核桃與核桃楸種間雜交幼胚培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物幼胚培養(yǎng)技術(shù)，具體為一種核桃與核桃楸種間雜交幼胚培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]核桃(Juglans regia L)為胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬，作為一種經(jīng)濟作物，是近年來我國退耕還林的重要樹種，也是我國許多地區(qū)發(fā)展農(nóng)業(yè)經(jīng)濟，進行精準扶貧的主要干果樹種。我國在核桃育種研究中取得了顯著的成績，各地充分利用當?shù)氐暮颂曳N質(zhì)資源選育出了眾多的核桃優(yōu)良品種和優(yōu)良無性系。但在核桃砧木方面的育種研究，國內(nèi)很少有人問津。核桃砧木對核桃的嫁接親和力、結(jié)果期、品質(zhì)優(yōu)劣、樹體大小、適應性和抗逆性均有一定影響，是核桃生產(chǎn)的基礎(chǔ)，是做大做強我國核桃產(chǎn)業(yè)的必經(jīng)之路。因此，選擇優(yōu)良親本進行雜交，是培育適應性強、抗性高適合我國地域特征和生態(tài)特點的優(yōu)良核桃砧木新品種的一項根本性措施。核桃楸是我國特有的鄉(xiāng)土核桃砧木資源和育種材料，通過雜交育種將核桃楸高抗病優(yōu)良性狀與核桃優(yōu)良特性整合在一起，可以培育出適宜我國氣候特點的抗病、抗逆的核桃砧木新品種。
[0003]核桃和核桃楸的種間雜交屬于遠緣雜交，是利用種間的雜交優(yōu)勢創(chuàng)新核桃砧木種質(zhì)資源的重要方法。但是由于進行種間雜交的親本間，親緣關(guān)系較遠，胚發(fā)育不協(xié)調(diào)和胚敗育是雜交的主要障礙。幼胚培養(yǎng)是解決雜交胚敗育的有效途徑，迄今已在柑桔、葡萄、蘋果、梨及核果類的杏、梅、桃、櫻桃等多種果樹樹種上獲得成功。表明此種培養(yǎng)方法有廣泛適用性，實用價值較大。在核桃砧木的抗性育種中，利用該項技術(shù)，可在核桃和核桃楸授精胚敗育發(fā)生之前進行胚培養(yǎng)，獲得種間雜交后代，解決核桃砧木抗性育種中雜種胚敗育和遠緣雜交不實的難題。鑒于上述原因，我們認為有必要將生物技術(shù)(幼胚培養(yǎng))同常規(guī)育種程序相結(jié)合，借助幼胚培養(yǎng)技術(shù)可以克服遠緣雜交中胚敗育現(xiàn)象的途徑，在不影響世代間選擇進度及遺傳背景的前提下，大大縮短育種周期，可以改進目前常規(guī)核桃砧木育種方法，建立新的育種程序，對加快育種進程，快速選育出適應性強、多抗的核桃砧木有重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明為了解決核桃砧木種間雜交育種中的難題，將生物技術(shù)(幼胚培養(yǎng))同常規(guī)育種程序相結(jié)合，借助幼胚培養(yǎng)技術(shù)可以克服核桃和核桃楸種間遠緣雜交胚敗育現(xiàn)象，為快速選育出適應性強、多抗的核桃砧木提供新的育種方法。
[0005]本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
一種核桃與核桃楸種間雜交幼胚培養(yǎng)的方法，包括以下步驟:
(1)、雜交果的獲得及其無菌化處理
以優(yōu)良核桃為父本，核桃楸為母本，進行雜交，雜交60天后取幼果，并進行無菌化處理；
(2)幼胚的獲得在超凈工作臺上，將幼果用無菌紙包裹，然后打開果核后，看到置于核桃頂端、夾在兩片子葉間的幼胚，將幼胚取出放入有培養(yǎng)基的試管中，進行培養(yǎng)；
