一種去除構(gòu)樹(shù)葉片蛋白質(zhì)中RuBisco蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[000?]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種去除構(gòu)樹(shù)葉片蛋白質(zhì)中RuBisco蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]構(gòu)樹(shù)是一種多功能綜合性樹(shù)種，整個(gè)植株都具有開(kāi)發(fā)潛力。其葉片含有豐富的粗蛋白、粗脂肪和粗纖維等營(yíng)養(yǎng)成分，可以部分替代豆柏、麥麩等常規(guī)飼料，用于豬、牛、羊等家畜養(yǎng)殖。在我國(guó)飼料行業(yè)的配方技術(shù)結(jié)構(gòu)仍以玉米-豆柏型為主。豆柏、玉米等大宗原料對(duì)外依存度越來(lái)越高，受?chē)?guó)際市場(chǎng)影響愈來(lái)愈大。因此，如何突破現(xiàn)有的配方技術(shù)，開(kāi)發(fā)新的原料和替代品，成為增強(qiáng)企業(yè)綜合實(shí)力，提高競(jìng)爭(zhēng)力的重要挑戰(zhàn)。構(gòu)樹(shù)葉片正是解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵。2015年構(gòu)樹(shù)扶貧以列為國(guó)務(wù)院十大精準(zhǔn)扶貧項(xiàng)目之一。
[0003]雙向凝膠電泳技術(shù)作為研究植物蛋白質(zhì)組的重要手段，為生物技術(shù)手段進(jìn)行品種改良提供重要理論依據(jù)。在雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)中，RuBisco這種超高豐度的蛋白會(huì)嚴(yán)重限制低豐度蛋白的檢測(cè)。主要有三方面的影響:一方面蛋白上樣量有限，低豐度蛋白因?yàn)楹刻僭诤罄m(xù)的染色過(guò)程中不能顯現(xiàn)；另一方面是RuBisco的位置效應(yīng)，RuBisco蛋白會(huì)掩蓋周?chē)牡拓S度蛋白；第三是在雙向上整體干擾其它蛋白的正常電泳分離，其周?chē)鞍c(diǎn)的泳道變化最為明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種去除植物葉片蛋白質(zhì)中RuBisco蛋白的方法。
[0005]本發(fā)明所提供的去除植物葉片蛋白質(zhì)中RuBisc0蛋白的方法，是利用濃度為300-500g/L(如400g/L)的PEG4000溶液去除植物葉片蛋白質(zhì)中RuBisco蛋白。
[0006]進(jìn)一步，所述去除植物葉片蛋白質(zhì)中RuBisco蛋白的方法，可包括如下步驟:
[0007](I)將植物葉片放入GMI勻漿液中研磨后得到第一勻漿，將GMII勻漿液加入到所述第一勻漿中研磨后得到第二勻漿；
[0008]所述GMI勻漿液的溶劑為pH值為7-9的400-600mM Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)及濃度為:15-25mM MgCl2和0.8-1.2mM PMSF ；
[0009]所述GMII勻漿液的溶劑為pH值為7-9的400-600mM Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)及濃度為:15-25mM MgCl2、0.8-1.2mM PMSF和3-5% (體積百分含量)Nonidet P-40；
[0010]其中，pH值為7-9的400-600mM Tris-HCl緩沖液為本領(lǐng)域常規(guī)表示方法，指400-600mM Tris溶液用HCl調(diào)pH至7-9的緩沖液。
[0011](2)將所述第二勻漿于4°C8000-12000g離心5min-15min，取上清，記為第一上清液；
[0012](3)向所述第一上清液中加入等體積的濃度為300-500g/L(如400g/L)的PEG4000溶液(溶劑為去離子水)，冰上靜置20min-40min，于4°C8000-12000g離心5min_15min，取上清，記為第二上清液；
[0013](4)向所述第二上清液中加入所述第二上清液1/4體積的濃度為400-600g/L(如500g/L)的三氯乙酸(TCA)溶液(溶劑為去離子水)，冰上靜置30min-50min，于4°C8000-12000g離心5min-15min，棄上清，得蛋白粗沉淀；
[0014](5)向所述蛋白粗沉淀中加入4°C預(yù)冷的溶液A，于4°C8000-12000g離心5min-15min，棄上清，得沉淀，完成一次洗滌;重復(fù)所述洗滌的步驟至少一次，最后一次所得沉淀即為去除了RuBisco蛋白的植物葉片蛋白；
[0015]所述溶液A的溶劑為丙酮，溶質(zhì)及濃度為10g/L二硫蘇糖醇(DTT)。
[0016]在所述方法的步驟(I)中，所述植物葉片、所述GMI勻漿液與所述GMII勻漿液的使用配比可為0.58:500-70(^1^500-70(^1^步驟(1)中所述植物葉片與步驟(3)中所述PEG4000溶液的使用配比可為0.5g: 1000-2000yL。步驟(I)中所述植物葉片與步驟(4)中所述三氯乙酸(TCA)溶液的使用配比可為0.5g: 400-600yL。步驟(5)中，進(jìn)行所述洗滌時(shí)，所述蛋白粗沉淀與所述溶液A的體積配比可為I:(3-5)。
