人工誘導鐵皮石斛在組培瓶內開花的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種人工誘導鐵皮石斛在組培瓶內開花的方法。
【背景技術】
[0002]鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)又稱黑節(jié)草，為蘭科植物石斛屬多年生草本植物。鐵皮石斛是石斛中的極品，是著名的觀賞兼藥用蘭花，鐵皮石斛花朵也是市場上奇貨可居的具有保健作用的名貴花茶原材料。然而在自然環(huán)境下，由于其對生境條件要求苛刻，鐵皮石斛難開花、開花周期長、花量少，成為鐵皮石斛花茶和花卉產(chǎn)業(yè)開發(fā)的瓶頸難題。因此，人工誘導鐵皮石斛植株峰量開花對鐵皮石斛花茶和花卉產(chǎn)業(yè)有著重要的商業(yè)價值，同時對研究鐵皮石斛開花機理也有重要的意義。而現(xiàn)有的應用生物技術對誘導鐵皮石斛開花的技術體系，雖可獲得一定的開花誘導率，但有毒物質殘留、成本高等問題大大限制了其市場推廣價值。
[0003]如中國專利CN102577963B公開的一種誘導鐵皮石斛開花的方法，包括以下步驟:采用鐵皮石斛莖段離體培養(yǎng)的原球莖為試驗材料，進行壯苗培養(yǎng)50?80d，再經(jīng)過誘導開花階段I一誘導開花階段II一誘導開花階段I的交替培養(yǎng)誘導后，進入開花培養(yǎng)階段。在誘導開花階段I中，培養(yǎng)基I為:1/2MS基本培養(yǎng)基+PP3330.50-1.50mg/L+ABA0.5-1.0mg/L，使用了 PP333作為植物生長調節(jié)劑。又如中國專利CN103210842B公開的一種鐵皮石斛試管開花及結實的方法，采用鐵皮石斛莖段或鐵皮石斛蒴果(鐵皮石斛蒴果為合生心皮的復雌蕊發(fā)育成的果實，子房I室或多室，每室有多粒鐵皮石斛種子)作為外植體進行誘導培養(yǎng)，再經(jīng)原球莖增殖培養(yǎng)、原球莖生根培養(yǎng)、生根苗誘導開花培養(yǎng)及授粉過程及結實培養(yǎng)后，形成試管花及試管果實。在生根苗誘導開花培養(yǎng)時，將生根苗接種于下列誘導開花培養(yǎng)基中:MS+白糖30?60g/L+瓊脂粉5.5?I lg/L+土豆30?50g/L+BA0.2-0.6mg/L+NAA0.1-0.9mg/L+PPP3330.3-0.8mg/L+Spml.0-6.0mmol/L+ZTl.5?6mg/L，其中也使用到了PP333JP333又叫多效唑，是一種植物生長調節(jié)劑，具有延緩植物生長，抑制莖桿伸長，縮短節(jié)間、促進植物分蘗、增加植物抗逆性能，提高產(chǎn)量等效果。但多效唑在植物中代謝慢，易產(chǎn)生殘留超標的問題，且它對人體和環(huán)境的危害，目前已經(jīng)被證實。因而食用多效唑誘導的花茶，易讓人們產(chǎn)生安全性的焦慮。
[0004]有鑒于此，現(xiàn)有技術需要提供一種新的人工誘導鐵皮石斛在開花的方法，使鐵皮石斛的開花率提高，但又不產(chǎn)生藥物殘留的問題。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明意在提供一種鐵皮石斛在組培瓶內開花的方法，以解決現(xiàn)有技術的鐵皮石斛開花率低、有害化合物殘留的問題。
[0006]本發(fā)明中一種人工誘導鐵皮石斛在組培瓶內開花的方法，包括以下步驟:
步驟I):外植體的滅菌消毒:用無菌水將鐵皮石斛蒴果表面的臟物沖洗干凈，將鐵皮石斛蒴果置于75%乙醇中浸15s，再放入0.1%的升萊溶液中浸15min后，用無菌水沖洗4?5次，每次沖洗5min，備用；
步驟2):無菌萌發(fā)及幼苗生長:用無菌濾紙擦干蒴果表面水后，切開蒴果，將種子取出接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中，萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2MS固體培養(yǎng)基添加0.2?1.0mg/L萘乙酸、6.5?8.5g/L瓊脂、15?30g/L蔗糖;接種后搖動，使種子均勻散布于培養(yǎng)基中，封口，將接種后的組培瓶移入培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度22?28 °C，光強1200?20001x、相對濕度65?80%、每天光照11?16h，5?8d后種子開始萌發(fā)，30?45d后長成2?3cm的幼苗；