(3)幼胚的培養(yǎng)
幼胚的培養(yǎng)基為DKW培養(yǎng)基，附加植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA 1.0mg/L,IBA 0.0lmg/ L;培養(yǎng)條件:首先在4°C冰箱中放3周，然后在25°C條件下暗培養(yǎng)3周；待幼胚萌發(fā)，長出胚根和嫩莖，將胚根切去，僅留嫩莖，放培養(yǎng)室光照下培養(yǎng)，每天光照時間16小時，溫度25°C ；
(4)胚培苗的繼代
將高為3_4cm的胚培苗截成1.5-2.0cm長的莖段，進行繼代，繼代培養(yǎng)基以DKW為基本培養(yǎng)基，附加植物生長調(diào)節(jié)劑BA 2.0mg/ L和IBA 0.0 lmg/ L;培養(yǎng)條件:光照下培養(yǎng)，每天光照時間16小時，溫度25°C;
(5)胚培苗的生根誘導
將高為5_6cm繼代胚培苗，插入生根誘導培養(yǎng)基中；生根誘導培養(yǎng)基以DKW為基本培養(yǎng)基，附加植物生長調(diào)節(jié)劑IBA 10mg/L，培養(yǎng)條件:暗培養(yǎng)一周，溫度25°C ;
(6)胚培苗的生根和煉苗
將生根誘導后的嫩莖，移栽到生根基質(zhì)中；將移栽好的苗盤，放入濕度100%的環(huán)境中，直到嫩莖生根，且根長3cm以上，每個苗至少有3條根以上;將達到這一標準的幼苗移栽到濕度為85%的環(huán)境中繼續(xù)煉苗I周，然后逐漸降低濕度，直到可以適應普通大棚中的環(huán)境；
(7)胚培苗的移栽
將煉好苗的胚培苗移栽到營養(yǎng)缽中，正常管理，當胚培苗長高到50cm以上，移栽到大田，并按大田日常管理程序進行即可。
[0006]本發(fā)明提供的核桃與核桃楸種間雜交幼胚培養(yǎng)的方法，可以使雜種幼胚的萌發(fā)率達到95%，胚培苗莖段的生根率達到75%，移栽成活率達到85%。本發(fā)明通過生物技術(shù)和傳統(tǒng)育種有機結(jié)合，提供了核桃和核桃楸遠緣雜交可以獲得雜交苗的育種新途徑。并且可以縮短育種進程，提高育種效率，建立新的育種程序。為獲得優(yōu)良抗性核桃砧木，擴大核桃砧木育種種質(zhì)資源奠定了良好的育種基礎(chǔ)，對核桃砧木育種的快速、有效進行開辟了新的育種途徑，有重要的現(xiàn)實意義。
[0007]本發(fā)明設(shè)計合理，該核桃與核桃楸種間雜交幼胚培養(yǎng)的方法，具體是以優(yōu)良核桃為父本，核桃楸為母本進行雜交，從雜交幼果中取出幼胚進行無菌培養(yǎng)，獲得種間雜交植株。是一種將生物技術(shù)和傳統(tǒng)育種程序相結(jié)合，進行核桃種間雜交，獲得優(yōu)良核桃砧木的育種方法。
【具體實施方式】
[0008]下面對本發(fā)明的具體實施例進行詳細說明。
[0009]—種核桃與核桃楸種間雜交幼胚培養(yǎng)的方法，包括以下步驟:
(I)雜交果的獲得及其無菌化處理
以優(yōu)良核桃為父本，核桃楸為母本，進行雜交。雜交60天后取幼果，帶回實驗室進行無菌化處理。無菌化步驟為:將幼果用流水沖洗干凈。用70%酒精浸泡30秒，在20%次氯酸鈉溶液中浸泡20分鐘，然后浸泡在5%的次氯酸鈉溶液中，放在超凈工作臺上備用。
[0010](2)幼胚的獲得在超凈工作臺上，將幼果用無菌紙包裹，用虎鉗子夾緊，并繼續(xù)用力直到果核裂開。將裂開的幼果放工作臺上，把包裹的無菌紙和青皮及果核用無菌鑷子撥開，即可看到置于核桃頂端，夾在兩片子葉間的幼胚，將幼胚取出放入有培養(yǎng)基的試管中，進行培養(yǎng)。
[0011](3)幼胚