一種快速鑒定山羊絨周期發(fā)育的方法及其分子靶標(biāo)和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子靶標(biāo)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速鑒定山羊絨周期發(fā)育的方法及其分 子革巴標(biāo)和應(yīng)用.
【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)蒙古絨山羊和山羊絨在國際上占有重要地位，是寶貴的種質(zhì)遺傳資源，是畜牧 業(yè)中最具國際競爭力的一項(xiàng)產(chǎn)業(yè)。內(nèi)蒙古絨山羊以其山羊絨纖細(xì)、潔白、柔軟、光亮而享譽(yù) 世界。2008年絨山羊存欄1868萬只，生產(chǎn)羊絨7642噸，占全國山羊絨產(chǎn)量的48%、世界山 羊絨產(chǎn)量的30%，自治區(qū)羊絨企業(yè)年銷售收入160億元。絨山羊業(yè)已經(jīng)成為內(nèi)蒙古自治區(qū) 重要的民族和民生產(chǎn)業(yè)。在市場上，山羊絨的細(xì)度和長度決定了它的價(jià)值，細(xì)度小于14微 米，長度大于36毫米的羊絨是普通羊絨價(jià)格幾倍甚至是幾十倍。所以如何產(chǎn)出更細(xì)更長的 羊絨，一直是絨山羊遺傳育種研究的重要課題，具有巨大的科研價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但內(nèi)蒙古 絨山羊的山羊絨加工能力與原料供應(yīng)不成比例，每年平均缺口 6000噸左右，如何提高山羊 絨產(chǎn)量和品質(zhì)已成為確保中國山羊絨品牌的重大戰(zhàn)略問題和緊迫任務(wù)。
[0003] 毛囊是毛纖維的"發(fā)源地"，它的性狀和組織結(jié)構(gòu)決定著毛的品質(zhì)和產(chǎn)量。絨山羊 的皮膚中有兩種毛囊，一種是生長粗毛的初級毛囊（Primary follicles)，另一種是生長絨 的次級毛囊（secondary follicles)。毛囊的生長周期一般分為生長期（anagen)、退行期 (catagen)和休止期（telogen)三個階段。曲永年等研究表明遼寧山羊絨從6月開始生 長，至翌年3月份逐漸停止生長，絨全年生長期為9個月，7-11月份是遼寧山羊絨生長 旺盛期，9月份是遼寧山羊絨生長速度高峰月（曲永年，1995)。達(dá)文政等對阿白絨山羊生 長研究表明絨從8月份開始生長，絨全年生長期為7個月，到第2年2月結(jié)束生長，生長 最旺盛的時期是9-11月份（達(dá)文政，1992)。他兩人的研究說明遼寧絨山羊絨的生長期較 長，因此生長期長可能是遼寧絨山羊產(chǎn)絨量高的一大原因。為分析遼寧絨山羊較內(nèi)蒙古絨 山羊絨長、產(chǎn)絨量高的可能原因，李長青等2005年對這兩個品種的絨周期進(jìn)行了組織學(xué)研 究，發(fā)現(xiàn)遼寧絨山羊表皮生發(fā)層3月份開始活動，5月份便已形成毛乳頭，并開始生絨；內(nèi) 蒙古絨山羊4月份才開始活動；遼寧和內(nèi)蒙古絨山羊分別于7、8月份基本完成毛囊重建， 進(jìn)入興盛期，11月份左右細(xì)胞開始死亡，12月份進(jìn)入退行期，2-3月份進(jìn)入休止期（李長 青，2005)。形態(tài)學(xué)的研究說明遼寧絨山羊表皮開始活動和毛囊重建均比內(nèi)蒙古絨山羊提前 1個月，而絨停止生長的時間基本一致，出絨時間的差異是造成各品種產(chǎn)絨量差異的原因之 〇
[0004] 由以上論述可知，山羊的產(chǎn)絨能力直接與其皮膚中的次級毛囊有關(guān)，次級毛囊的 大小直接決定了絨的細(xì)度，次級毛囊的數(shù)量決定了絨的產(chǎn)量，次級毛囊的生長期長短影響 絨長和產(chǎn)絨量。因此山羊次級毛囊的周期發(fā)育對山羊絨產(chǎn)量和絨品質(zhì)具有重要作用，研究 毛囊周期發(fā)育可能增加絨山羊產(chǎn)絨量并改良絨品質(zhì)。另外，皮膚毛囊周期性發(fā)育變化不僅 對于生產(chǎn)有重要作用，同時也為皮膚毛囊疾病模型的研究提供了依據(jù)。
[0005] 目前皮膚和絨周期的研究，主要集中在人和小鼠上。山羊毛囊的研究較少，主要集 中在個別基因的鑒定上。隨著近年來一個新興的研究領(lǐng)域---microRNA(miRNAs)的開發(fā)， 使人們從功能的研究上發(fā)現(xiàn)了越來越多的作為分子靶標(biāo)的miRNA，尤其在癌癥和疾病的研 究方面，因此miRNA的研究逐漸受到人們的重視。
