定量細(xì)胞端粒酶活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種定量細(xì)胞端粒酶活性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 端粒酶是一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶，廣泛存在于從低等單核生物如纖毛蟲、酵母到高等脊椎 動(dòng)物如小鼠、人類的細(xì)胞中。能夠在染色體末端延伸六個(gè)堿基的重復(fù)序列(TTAggg)，延長(zhǎng)端 粒長(zhǎng)度，從而維持細(xì)胞的分裂潛力。目前研究發(fā)現(xiàn)，90 % -95 %的人永生化細(xì)胞株和85 %的 腫瘤組織中檢測(cè)到端粒酶活性，在有轉(zhuǎn)移傾向的癌細(xì)胞組織中更是能夠檢測(cè)到端粒酶的高 表達(dá)，而在正常組織細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到端粒酶活性，因而端粒酶活性的檢測(cè)對(duì)于癌癥的 早期診斷有著重要意義。
[0003] 目前端粒酶活性的檢測(cè)已經(jīng)發(fā)展出一些方法，比如端粒酶直接延伸，TRAP等。定量 端粒酶活性也有直接TRAP PCR產(chǎn)物電泳，sybr green法熒光定量，以及蝎型探針，發(fā)夾引物 等。由于端粒酶延伸后的PCR過程中產(chǎn)生的DNA是大小不一的重復(fù)片段，因而sybr green法 檢測(cè)的結(jié)果和端粒酶之間無法建立準(zhǔn)確的線性關(guān)系;探針法由于引入了第三條引物，可能 帶來更多的非特異性擴(kuò)增。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明涉及一種定量細(xì)胞端粒酶活性的方法，其中使用定量PCR為promega公司的 Plexor qPCR Systems，基本原理是如圖1所示。Is〇-dGTP，is〇-dCTP都是非天然且能被聚合 酶識(shí)別的堿基。引物5'端iso-dC上帶有FAM基團(tuán)，在PCR過程中互補(bǔ)鏈摻入Dabcyl-iso-dGTP 后熒光淬滅，檢測(cè)FAM熒光信號(hào)的變化可以定量PCR產(chǎn)物量。端粒酶延伸產(chǎn)物長(zhǎng)度不一，且 PCR的下游引物配對(duì)位點(diǎn)不固定，所以端粒酶延伸產(chǎn)物的PCR產(chǎn)物大小不一。但由于本方法 中檢測(cè)PCR產(chǎn)物的探針信號(hào)在引物上，故不論P(yáng)CR產(chǎn)物多長(zhǎng)，一條模板只能產(chǎn)生一次信號(hào)淬 滅。本方法可以通過檢測(cè)引物上的熒光信號(hào)淬滅來定量初始模板量，建立端粒酶數(shù)量或細(xì) 胞數(shù)與Ct值的線性關(guān)系。
[0005] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種定量細(xì)胞端粒酶活性的方法，其包括對(duì)待測(cè)樣品 的細(xì)胞裂解物進(jìn)行利用在5'端標(biāo)記FAM-iso-dC的引物進(jìn)行端粒酶的延伸反應(yīng)和利用 Dabcyl-iso-dGTP進(jìn)行焚光淬滅的PCR反應(yīng)。
[0006] 在具體的實(shí)施方案中，所述延伸反應(yīng)的條件為25°C25min。
[0007] 在具體的實(shí)施方案中，所述PCR反應(yīng)的擴(kuò)增條件為94°C30s，55°C30s，PCR循環(huán)數(shù)40 個(gè)。
[0008] 在具體的實(shí)施方案中，所述方法還包括檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟，所述熒光信號(hào)檢測(cè) 在55°C30s后進(jìn)行。
[0009] 在具體的實(shí)施方案中，所述5 '端標(biāo)記FAM-iso-dC的引物為5 ' 6FAM-( iso-dc)-AGCATCCGTCGAGCAGAGTT，其序列為SEQ ID N0:1所示，其中5'6FAM修飾在非天然堿基dC 5' 端的羥基上。
[0010]在具體的實(shí)施方案中，所述PCR反應(yīng)中利用Dabcyl-iso-dGTP和引物對(duì)，其中所述 引物對(duì)為SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:1和3所示的序列。
