認(rèn)知功能障礙疾病的生物標(biāo)記物及使用該生物標(biāo)記物的認(rèn)知功能障礙疾病的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種生物標(biāo)記物W及使用該生物標(biāo)記物的認(rèn)知功能障礙疾病的檢測 方法，所述生物標(biāo)記物是能夠用于檢測包括輕度認(rèn)知障礙W及阿爾茨海默病的認(rèn)知功能障 礙疾病的新型蛋白質(zhì)W及膚。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為使用生物體呈現(xiàn)正常和非正常狀態(tài)的試樣對(duì)其差異進(jìn)行判別的手段，一般來 說，采用體外診斷藥的技術(shù)是主要的現(xiàn)有技術(shù)。
[0003] 體外診斷藥中最多的是W血液中的成分為生物標(biāo)記物進(jìn)行分析來實(shí)施診斷檢查。
[0004] 本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中，測定血液中的單獨(dú)的特定蛋白質(zhì)或分子量1萬W下的所謂 低聚膚的存在量，或在酶蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行活性測定，W正常(健康人)試樣和疾病試樣 的顯著差異來幫助診斷。
[0005] 目P，預(yù)先對(duì)來自一定數(shù)量的健康人和疾病患者的生物體試樣中的單獨(dú)或多個(gè)特定 蛋白質(zhì)或特定低聚膚的量或它們的活性量進(jìn)行計(jì)測，確定異常值和正常值的范圍。接下來， 通過同樣的方法測定要評(píng)價(jià)的生物體試樣，根據(jù)測定結(jié)果屬于該確定的異常值和正常值中 的哪一個(gè)范圍來進(jìn)行檢查評(píng)價(jià)。
[0006] 作為具體的計(jì)測方法，有將試樣直接使用或預(yù)先稀釋，使用被與基質(zhì)反應(yīng)而顯色 的酶標(biāo)記的特異性一次抗體或二次抗體，W試樣的顯色量來計(jì)測單獨(dú)或多個(gè)特定蛋白質(zhì)或 膚的量的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)巧LISA;Enzyme Linked Immmunosorbent Assay)、化學(xué)發(fā)光測 定法（化ΙΑ;化emiLuminescent Immunoassay)等。另外，還有：使用結(jié)合在一次抗體或二次 抗體上的放射性同位素，計(jì)測該特定的蛋白質(zhì)或膚的量的放射性免疫測定法（RIA; Radioimmunoassay),在蛋白質(zhì)為酶的情況下直接給予基質(zhì)通過顯色等計(jì)測產(chǎn)物的酶活性 測定法等。
[0007] 另外，還有通過高效液相色譜化PLC)分析酶的基質(zhì)分解產(chǎn)物的方法。另外，還有組 合HPLC和質(zhì)譜裝置的LC-MS/MS法W及使用它的選擇反應(yīng)監(jiān)測（selected reaction monitoring，SRM)/多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)法。
[000引另外，還有如下方法:在對(duì)試樣實(shí)施適當(dāng)?shù)那疤幚砗?，進(jìn)行二維聚丙締酷胺凝膠電 泳(2D-PAGE)，分離蛋白質(zhì)或膚后，對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)或膚進(jìn)行銀染色、考馬斯藍(lán)染色、或者使用 對(duì)應(yīng)的抗體的免疫染色(Wes tern印跡法），測定試樣中的濃度。
[0009] 另外，有如下方法:通過柱色譜法將生物體試樣分饋，通過質(zhì)譜分析對(duì)該饋分中包 含的蛋白質(zhì)和膚進(jìn)行分析。
[0010] 另外，還有不采用柱色譜法，作為前處理使用蛋白質(zhì)忍片進(jìn)行質(zhì)譜分析的方法、作 為前處理使用磁珠實(shí)施質(zhì)譜分析的方法。
[0011] 進(jìn)而，本發(fā)明人開發(fā)出immunoMS法，即，使針對(duì)作為對(duì)象的蛋白質(zhì)或膚的抗體結(jié)合 在珠(包括磁珠)上，由此捕捉想要測定的蛋白質(zhì)或膚，然后，從珠上溶出，通過質(zhì)譜分析進(jìn) 行測定。
[0012] 另外，還報(bào)告有如下方法:為了解析完整蛋白質(zhì)，用膜蛋白酶等進(jìn)行分解后，通過 上述方法進(jìn)行至質(zhì)譜分析(參見專利文獻(xiàn)1)。
[0013] 但是，均利用完整蛋白質(zhì)的性質(zhì)，直接進(jìn)行分饋，或篩選特異性吸附的蛋白質(zhì)分 子，通過質(zhì)譜分析來解析。