[0006] 二十年前研究人員最初發(fā)現(xiàn)miRNA時，并沒有意識到它的重要性。然而，通過傳統(tǒng) 的克隆方法和生物信息學(xué)手段發(fā)現(xiàn)在線蟲、果蠅、哺乳動物中存在著數(shù)百個miRNA，這引起 了各領(lǐng)域科學(xué)家的重視。目前，在mirbase(http://microrna. sanger.ac.uk/)中，人類基 因組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過2000個成熟的miRNA，約占人類基因的1-4%，這使得其成為最大的一類 基因表達(dá)調(diào)控因子。越來越多的研究人員將注意力轉(zhuǎn)向miRNA的研究。MiRNA表達(dá)的時序 性和組織特異性提示人們miRNA的分布可能決定組織和細(xì)胞的功能特異性，也可能參與了 復(fù)雜的基因調(diào)控，對組織的發(fā)育起重要作用。
[0007] 目前miRNA在人和小鼠等模式動物上的研究較多，家畜miRNA的研究還相對滯 后，主要集中在miRNA的鑒定，以擴(kuò)大miRBase數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有miRNA的數(shù)量（Coutinho et al. 2007 ;Feng et al. 2008 ;Kim et al. 2008 ;Shao etal. 2008)，研究僅僅涉及少數(shù)動物種 類。隨著數(shù)據(jù)庫中miRNA序列的增加，已開始向不同生物學(xué)過程中miRNA功能研究的方向 發(fā)展（Clop et al.2006;Sweetmanet al.，2008)。目前，家畜miRNA的功能研究已經(jīng)涉及多 種動物的肌肉、脂肪、奶、免疫、生殖、疾病等方面（Xi et al.2010;Poly et al.，2004;Kim et al. ,2008 ；ffenguang et al. , 2007)〇
[0008] 雖然miRNA對皮膚毛囊的作用目前研究較少。但越來越多的證據(jù)支持miRNA在皮 膚毛囊的發(fā)育具有不可忽視的作用。2006年Andl首次報(bào)道了 miRNA在皮膚中的研究，表 明Dicer蛋白是RNA干擾機(jī)制的關(guān)鍵組分，負(fù)責(zé)miRNA的產(chǎn)生，他們在表皮Dicer缺失小鼠 中觀察到毛囊外翻至表皮，同時發(fā)現(xiàn)，毛囊增殖過程中重要的信號分子Shh和Notchl在出 生后7d缺失，毛囊發(fā)育不良、再生障礙和錯位發(fā)育等，表皮過度增殖（Andl et al.，2006)。 毛囊發(fā)育的這些表型變化證實(shí)了 miRNA在維持動物皮毛的形態(tài)發(fā)生方面具有作用。同年， 美國哈佛醫(yī)學(xué)中心的研究人員通過制備E17. 5胎鼠表皮與毛囊的小RNA文庫，通過克隆測 序獲得了皮膚上100多個miRNA，發(fā)現(xiàn)91 %的皮膚小RNA和63 %的毛囊小RNA為miRNA。 這一研究發(fā)表在Nature genetic上（Yi et al·，2006)。2007年zhang等構(gòu)建了皮膚毛囊 的表達(dá)譜芯片，比較了綿羊和山羊的miRNA，獲得了 159個miRNA，發(fā)現(xiàn)了 105個山羊和綿 羊共表達(dá)的miRNA.其中，let-7、miR-17、miR-30、miR-15和miR-8基因的家族高頻率表達(dá) (Wenguang et al.，2007)。在小鼠和山羊皮膚中發(fā)現(xiàn)的大量miRNA，可能預(yù)示著miRNA在皮 膚毛囊中發(fā)揮重要的作用。
[0009] 2008年Nature上報(bào)導(dǎo)改變體內(nèi)的miR-203的時空表達(dá)可以誘導(dǎo)皮膚的分層和分 化，miR-203控制表皮細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)而促進(jìn)表皮分化（Yi et al.，2008)。 2010年英國和美國科學(xué)家在小鼠毛發(fā)周期不同階段使用基因芯片探索了 miRNA的表達(dá)， 比較了小鼠毛發(fā)的生長期、休止期和退行期miRNA的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在毛囊和皮膚其他 組織大量的miRNA顯著變化，其中miR-31在生長期和退行期以及休止期變化非常顯著 (Mardaryev et al.，2010)。這進(jìn)一步說明miRNA在皮膚毛囊細(xì)胞發(fā)育和表皮分化以及絨 周期的發(fā)育中具有重要作用。
[0010] miRNA在分子調(diào)控和靶標(biāo)作用的領(lǐng)域成為新的研究熱點(diǎn)，尤其在人類的疾病和發(fā) 育中作為分子靶標(biāo)的報(bào)道已很多。目前還沒有miRNA在山羊絨周期發(fā)育的靶標(biāo)的報(bào)道。
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