測量干血斑中無細(xì)胞病毒顆粒的方法
【專利說明】測量干血斑中無細(xì)胞病毒顆粒的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及測量血液中病毒載量的領(lǐng)域，并且更具體地講，設(shè)及測量干血斑中無 細(xì)胞病毒顆粒的方法。
[0002] 發(fā)明背景 2013年，世界衛(wèi)生組織(WHO)修訂了現(xiàn)行的HIV治療和預(yù)防準(zhǔn)則并強調(diào)了 HIV病毒載量 (VL)測試在對HIV陽性患者的管理中的重要性。WK)強烈推薦使用HIV病毒載量測試替代臨 床表現(xiàn)和CD4細(xì)胞計數(shù)W監(jiān)測HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(ART),并且將對于治療效果的HIV血漿 化水平的截斷值從5000份拷貝/mL降至1000份拷貝/mL。換句話講，如果接受ART治療的HI V 患者血漿中的病毒滴度大于1000份拷貝/mL，則將看作是藥物治療失敗。對治療失敗的應(yīng)對 (如依從性咨詢、藥物耐藥性測試和二線治療方案)是耗時且昂貴的，而應(yīng)當(dāng)僅在有必要時 使用。
[0003] 在感染后，HIV病毒不僅在被感染的細(xì)胞內(nèi)開始自我復(fù)制，還將其cDNA整合至宿主 染色體中作為潛伏的HIV前病毒DNA化reene, W.C.與化terlin, B.M., 2002，fading HIV's remarkable voyage through the cell, Nat Med.8(7): 673-80; Blankson, J.N., D. Persaud, R.F.Siliciano, 2002, The Challenge of Viral Reservoirs in HIV-1 Infection, Annu.Rev. Med. 53: 557-593)。通常使用血漿作為標(biāo)本類型測量HIV病 毒載量。然而，在資源有限的環(huán)境中，如非洲，血漿樣品可能不易獲得、保存、轉(zhuǎn)移和測試(世 界衛(wèi)生組織2013,關(guān)于使用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療和預(yù)防HIV感染的綜合準(zhǔn)則:對公共衛(wèi) 生措施的建議。世界衛(wèi)生組織，日內(nèi)瓦）。已經(jīng)就干血斑(DBS)作為在資源有限的環(huán)境中HIV 病毒載量測試的解決方案進(jìn)行了評價，但取得了有限的成功（Smit PW等人，2014， Systematic review of the use of dried blood spots for monitoring HIV viral lo曰d 曰nd for e曰rly inf曰nt di曰gnosis, PLoS ONE.9(3): e86461; Bert曰gnolio, S., N.T.Parkin, M. Jordan, J. Brooks, J.G.Garcia-Lerma, 2010; Dried blood spots for HIV-1 Drug Resistance and Viral Load Testing: A Review of Current Knowledge and WHO Efforts for Global HIV Drug Resistance Surveillance, AIDS Rev. 12:195-208; Johannessen, A, 2010; Dried blood spots in HIV monitoring: applications in resource-limited settings, Bioanalysis.2(11):1893-1908)cRoche Molecular Diagnostics(RMD)于2009年開發(fā)了一款僅研究使用（RUO)的產(chǎn)品，其使用實時 PCR C0BAS? AmpliPr邱/C0BAS? TaqMan? (CAP/CTM) HIV-1 測試 v2.0和干燥液斑法 (DFSP) W測量DBS中的HIV病毒載量。遺憾的是，當(dāng)測試成對的血漿和DBS樣品時，相比血漿 金標(biāo)準(zhǔn)，DFSP測試得到了更高的病毒載量滴度。運一過高估計在具有血漿病毒載量小于5， 000份拷貝/mL的樣品中尤為明顯，據(jù)推測是由于檢測到了與細(xì)胞結(jié)合的HIV DNA和RNA。
