器注入到細(xì)管中，上端注入60yL去離子水隔絕空氣，靜置，待凝膠完全聚合之后(5小時(shí)以上)，吸去凝膠柱頂部的去離子水，去掉底部的封口膜，并將玻璃管安裝在電泳漕上，連接上電泳儀。取500yg蛋白樣品經(jīng)裂解液(溶劑為去離子水，溶質(zhì)及濃度如下:7M尿素、2M硫脲、40g/LCHAPS和體積百分比2 %的Pharmalyte pH3_10)溶解并振蕩，12000g離心后，上清液加于凝膠上端。樣品端(上端)加上陰極電泳緩沖液(20mMNaOH)，另一端(下端)加上陽極電泳緩沖液(6.67mM H3PO4)。依次在電壓200V電泳30分鐘，電壓400V電泳15小時(shí)，電壓800V電泳I小時(shí)。
[0084]2、膠條平衡
[0085]一向電泳結(jié)束后，膠條移入4mL SDS上樣緩沖液(溶劑為pH = 6.8 62.5mM Tris-HCl緩沖而已，溶質(zhì)及濃度如下:體積百分比10%甘油、25g/L SDS、10g/L 二硫蘇糖醇和
0.lg/L溴酚藍(lán))中平衡30分鐘。
[0086]3、第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0087]⑴制膠
[0088]先在灌膠模具中灌入聚丙烯酰胺質(zhì)量百分含量為15%的分離膠，靜置直至分離膠凝固，接著灌入聚丙烯酰胺質(zhì)量百分含量為4%的濃縮膠，得到垂直膠板，位于垂直膠板上部的濃縮膠的高度為2cm，位于垂直膠板下部的分離膠的高度13cm。
[0089](2)電泳
[0090]將步驟2平衡好的膠條轉(zhuǎn)移到步驟(I)制備好的垂直板膠的頂端，用I%(Ig/100ml)的瓊脂糖溶液(溶劑為去離子水)密封，置于電泳槽上，加滿電極緩沖液，在電流為4mA的條件下預(yù)電泳20分鐘，在電流為30mA的條件下電泳約3小時(shí)。
[0091]其中，所述電極緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下:質(zhì)量百分含量為0.3%的Tris、質(zhì)量百分含量為1.44%的甘氨酸、質(zhì)量百分含量為0.1 %的SDS。
[0092]4、電泳凝膠染色
[0093]第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳完成后，取下凝膠，放入到含有10ml的固定液的染色盒中，然后放在轉(zhuǎn)速為60次/分鐘的搖床上搖動(dòng)30分鐘后，將凝膠放入90°C10ml的染色液中，在60次/分鐘的搖床上搖動(dòng)10分鐘后;將凝膠放入10ml的脫色液中，在60次/分鐘的搖床上搖動(dòng)30分鐘，重復(fù)3次，得到蛋白點(diǎn)鮮明考馬斯亮藍(lán)染色后的凝膠。
[0094]其中，所述固定液的組成如下:質(zhì)量百分含量為40%的乙醇、質(zhì)量百分含量為10%的冰乙酸，余量為水。所述染色液的組成如下:質(zhì)量百分含量為0.02%的考馬斯亮藍(lán)R-350、質(zhì)量百分含量為10%的冰乙酸，余量為水。所述脫色液的組成如下:質(zhì)量百分含量為10%的冰乙酸，余量為水。
[0095]5、凝膠掃描及圖像分析
[0096]將經(jīng)步驟4考馬斯亮藍(lán)染色后的凝膠用UMAX掃描儀在參數(shù)為256階灰度、600dpi條件下透射掃描，所得圖像用ImageMaster? 2D Platinum軟件(Amersham B1science)進(jìn)行分析。
[OO97 ] 結(jié)果顯示:未經(jīng)PEG沉淀去除RuB i s c ο蛋白的構(gòu)樹葉片蛋白質(zhì)(對(duì)照組)的雙向電泳圖譜如圖1所示;經(jīng)PEG沉淀去除RuBisco蛋白的構(gòu)樹葉片蛋白質(zhì)(實(shí)驗(yàn)組)的雙向電泳圖譜如圖2所示。圖1、2中A、B、C部分詳細(xì)情況如圖3所示。圖1和圖2中A部分為RuBisco蛋白大亞基(LSU)，B、C、部分為低豐度蛋白質(zhì)?？梢娕c對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組去除了RuBisc0蛋白后，膠圖RuBisc0蛋白點(diǎn)大小顯著降低，低豐度蛋白分離效果顯著提升。圖3為圖1和圖2中A、B、C部分放大顯示后的雙向電泳圖譜。對(duì)A、B、C三個(gè)部分蛋白數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，去除RuBisCO蛋白后，A、B部分有更多蛋白被檢測(cè)出來，C部分蛋白的分離效果明顯提升。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種去除植物葉片蛋白質(zhì)中RuBisco蛋白的方法，是利用濃度為300-500g/L的PEG4000溶液去除植物葉片蛋白質(zhì)中RuBisco蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法包括如下步驟: (1)將植物葉片放入GMI勻漿液中研磨后得到第一勻漿，將GM Π勻漿液加入到所述第一勻漿中研磨后得到第二勻漿； 所述GM I勻漿液的溶劑為pH值為7-9的400-600mM Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)及濃度為:15-25mM MgCl2和0.8-1.2mM PMSF ； 所述GM Π勻漿液的溶劑為pH值為7-9的400-600mM Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)及濃度為:15-25mM MgCl2、0.8-1.2mM PMSF和體積百分含量為3-5% 的Nonidet