[0011] 在具體的實(shí)施方案中，使用購(gòu)自Promega公司的試劑盒Plexor qPCR Systems進(jìn)行 延伸反應(yīng)以及進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。
[0012] 在具體的實(shí)施方案中，所述待測(cè)樣品為組織細(xì)胞，血液，尿液，胸水，或腹水。
[0013] 在具體的實(shí)施方案中，所述待測(cè)樣品來自染色體端粒為TTAGGG重復(fù)序列的哺乳動(dòng) 物，如人，小鼠或大鼠。
[0014] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，涉及定量細(xì)胞端粒酶活性的試劑盒，其包含用于端粒酶 的延伸反應(yīng)的在5'端標(biāo)記FAM-iso-dC的引物和利用Dabcyl-iso-dGTP進(jìn)行熒光淬滅的PCR 反應(yīng)的引物。
[0015] 在具體的實(shí)施方案中，所述5 '端標(biāo)記FAM-iso-dC的引物為5 ' 6FAM-( iso-dC)-AGCATCCGTCGAGCAGAGTT，其序列為SEQ ID N0:1所示，其中5'6FAM修飾在非天然堿基dC 5' 端的羥基上。
[0016] 在具體的實(shí)施方案中，用于所述PCR反應(yīng)中的引物為SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2 或SEQ ID NO:1和3所示的序列。
[0017] 在具體的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含Dabcyl-iso-dGTP。
[0018] 在具體的實(shí)施方案中，所述Dabcyl-iso-dGTP來自購(gòu)自Promega公司的試劑盒 Plexor qPCR Systems〇
[0019] 在具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為組織細(xì)胞，或來自血液，尿液，胸水，或腹水;優(yōu) 選地，所述細(xì)胞來自染色體端粒為TTAGGG重復(fù)序列的哺乳動(dòng)物，如人，小鼠或大鼠。
【附圖說明】
[0020] 圖1端粒酶活性檢測(cè)原理。（A)端粒酶延伸出不同大小的產(chǎn)物。（B)PCR中下游引物 在模板DNA上延伸到末端摻入dabcyl標(biāo)記iso-dGTP后，互補(bǔ)鏈上FAM熒光淬滅。
[0021] 圖2.不同濃度Hela細(xì)胞核粗提物中端粒酶活性的定量檢測(cè)結(jié)果。圖（A)是歸一化 后的樣品PCR擴(kuò)增曲線，橫軸標(biāo)示PCR循環(huán)數(shù)，縱軸是每一輪循環(huán)中樣品熒光信號(hào)歸一化后 的值，實(shí)線從右到左分別是1個(gè)到12000個(gè)細(xì)胞數(shù)的擴(kuò)增曲線，虛線為0個(gè)細(xì)胞數(shù)的對(duì)照樣 品。圖（B)是Ct值與細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)的線性關(guān)系圖。在圖A曲線中，以縱軸0.9為擴(kuò)增曲線變化 的閾值對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)為每個(gè)樣品Ct值，然后以Ct值為縱軸，樣品細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)為橫軸做曲線， 擬合后的曲線方程為Y = 33-3.4*X，R2 = 0.9986。
[0022] 圖3檢測(cè)正常細(xì)胞中混有的癌細(xì)胞端粒酶活性。圖A，hela細(xì)胞和W58細(xì)胞以不同比 例混合樣品歸一化后的PCR擴(kuò)增曲線，橫軸標(biāo)示PCR循環(huán)數(shù)，縱軸是每一輪循環(huán)中樣品熒光 信號(hào)歸一化后的值，虛線為〇個(gè)細(xì)胞數(shù)的對(duì)照樣品。圖B，Ct值與細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)的線性關(guān)系 圖。在圖A曲線中，以縱軸0.9為擴(kuò)增曲線變化的閾值，對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)為每個(gè)樣品Ct值，然后以 Ct值為縱軸，樣品細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)為橫軸做曲線，擬合后的曲線方程為Y = 31.32-2.59*X R2 = 0·9921〇