[0004] 根據(jù)CAP/CTM HIV-1 DFSP方法，首先將HIV DBS與離液劑-樣本預(yù)提取(S陽X)緩沖 液一起溫育，而將總核酸，包括血液流體中的HIV病毒RNA，加上其它與細(xì)胞結(jié)合的HIV DNA 和RNA(如HIV前病毒DNA)，從DBS中提取出并洗脫到SPEX緩沖液中。然后，將提取出的緩沖液 置于CAP/CTM儀器上進(jìn)行核酸純化，然后是HIV祀標(biāo)擴增和檢測。現(xiàn)行的用于HIV DBS化測 量的核酸提取方法充分裂解所有細(xì)胞并使所有蛋白質(zhì)復(fù)合物變性，使得總核酸(包括血液 流體中的無細(xì)胞HIV病毒顆粒和與細(xì)胞結(jié)合的HIV RNA和DNA)從DBS中被完全提取出。
[0005] 對DBS中HIV化的過度量化不只是Roche的DBS測定的問題，在其它市售測定（如 Abbott的HIV DBS測定）中也有觀測到。在HIV科學(xué)和醫(yī)學(xué)界，已經(jīng)推測，存在于DBS中被HIV 感染的細(xì)胞內(nèi)的HIV DNA會造成對病毒載量的過度量化，但運一過度量化現(xiàn)象的確切機制 尚不清楚或尚未得到證實(M自decins Sans Rronti紅es Access Campai即，2013)。可W通 過對RNA比對DNA更有特異性的擴增方法(例如，BioMerieux NucliSENS ?所用的NASBA方 法)來改善但非消除DBS中的過高估計。仍然存在對于解決樣品中HIV化過度量化挑戰(zhàn)的替 代方法的需求。
[0006] 發(fā)明概述 一種對于DBS中過高估計的解決方法可W是:類似于血漿樣品，從樣品中移除與細(xì)胞結(jié) 合的RNA和DNA，僅留下待檢測的無細(xì)胞病毒。運可W防止將患者錯誤歸類為治療失敗而造 成的高昂代價。本公開中描述了此類方法及相關(guān)益處。
[0007] 在一個實施方案中，提供了測量干血斑中無細(xì)胞核酸和/或病毒顆粒的方法。該方 法可包括W下步驟:將干血樣再水化，通過向干血樣施加緩沖溶液W產(chǎn)生再水化的干血樣； 任選地，使用固定劑將存在于再水化的干血樣中的細(xì)胞固定W將與細(xì)胞結(jié)合的RNA和/或 DNA包含在細(xì)胞內(nèi)；使用洗脫劑將無細(xì)胞核酸和/或病毒顆粒從再水化的干血樣中洗脫，所 述洗脫劑優(yōu)先地洗脫無細(xì)胞病毒顆粒而不破壞與細(xì)胞結(jié)合的RNA和/或DNA;使用過濾器將 無細(xì)胞核酸和/或病毒顆粒從可能存在于再水化的干血樣中的任何細(xì)胞碎片上分離；W及 通過病毒顆粒定量技術(shù)測量無細(xì)胞核酸和/或病毒顆粒，所述病毒顆粒定量技術(shù)選自：序列 特異性核酸定量、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、等溫核酸擴增、核酸 雜交、原位雜交和電子顯微鏡。
[0008] 在一些實施方案中，DBS中待測量的病毒顆?？蒞是人類免疫缺陷病毒(HIV)、人 類嗜T淋己細(xì)胞病毒-1或-2(HTLV-1或-2)、丙型肝炎病毒(肥V)、乙型肝炎病毒(HBV)、巨細(xì) 胞病毒(CMV)(例如，人類CMV)和化stein-Barr病毒(EBV)中的一種或多種。緩沖溶液的實施 方案可W包括固定劑和洗脫劑。固定劑的一個實施方案可W是甲醇，且洗脫劑的一個實施 方案可W是憐酸鹽緩沖鹽水或其它合適的緩沖液。在本方法的一些實施方案中，分離步驟 可包括離屯、柱過濾、真空過濾或離屯、。實施方案可包括孔徑在約0.1 μL?至約100 μηι范圍內(nèi) 的過濾器，例如，約20 μηι至約80 μηι，例如，約30 μηι至約70 μηι，例如，約40 μηι至約60 μηι。