P-40； (2)將所述第二勻漿于4°C8000-12000g離心5min-15min，取上清，記為第一上清液； (3)向所述第一上清液中加入等體積的濃度為300-500g/L的PEG4000溶液，冰上靜置20min-40min，于 4 °C 8000-12000g 離心 5min_l 5min，取上清，記為第二上清液； (4)向所述第二上清液中加入所述第二上清液1/4體積的濃度為400-600g/L的三氯乙酸溶液，冰上靜置30min-50min，于4°C8000_12000g離心5min_15min，棄上清，得蛋白粗沉淀； (5)向所述蛋白粗沉淀中加入4°C預(yù)冷的溶液A，于4°C8000-12000g離心5min-15min，棄上清，得沉淀，完成一次洗滌;重復(fù)所述洗滌的步驟至少一次，最后一次所得沉淀即為去除了RuBisco蛋白的植物葉片蛋白； 所述溶液A的溶劑為丙酮，溶質(zhì)及濃度為10g/L的二硫蘇糖醇。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述植物葉片、所述GMI勻漿液與所述GM Π勻漿液的使用配比為0.5g: 500-700yL:500-700yL;或步驟(I)中所述植物葉片與步驟(3)中所述PEG4000溶液的使用配比為0.5g:1000-2000yL;或 步驟(I)中所述植物葉片與步驟(4)中所述三氯乙酸溶液的使用配比為0.5g: 400-600μL;或 步驟(5)中，進(jìn)行所述洗滌時(shí)，所述蛋白粗沉淀與所述溶液A的體積配比為1: (3-5)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述植物葉片、所述GMI勻漿液與所述GM Π勻漿液的使用配比為0.5g: 600yL: 600yL；或 步驟(I)中所述植物葉片與步驟(3)中所述PEG4000溶液的使用配比為0.5g: 1500yL;或 步驟(I)中所述植物葉片與步驟(4)中所述三氯乙酸溶液的使用配比為0.5g: 500yL;或 步驟(5)中，進(jìn)行所述洗滌時(shí)，所述蛋白粗沉淀與所述溶液A的體積配比為1:4。5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于:所述GMI勻漿液的溶劑為pH值為8的500mM Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)及濃度為:20mM MgCl2和ImM PMSFjP/^ 所述GM Π勻漿液的溶劑為pH值為8的500mM Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)及濃度為:20mMMgCl2、ImM PMSF和體積百分含量為4%的Nonidet P-40。6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于:步驟(2)-步驟(5)中，所述離心均為 4°C 1000g 離心 lOmin。7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述冰上靜置的時(shí)間為30min;或 步驟(4)中，所述冰上靜置的時(shí)間為40min;或 步驟(5)中，共進(jìn)行所述洗滌2次。8.—種用于去除植物葉片蛋白質(zhì)中RuBisco蛋白的成套產(chǎn)品，含有如下: (al)GM I勻漿液; 所述GM I勻漿液的溶劑為pH值為7-9的400-600mM Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)及濃度為:15-25mM MgCl2和0.8-1.2mM PMSF ； (a2)GM Π勻漿液; 所述GM Π勻漿液的溶劑為pH值為7-9的400-600mM Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)及濃度為:15-25mM MgCl2、0.8-1.2mM PMSF和體積百分含量為3-5% 的Nonidet P-40； (a3)濃度為 300-500g/L 的 PEG4000 溶液； (a4)濃度為400-600g/L的三氯乙酸溶液； (&5)溶液八； 所述溶液A的溶劑為丙酮，溶質(zhì)及濃度為10g/L的二硫蘇糖醇。9.權(quán)利要求1-7中任一所述方法或權(quán)利要求8所述的成套產(chǎn)品在分離植物葉片蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一所述的方法或成套產(chǎn)品或應(yīng)用，其特征在于:所述植物為構(gòu)樹。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種去除構(gòu)樹葉片蛋白質(zhì)中RuBisco蛋白的方法。本發(fā)明所提供的方法可用于去除所有葉片蛋白質(zhì)中RuBisco蛋白，包括如下步驟：(1)制備勻漿；(2)勻漿離心；(3)第一上清液離心；(4)第二上清液離心；(5)蛋白粗沉淀的洗滌。用本發(fā)明的方法提取植物葉片蛋白，有利于減少高豐度蛋白R(shí)uBisco干擾、提高2-DE電泳分辨率，為優(yōu)化植物葉片蛋白質(zhì)組檢測(cè)，運(yùn)用生物技術(shù)手段進(jìn)一步改良品種打下基礎(chǔ)。
【IPC分類】C07K1/30
【公開號(hào)】CN105646645
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】沈世華, 王小曼, 邳植, 藤林宏, 彭獻(xiàn)軍
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院植物研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年3月23日