[0014] 在日本，隨著近年的老齡化，W阿爾茨海默病為主的認(rèn)知功能障礙疾病也在激增。 1995年有大約130萬人，2010年達(dá)到大約280萬人，預(yù)計(jì)2020年將達(dá)到大約410萬人。據(jù)稱阿 爾茨海默病占認(rèn)知功能障礙疾病的60~90 %。本疾病不僅使患者喪失記憶，而且人格也發(fā) 生蟻?zhàn)?，?dǎo)致患者喪失社會(huì)生活能力，所W正在成為社會(huì)問題。
[0015] 日本在1999年末批準(zhǔn)了乙酷基膽堿醋酶抑制劑鹽酸多奈贓齊(donepezil)，如果 早期用藥，能夠有很高的概率"延緩"認(rèn)知功能的衰退。阿爾茨海默病中，為了提高現(xiàn)有治療 方法、未來開發(fā)出的治療藥的效果，早期診斷成為最重要課題。
[0016] 美國精神醫(yī)學(xué)會(huì)對(duì)阿爾茨海默病的主要診斷基準(zhǔn)(DSM IV)如下所述。
[0017] A.發(fā)生多方面認(rèn)知缺陷，表現(xiàn)為下述兩者：
[0018] (1)記憶受損(學(xué)習(xí)新信息的能力受損或不能回憶W前所學(xué)到的信息）；
[0019] (2)下列1項(xiàng)或更多的認(rèn)知障礙
[0020] a)失語(語言障礙）
[0021] b)失用(雖然運(yùn)動(dòng)功能沒有問題，但不能執(zhí)行動(dòng)作）
[0022] C)失認(rèn)(雖然感覺功能沒有問題，但不能認(rèn)識(shí)或識(shí)別對(duì)象）
[0023] d)執(zhí)行功能（即計(jì)劃、組織、排序、抽象能力）的障礙
[0024] B.基準(zhǔn)A(l)與A(2)中所述的認(rèn)知缺陷導(dǎo)致社交或職業(yè)功能顯著受損，并表現(xiàn)為運(yùn) 些功能比W前明顯減弱(非專利文獻(xiàn)1)。
[0025] 阿爾茨海默病(Alzheimer disease) (AD)存在各種關(guān)聯(lián)疾病。因?yàn)锳D等癡呆癥緩 慢出現(xiàn)認(rèn)知功能下降，所W存在應(yīng)稱為癡呆癥前驅(qū)狀態(tài)的狀態(tài)。將運(yùn)種狀態(tài)稱為輕度認(rèn)知 障礙(mild CO即itive impairment)(MCI)。根據(jù)美國的數(shù)據(jù)，健忘口診接診的MCI中，1年有 10~15%轉(zhuǎn)變?yōu)锳D，4年中約50%轉(zhuǎn)變?yōu)锳DdAD的前驅(qū)狀態(tài)中的絕大部分包括在健忘型MCI 中。
[0026] 根據(jù)目前的定義，MCI是雖然自稱認(rèn)知功能下降，但不影響基本日常生活的狀態(tài)。 額顛葉癡呆癥(FTD)具有認(rèn)知功能降低，并且不顧及他人感受的我行我素的行為特征，與想 要與周圍互動(dòng)的AD形成對(duì)照。FTD中包括大腦皮質(zhì)組織學(xué)上存在Pick細(xì)胞的Pick病。
[0027] Lewy小體型癡呆癥(DLB)的特征在于記憶障礙是進(jìn)行性的，并且有幻視等視覺認(rèn) 知障礙。根據(jù)臨床病情進(jìn)行診斷時(shí)，癡呆癥的10~30%為DLB，老年期的變性性癡呆癥疾病 僅次于阿爾茨海默型癡呆癥(AD)，位居第二位。組織學(xué)特征是大腦中存在Lewy小體。FTD及 DLB被認(rèn)為是癡呆癥，因?yàn)槭前V呆型，所W也被稱為癡呆型神經(jīng)疾病(非專利文獻(xiàn)1)。
[00%]廣泛用于癡呆癥診斷的檢查是通過修訂的長谷川式智力評(píng)級(jí)化DS-R)和MMSE(簡 易精神狀態(tài)檢查(Mini-Mental S化te Examination))，對(duì)受試者進(jìn)行問診，根據(jù)其結(jié)果，進(jìn) 行判斷。皿S在1991年修訂后被稱為皿S-R。
[0029]包括9項(xiàng)提問，對(duì)方向感、銘記力、計(jì)算能力、記憶?回憶W及常識(shí)進(jìn)行測試。30分 滿分，23分W下疑似癡呆癥。另外，MMSE是美國設(shè)計(jì)的用于癡呆診斷的方法，涵蓋方向感、記 憶力、計(jì)算力、語言能力、圖形能力等。30分滿分，包括11項(xiàng)提問，與HDS-R同樣，23分W下疑 似癡呆癥。兩測試的結(jié)果相當(dāng)一致。運(yùn)些問診法終歸是為了篩選而使用的，并未到達(dá)確診的 程度，皿S-R、MMSE均無法用于重癥度分類(非專利文獻(xiàn)1)。
[0030] 作為影像診斷法，有可觀察到腦萎縮.腦溝腦室擴(kuò)大等腦形態(tài)異常的CT · MRI和 可觀察到腦血流量的腦血流閃爍掃描法(SPECT)W及可觀察到氧消耗量?葡萄糖消耗量的 正電子發(fā)射型斷層法(PET)dSPECTW及PET是核醫(yī)學(xué)方法，能夠在發(fā)生形態(tài)異常前檢測出異 常(非專利文獻(xiàn)1)。但是，因?yàn)檫\(yùn)些影像診斷需要特殊的設(shè)備，所W有無法在所有醫(yī)療機(jī)構(gòu) 中進(jìn)行實(shí)施的缺點(diǎn)。另外，判斷因觀察影像的醫(yī)生而不同，缺乏客觀性。
