二元混合有機相，其中A相為正己烷，B相為乙醇，進樣量為1000 μ L/針，流動相流速為20mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長210nm，采用的洗脫方式為等度洗脫方式:B相濃度3%進行等度洗脫35min洗脫。得到的二維液相色譜圖如圖2所示，只有一個主峰為目的峰，其他的雜質(zhì)峰峰容量都很小，證明一維分離質(zhì)量很高，收集ll_13min洗脫液(圖中唯一主峰)作為目的組分，旋轉蒸發(fā)濃縮至干，稱重為0.11克，即為本發(fā)明目的組分，對其進行HPLC純度分析，達98%以上。
[0048]實施例2:
[0049]本實施例黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分的提取，包括以下步驟:
[0050](I)以黃綠蜜環(huán)菌子實體為原料，室溫陰干處理后，在70°C烘干脫水，然后在_20°C超微粉碎Imin，即得黃綠蜜環(huán)菌超微粉。
[0051](2)取上述黃綠蜜環(huán)菌超微粉3kg，經(jīng)過三次乙酸乙酯浸泡，第一次浸泡:3kg黃綠蜜環(huán)菌超微粉加入21L乙酸乙酯，25°C浸泡48h，浸泡結束后，20°C、4，OOOrpm離心30min，分別收集上清液和殘渣，上清液通過旋轉蒸發(fā)濃縮后轉移至60°C恒溫鼓風干燥箱中干燥至恒重。第二次乙酸乙酯浸泡:第一次的殘渣加入21L乙酸乙酯，25°C浸泡36h。(浸泡結束，按第一次浸泡方法進行處理，其中水體乙酸乙酯上清可與第一次提取上清混合，烘干至恒重)。第三次浸泡:第二次浸泡殘渣加入21L乙酸乙酯，25°C浸泡24h，浸泡結束，按第一次浸泡處理方法進行處理，將三次浸泡上清合并，旋蒸濃縮后烘干至恒重。
[0052](3)將干燥至恒重的乙酸乙酯上清用乙醇體積分數(shù)為18%的正己烷-乙醇二元混合溶劑溶解配制成85mg/mL的溶液，溶解后過0.45 μ m的有機濾膜，得到黃綠蜜環(huán)菌子實體小分子提取物的一維上樣溶液。
[0053](4)對一維上樣溶液進行一維液相色譜分離:采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱(150mmX 250mm，娃膠粒徑10 μ m)，采用的流動相為二元混合有機相，其中A相為正己燒，B相為乙醇，進樣量為120mL/針，流動相流速為580mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長21nm ；乙醇活化色譜柱3?10倍柱體積，正己烷平衡3倍柱體積，一維上樣溶液上樣，采用B相濃度由0%至75%進行梯度洗脫45min。得到的一維液相色譜圖如圖3所示，得到如圖10個主要粗組分，收集27.5-30min洗脫液(圖中8號峰)作為目的組分，減壓濃縮至膏狀，得到一維液相組分，稱重為6.27克。
[0054](5)用乙醇體積分數(shù)為10 %的乙醇-正己烷二元混合溶劑溶解一維液相組分，溶解至濃度為74mg/mL，溶解后過0.45 μ m的有機濾膜，得到二維上樣溶液。
[0055](6)對二維上樣溶液進行二維液相色譜分離:采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱(20mmX 250mm，娃膠粒徑10 μ m)，采用的流動相為二元混合有機相，其中A相為正己烷，B相為乙醇，進樣量為800 μ L/針，流動相流速為16mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長210nm，采用的洗脫方式為等度洗脫方式:B相濃度3%進行等度洗脫20min。得到的二維液相色譜圖如圖4所示，只有一個主峰為目的峰，其他的雜質(zhì)峰峰容量都很小，證明一維分離質(zhì)量很高，收集10_12min洗脫液(圖中唯一主峰)作為目的組分，旋轉蒸發(fā)濃縮至干，稱重為0.106克，即為本發(fā)明目的組分，對其進行HPLC純度分析，達98%以上。
[0056]實施例3:
[0057]本實施例黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性成分的提取，包括以下步驟:
[0058](I)以黃綠蜜環(huán)菌子實體為原料，室溫陰干處理后，在70°C烘干脫水，然后在_20°C超微粉碎Imin，即得黃綠蜜環(huán)菌超微粉。
[0059](2)取上述黃綠蜜環(huán)菌超微粉3kg，經(jīng)過三次乙酸乙酯浸泡，第一次浸泡:3.5kg黃綠蜜環(huán)菌超微粉加入28L乙酸乙酯，250C浸泡48h，浸泡結束后，20°C、4，OOOrpm離心30min，分別收集上清液和殘渣，上清液通過旋轉蒸發(fā)濃縮后轉移至60°C恒溫鼓風干燥箱中干燥至恒重。第二次乙酸乙酯浸泡:第一次的殘渣加入28L乙酸乙酯，25°C浸泡36h。(浸泡結束，按第一次浸泡方法進行處理，其中水體乙酸乙酯上清可與第一次提取上清混合，烘干至恒重)。第三次浸泡:第二次浸泡殘渣加入28L乙酸乙酯，25°C浸泡24h，浸泡結束，按第一次浸泡處理方法進行處理，將三次浸泡上清合并，旋蒸濃縮后烘干至恒重。
[0060](3)將干燥至恒重的乙酸乙酯上清用乙醇體積分數(shù)為28%的正己烷-乙醇二元混合溶劑溶解配制成109mg/mL的溶液，溶解后過0.45 μ m的有機濾膜，得到黃綠蜜環(huán)菌子實體小分子提取物的一維上樣溶液。
[0061](4)對一維上樣溶液進行一維液相色譜分離:采用的色譜柱