[0009] 在另一個實施方案中，緩沖溶液包含PBS。在另外的實施方案中，緩沖溶液包含洗 脫溶液。在一個其它的實施方案中，洗脫溶液包含PBS。
[0010] 在W下的附圖和說明書中描述了本發(fā)明的一個或多個實施方案的詳細(xì)內(nèi)容。從附 圖和詳細(xì)描述W及從權(quán)利要求書中，本發(fā)明的其它特征、目標(biāo)和優(yōu)點將會是顯而易見的。
[0011] 附圖簡述 圖1示出了HIV病毒生命周期的示意圖。當(dāng)宿主細(xì)胞被HIV病毒感染后，病毒RNA基因組 通過病毒編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶被逆轉(zhuǎn)錄成cDNAdcDNA隨后被整合到宿主染色體DNA中，形成前病 毒DNA。額外的HIV病毒RNA基因組從前病毒DNA上被轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)用于組裝病毒顆 粒。成熟的HIV病毒從被感染的細(xì)胞中出芽而成為無細(xì)胞的病毒顆粒。
[0012] 圖2示出了用于測量干血斑中無細(xì)胞病毒顆粒的設(shè)置的示例性實施方案的示意 圖。首先，將在Whatman濾紙上具有DBS的HIV患者樣品放置在離屯、柱中并與固定/洗脫或提 取緩沖液一起溫育。當(dāng)從DBS中提取出病毒顆粒后，通過，例如，離屯、或真空使含有病毒的緩 沖液通過離屯、柱中的過濾器。然后，將收集到的流出緩沖液放置在CAP/CTM上用于進(jìn)一步的 樣品制備和祀標(biāo)擴增W及檢測。
[0013] 圖3示出了用于測量固定在Whatman 903濾紙上的DBS中無細(xì)胞病毒顆粒的方法的 示例性實施方案的詳細(xì)示意圖。一經(jīng)再水化和固定，大多數(shù)血細(xì)胞保持在濾紙表面并且與 細(xì)胞結(jié)合的HIV DNA和RNA被包含在被感染的細(xì)胞內(nèi)，而無細(xì)胞的病毒顆粒則擴散進(jìn)入洗脫 緩沖液中。一些血細(xì)胞(包括被HIV感染的細(xì)胞和細(xì)胞碎片)也可能從903濾紙上脫落。當(dāng)進(jìn) 行離屯、時，離屯、柱過濾器阻止細(xì)胞或細(xì)胞碎片而非被洗脫的無細(xì)胞病毒通過，并從流出溶 液中收集無細(xì)胞的HIV病毒。
[0014] 圖4示出了相對于血漿病毒載量，干血斑SPEX和PBS洗脫的分析性能。
[001引圖5示出了在使用PBS洗脫的條件下，DBS與血漿病毒載量之間的臨床相關(guān)性。應(yīng)用 了0.6 log的校正系數(shù)。
[0016]圖6示出了將DBS病毒載量方法與作為參照方法的血漿病毒載量進(jìn)行比較的偏差 圖。
[0017]圖7示出了 DB巧血漿的病毒載量ii量結(jié)果的相關(guān)性和一致性。
[001引發(fā)明詳述 盡管可W獲得可W減少與細(xì)胞結(jié)合的DNA對DBS病毒載量測量結(jié)果的影響的產(chǎn)品，但是 本文所述的方法可W同時減少與細(xì)胞結(jié)合的RNA和與細(xì)胞結(jié)合的DNA。所述方法易于操作并 且不需要復(fù)雜的儀器和生化處理。重要的是，該方法不會改變現(xiàn)有的DBS樣品采集方法，或 改變現(xiàn)有的下游方案，例如，RMD CAP/CTM HIV-1 DFSP產(chǎn)物。
[0019] 使用僅能從再水化的DBS中洗脫出無細(xì)胞的病毒顆粒(例如，無細(xì)胞的HIV病毒顆 粒)而不會破壞DBS上的細(xì)胞或細(xì)胞碎片的溶液或提取緩沖液來對DBS(例如，HIV DBS)進(jìn)行 再水化可