[0031] 現(xiàn)狀是像運(yùn)樣地包括AD的癡呆癥的診斷依賴于欠缺客觀性、并且W使用昂貴的裝 置為前提的方法，無法進(jìn)行用于發(fā)現(xiàn)疾病的篩選。在此，如果能夠發(fā)現(xiàn)使用血液(包括血清、 血漿)運(yùn)樣容易得到的患者的試樣就能夠進(jìn)行客觀診斷的生物標(biāo)記物，則通過進(jìn)行篩選，即 可早期發(fā)現(xiàn)成為目前最重要課題的認(rèn)知功能障礙疾病。
[0032] 專利文獻(xiàn)1中公開了一種對(duì)上述癌癥哺乳動(dòng)物血清中的載脂蛋白A-II量的變化進(jìn) 行檢測的方法，其特征在于，將來源于同一癌癥哺乳動(dòng)物的多個(gè)血清樣品中包含的載脂蛋 白A-II的定量值在上述樣品間進(jìn)行相互比較。
[0033] 專利文獻(xiàn)2中公開了一種用于肝癌檢測的肝癌生物標(biāo)記物，是由選自包含該文獻(xiàn)2 中記載的序列號(hào)1所表示的氨基酸序列的纖維蛋白原α鏈等的至少1個(gè)蛋白質(zhì)或膚形成的。
[0034] 專利文獻(xiàn)3~5中公開了用于診斷認(rèn)知功能障礙疾病的生物標(biāo)記物。專利文獻(xiàn)5中， 公開了一種用于檢測認(rèn)知功能障礙疾病的生物標(biāo)記物，是由從含有該文獻(xiàn)5中記載的序列 號(hào)1所表示的氨基酸序列的補(bǔ)體C3、含有該文獻(xiàn)5中記載的序列號(hào)15所表示的氨基酸序列的 甲狀腺素運(yùn)載蛋白等中選擇的至少1個(gè)蛋白質(zhì)或膚、或由該蛋白質(zhì)或膚產(chǎn)生的5個(gè)W上氨基 酸殘基的膚片斷形成的。
[0035] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0036] 專利文獻(xiàn)
[0037] 專利文獻(xiàn)1:日本特開2004-333274號(hào)公報(bào)
[0038] 專利文獻(xiàn)2:日本特開2006-308533號(hào)公報(bào)
[0039] 專利文獻(xiàn)3:日本特開2010-271078號(hào)公報(bào)
[0040] 專利文獻(xiàn)4:日本特開2012-037349號(hào)公報(bào) [0041 ] 專利文獻(xiàn)5:日本特開2012-132808號(hào)公報(bào)
[0042] 非專利文獻(xiàn)
[0043] 非專利文獻(xiàn)1:中野今治、水澤英洋編輯:詳解阿爾茨海默病、2004、永井書店
[0044] 非專利文獻(xiàn)2:Ν.Be址irane等、J.Biol. Chem. Vol. 268，26279-26285，1993.
[0045] 非專利文獻(xiàn)3 :Czepiel, SA,http: //czep .net/stat/mlelr. pdf, 2010 'Maximum likelihood estimation of logistic regression models：theory and implementation.
[0046] 非專利文獻(xiàn) 4:Bowling, SR, et al.JIEM，2009,2:114-127, A logistic approximation to the cumulative normal distribution.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0047] 本發(fā)明的目的在于提供一種生物標(biāo)記物及使用該生物標(biāo)記物的認(rèn)知功能障礙疾 病的檢測方法。
[0048] 本發(fā)明人探索非認(rèn)知功能障礙受試者及認(rèn)知功能障礙疾病患者中的、存在與否及 存在量不同的蛋白質(zhì)及其部分膚。
[0049] 本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠檢測出認(rèn)知功能障礙疾病的巧中多膚。該 巧中多膚是(a)由序列號(hào)1所表示的氨基酸序列形成的來自載脂蛋白A1的膚、（b)由序列號(hào)2 所表示的氨基酸序列形成的來自甲狀腺素運(yùn)載蛋白的膚及(C)由序列號(hào)3所表示的氨基酸 序列形成的來自補(bǔ)體C3的膚。
[0050] 進(jìn)而，本發(fā)明人通過邏輯回歸分析對(duì)檢測認(rèn)知功能障礙疾病時(shí)準(zhǔn)確率高的生物標(biāo) 記物的組合進(jìn)行了解析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過將其中的上述(C)來自補(bǔ)體C3的膚和上述(b)來自甲 狀腺素運(yùn)載蛋白的膚或上述(a)來自載脂蛋白A1的膚運(yùn)巧中膚組合使用，能夠提高