步驟3):生根壯苗培養(yǎng):將步驟2)中的幼苗轉接至生根壯苗培養(yǎng)基中；壯苗培養(yǎng)基為I/2MS固體培養(yǎng)基添加3.5?4.5mg/L萘乙酸、O?10% 土豆、6.5?8.5g/L瓊脂、15?30g/L鹿糖；在溫度22?28°C，光強1200?20001x、相對濕度65?80%、光照14?16h/d，60?80d后長成成苗；
步驟4):誘導開花:將步驟3)中的成苗轉接至開花培養(yǎng)基中，開花培養(yǎng)基為1/2MS固體培養(yǎng)基添加0.8?2.0mg/L萘乙酸、5?10%椰汁、O?10%土豆、O?10%香蕉、6.5?8.5g/L瓊月旨、15?30g//L蔗糖；在溫度25?30°C，光強1500?25001x、相對濕度65?80%、光照14?16h/d ；誘導35?50d后得到開花苗；
步驟5):采花、繼代培養(yǎng):把步驟4)中的開花苗取出，夾住花托，將花柄剪下，剩余的植株部分重新接入新的開花培養(yǎng)基中進行繼續(xù)培養(yǎng)，誘導分蘗開花;同樣在溫度25?30°C，光強1500?25001x、相對濕度65?80%、光照14?16h/d。
[0007]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明誘導鐵皮石斛開花率高，能緩解當前社會對鐵皮石斛花茶、鐵皮石斛花卉或者鮮花和帶花植株的迫切需求，并提供了一種新的安全無害的技術方法，本發(fā)明在營養(yǎng)條件、溫度、光照和水汽等可控環(huán)境下培養(yǎng)出無毒、無害的鮮花，不使用對人體或環(huán)境有害的化學成分，并在人工條件下，125?175d可采收鐵皮石斛花，與在自然條件下生長相比周期更短、產(chǎn)量更高、更經(jīng)濟、更能滿足人們的迫切需求，對緩解鐵皮石斛花的市場供需矛盾有積極意義。
[0008]作為優(yōu)選的，所述步驟1)、步驟2)、步驟3)、步驟4)和步驟5)均在超凈工作臺上進行。鐵皮石斛在生長周期內，對環(huán)境的敏感度較高，易被外部環(huán)境所感染，出現(xiàn)不可控的因素，進而使誘導成功率降低，因此必須在超凈工作臺上進行。
[0009]作為優(yōu)選的，所述鐵皮石斛蒴果為成熟未開裂前采收的鐵皮石斛蒴果。優(yōu)點在于:
(I)有利于鐵皮石斛蒴果的密封保存及運輸，(2)減少鐵皮石斛種子受污染的幾率，(3)在進行鐵皮石斛蒴果消毒滅菌時防止石斛種子接觸酒精、升汞等對種子有毒性的液體，提高種子的發(fā)芽率。
[0010]作為優(yōu)選的，作為本發(fā)明的一個應用，將步驟5)中已開花的植株煉苗后移栽，制作成觀賞性花卉或盆景。
【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明人工誘導鐵皮石斛在組培瓶內的開花情況示意圖；
圖2為本發(fā)明誘導出的正在開花的植株形態(tài)圖。
【具體實施方式】
[0012]下面通過【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明:
實施例1:人工誘導鐵皮石斛在組培瓶內開花的方法，按照以下步驟進行:
步驟I):外植體的滅菌消毒:a、選擇外植體:本實施例是從鐵皮石斛種植基地購買的成熟未裂開的蒴果，選用其中顆粒飽滿，表面無受損、未裂開的蒴果的種子為外植體；
b、外植體的滅菌消毒:在消毒后的超凈工作臺上進行，用無菌水將鐵皮石斛蒴果表面的臟物沖洗干凈，將鐵皮石斛蒴果置于75%乙醇中浸15s，再用0.1%的升汞溶液中浸15min后，用無菌水沖洗4?5次，每次沖洗5min，備用。
[0013]步驟2):無菌萌發(fā)及幼苗生長:用無菌濾紙擦干蒴果表面水后，在無菌環(huán)境下，用解剖刀切開蒴果，用鑷子將種子取出接種于已分裝好的萌發(fā)培養(yǎng)基中，接種后稍加搖動，使種子均勻散布于培養(yǎng)基中，封口，將接種后的組培瓶移入培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度22?28°C，光強1200?20001x、相對濕度65?80%、每天光照11?16h，5?8天后種子開始萌發(fā)，45天后長成2?3cm的幼苗。
[0014]步驟3):無菌苗生根壯苗培養(yǎng):在消毒后的超凈工作臺上進行，將幼苗繼代至壯苗培養(yǎng)基中；壯苗培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基添加3.5?4.5mg/L萘乙酸、8?10% 土豆、15?30g/L蔗糖、6.5?8.5g/L瓊脂;培養(yǎng)條件:溫度22°C?28°C，光強1200?20001x、相對濕度65?80%、每天光照14?16h，60?80d后長成成苗。
[0015]步驟4):誘導開花:將步驟3)中的成苗轉