[0017]進(jìn)一步，在所述方法的步驟(I)中，所述植物葉片、所述GMI勾楽液與所述GMn勾楽液的使用配比具體為0.5 g: 6 O O μ L: 6 O O μ L。步驟(I)中所述植物葉片與步驟(3)中所述PEG4000溶液的使用配比具體為0.5g: 1500yL。步驟(I)中所述植物葉片與步驟(4)中所述三氯乙酸(TCA)溶液的使用配比具體為0.5g:500yL。步驟(5)中，進(jìn)行所述洗滌時(shí)，所述蛋白粗沉淀與所述溶液A的體積配比具體為1:4。
[0018]在本發(fā)明中，所述GMI勻漿液的溶劑為pH值為8的500mMTris-HCl緩沖液，溶質(zhì)及濃度具體為:20mM MgCl2和ImM PMSF。所述GMII勻漿液的溶劑為pH值為8的500mM Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)及濃度具體為:20mM MgCl2、lmM PMSF和4% (體積百分含量)Nonidet P-40。
[0019]在所述方法的步驟(2)-步驟(5)中，所述離心均具體為4°C1000g離心lOmin。
[0020]在所述方法的步驟(3)中，所述冰上靜置的時(shí)間具體為30min。步驟(4)中，所述冰上靜置的時(shí)間具體為40min。
[0021]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，步驟(5)中，共進(jìn)行所述洗滌2次。
[0022]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于去除植物葉片蛋白質(zhì)中RuBisc0蛋白的成套
τ?: 口廣PR ο
[0023]本發(fā)明所提供的用于去除植物葉片蛋白質(zhì)中RuBisc0蛋白的成套產(chǎn)品，含有如下:
[0024](al)GMI 勻漿液；
[0025]所述GMI勻漿液的溶劑為pH值為7-9的400-600mM Tris-HCl緩沖液(用去離子水配制)，溶質(zhì)及濃度為:15-25mM MgCl2和0.8-1.2mM PMSF；
[0026]在本發(fā)明中，所述GMI勻漿液的溶劑為pH值為8的500mMTris-HCl緩沖液(用去離子水配制)，溶質(zhì)及濃度具體為:20mM MgCl2和ImM PMSF。
[0027](a2)GMII 勻漿液；
[0028]所述GMII勻漿液的溶劑為pH值為7-9的400-600mM Tris-HCl緩沖液(用去離子水配制)，溶質(zhì)及濃度為:15-25mM MgCl2、0.8-1.2mM PMSF和3-5% (體積百分含量)NonidetP-40；
[0029]在本發(fā)明中，所述GMII勻漿液的溶劑為pH值為8的500mMTris-HCl緩沖液(用去離子水配制)，溶質(zhì)及濃度具體為:20mM MgCl2UmM PMSF和4% (體積百分含量)Nonidet P-40 ο
[0030](a3)濃度為300-500g/L(如400g/L)的PEG4000溶液(溶劑可為水)；
[0031](a4)濃度為400-600g/L(如500g/L)的三氯乙酸(TCA)溶液(溶劑可為水)；
[0032](&5)溶液八；
[0033]所述溶液A的溶劑為丙酮，溶質(zhì)及濃度為10g/L二硫蘇糖醇(DTT)。
[0034]所述方法或所述成套產(chǎn)品在分離植物葉片蛋白質(zhì)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0035]在所述應(yīng)用中，具體是采用蛋白質(zhì)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行植物葉片蛋白質(zhì)的分離的。所述采用蛋白質(zhì)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行植物葉片蛋白質(zhì)的分離的方法可包括如下步驟:
[0036](a)將步驟(5)所得沉淀(即采用上述去除植物葉片蛋白質(zhì)中RuBisc0蛋白的方法獲得的去除了RuBisco蛋白的植物葉片蛋白)進(jìn)行第一向等電聚焦電泳；
[0037](b)待步驟(a)的第一向等電聚焦電泳結(jié)束后取出膠條，進(jìn)行膠條平衡；
[0038](c)將經(jīng)步驟(b)平衡后的膠條進(jìn)行第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；
[0039](d)待步驟(C)的第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)束后取出凝膠，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行掃描及圖像分析，完成植物葉片蛋白質(zhì)的分離。
[0040]在所述方法的步驟(a)中，進(jìn)行所述第一向等電聚焦電泳的方法可包括如下步驟:將步驟(5)所得沉淀(即采用上述去除植物葉片蛋白質(zhì)中RuBisc0蛋白的方法獲得的去除了RuBisco蛋白的植物葉片蛋白)經(jīng)裂解液(溶劑為去離子水，溶質(zhì)及濃度如下:7M尿素、2M硫脲、40g/L CHAPS和體積百分比2%的Pharmalyte pH3_10)溶解，12000g離心后，取上清液按照如下條件進(jìn)行等電聚焦電泳:電壓200V電泳30分鐘，電壓400V電泳15小時(shí)，電壓800V電泳I小時(shí)。
[0041]在所述方法的步驟(b)中，進(jìn)行所述膠條平衡的方法具體可包括如下步驟:將所述膠條移入SDS上樣緩沖液(溶劑為pH6.8的62.5mM Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)及濃度如下:體積百分比10%甘油、25g/L SDS、10g/L二硫蘇糖醇和0.1g/L溴酚藍(lán))中平衡30分鐘。
[0042]在所述