[0023]圖4人膀胱癌細(xì)胞5637,人前列腺癌細(xì)胞22RV1端粒酶活性檢測(cè)以及尿液處理細(xì)胞 對(duì)端粒酶活性影響。圖A，人膀胱癌細(xì)胞5637在尿液處理前后端粒酶活性檢測(cè)，橫軸標(biāo)示PCR 循環(huán)數(shù)，縱軸是每一輪循環(huán)中樣品熒光信號(hào)歸一化后的值，實(shí)線為歸一化后不同細(xì)胞數(shù)樣 品的PCR擴(kuò)增曲線，虛線為0個(gè)細(xì)胞數(shù)的對(duì)照樣品。圖B，人前列腺癌細(xì)胞22RV1端粒酶活性檢 測(cè)，數(shù)據(jù)表示方式同圖A。
[0024]圖5表示PCR引物序列的更改對(duì)端粒酶活性檢測(cè)的影響，不同數(shù)量hela細(xì)胞核蛋白 粗提物端粒酶活性檢測(cè)時(shí)，歸一化后的PCR擴(kuò)增曲線。橫軸表示PCR循環(huán)數(shù)，縱軸是每一輪循 環(huán)中樣品熒光信號(hào)歸一化后的值，〇個(gè)細(xì)胞數(shù)的樣品為無端粒酶陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】 [0025]使用的材料
[0026] 使用到的引物DNA(I so-MTS和ACX/CXT)是在Takara公司合成。
[0027]使用試劑
[0028] Plexor qPCR Systems購(gòu)自Promega公司，人宮頸癌細(xì)胞（名稱:HeLa)，人胚肺成纖 維細(xì)胞（名稱:W58)，人膀胱癌細(xì)胞系（名稱:5637)，人前列腺癌細(xì)胞系（名稱:22RV1)購(gòu)自中 國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。PBS購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。
[0029] 細(xì)胞裂解液可以是來自Qiagen公司的Qproteome Nuclear Protein Kit中Lysis Buffer NL，或者是來自Thermo Fisher Scientific公司的NE-PERNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (核蛋白-胞衆(zhòng)蛋白抽提試劑盒)產(chǎn)品中的Cytoplasmic Extraction Reagent(胞衆(zhòng)蛋白抽提試劑）。
[0030] 本發(fā)明中使用的細(xì)胞裂解液包含以下成分:NaCl 150mM，MgCl21.5mM，Tris-HCl (pH 7 · 5) 10mM，NP400 · 5% (V/V)，蛋白酶抑制劑AEBSF0 · 5mM(Sigma-Aldrich)，RNA酶抑制劑 0·2υ/μ1 (Thermo Fisher Scientific公司），BSA 0.2mg/ml(Takara公司）。
[0031] 細(xì)胞核裂解液可以是來自Qiagen公司的Qproteome Nuclear Protein Kit中 Extraction Buffer NX1/NX2,或者是來自Thermo Fisher Scientific公司的NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents(核蛋白-胞衆(zhòng)蛋白抽提試劑盒)產(chǎn)品中 的Nuclear Extraction Reagent(核蛋白抽提試劑）。
[0032] 本發(fā)明中使用的細(xì)胞核裂解液包含以下成分：Tris-HCl(pH 7.5)10mM， MgCl21.5mM，EGTA lmM，CHAPS 0.5%(m/V)，甘油 10%(V/V)，DTT 5mM，蛋白酶抑制劑AEBSF 0 · 5mM(Sigma-Aldrich)，RNA酶抑制劑lU/μΙ (Thermo Fisher Scientific公司），BSA0 · 2mg/ ml (Takara公司）。
[0033] 引物序列：
[0034]
[0035] 注:對(duì)于6FAM_(is〇-dC)，其中is〇-dC為非天然喊基dC，5'6FAM修飾在非天然喊基 dC 5'端的羥基上。
[0036] 實(shí)驗(yàn)步驟
[0037] 1.端粒酶提取
[0038] a)培養(yǎng)細(xì)胞的收集
[0039] 將培養(yǎng)的細(xì)胞使用胰酶消化分散后加入含血清培養(yǎng)基終止胰酶反應(yīng)，500g離心3 分鐘，去掉培養(yǎng)基，細(xì)胞用20ml PBS重懸，500g離心3分鐘，加入lml PBS重懸細(xì)胞并且轉(zhuǎn)移 至lml