專利名稱：神經(jīng)生長因子在治療有機溶劑中毒性周圍神經(jīng)病中的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)生長因子在治療有機溶劑中毒性周圍神經(jīng)病中的新用途，尤其涉及神經(jīng)生長因子在治療丙烯酰胺及正己烷中毒性周圍神經(jīng)病中的新用途。
神經(jīng)生長因子(NGF)是最早發(fā)現(xiàn)的細胞調(diào)節(jié)因子，也是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一。研究發(fā)現(xiàn)NGF有神經(jīng)營養(yǎng)作用及促進外周神經(jīng)損傷后再生的作用(Thoenen H,Barder YA.,神經(jīng)生長因子的生理學，Physiol Rev.1980；60(4):1284-1335；柳川，神經(jīng)生長因子與神經(jīng)損傷，中華神經(jīng)外科雜志.1993；9(2)；109)，對大鼠糖尿病性神經(jīng)病變有一定的治療效果(Paradji V等人，在糖尿病性神經(jīng)病變中的低血清濃度的神經(jīng)生長因子，Acta Neurol scand 1990；81(5):402-6；Hellwg HD，在實驗性糖尿病中神經(jīng)生長因子(NGF)的內(nèi)源性水平發(fā)生變化NGF可能在糖尿病性神經(jīng)病變發(fā)生中起作用，Neurosci Res 1990；26(2):258-67)。另外，NGF對實驗性抗癌藥物紫杉醇(taxol)、順鉑等中毒性神經(jīng)病，和染毒藥同時給予動物，有一定的保護作用(Apfel SC等，神經(jīng)生長因子在小鼠中預(yù)防中毒性神經(jīng)病，Ann Neurol 1991；29(1):87-90；Apfel SC等，神經(jīng)生長因子給藥抗實驗性糖尿病性感覺神經(jīng)病的保護作用，Brain Res 1994；634(1):7-12)。但對于神經(jīng)生長因子對工業(yè)毒物引起的周圍神經(jīng)病的治療作用，未見報道。
另一方面，有機溶劑中毒在日常生活中時常發(fā)生，尤其是接觸這些有機溶劑的產(chǎn)業(yè)工人中經(jīng)常發(fā)生有機溶劑中毒性神經(jīng)病。例如，丙烯酰胺在工業(yè)上用途廣泛，其聚合物或共聚物用作化學灌漿原料、土壤改良劑、纖維改性劑、粘合劑和涂料。丙烯酰胺有特異性神經(jīng)毒作用，其主要神經(jīng)毒是引起粗、長神經(jīng)纖維的遠端軸索變性。隨著染毒時間延長，可向心性擴布，特稱為“中樞-周圍遠端軸索病”。主要病變是軸索變性，可累及雪旺細胞，使髓鞘結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。與丙烯酰胺單體接觸的工人可發(fā)生丙烯酰胺中毒。臨床表現(xiàn)為四肢末稍感覺、運動及植物神經(jīng)功能呈手套樣或足襪式喪失，共濟失調(diào)、肌無力甚至麻痹，四肢末稍發(fā)涼、發(fā)紺。有時遠端關(guān)節(jié)本體感覺、震動覺喪失，但痛、溫覺不受影響。臨床上丙烯酰胺中毒通常在數(shù)月內(nèi)發(fā)生，輕度的周圍神經(jīng)病神經(jīng)功能可在數(shù)月內(nèi)恢復(fù)，但重度中毒者神經(jīng)功能不能完全恢復(fù)，后遺癥為終生四肢運動不協(xié)調(diào)、遠端無力、感覺障礙。在動物如貓、大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、猴、雞、金魚均可復(fù)制出實驗性丙烯酰胺中毒性神經(jīng)病，大多為后肢無力和運動不協(xié)調(diào)，無痛覺減退，周圍神經(jīng)病理改變主要是軸索逆行性變性、遠端粗纖維喪失。
另一種常用的有機溶劑正己烷可經(jīng)呼吸道、皮膚及胃腸道吸收。長期進入體內(nèi)過多，可造成中毒性周圍神經(jīng)病。正己烷中毒性周圍神經(jīng)病和其體內(nèi)活性代謝物己二酮引起的相同。其主要神經(jīng)毒是引起周圍神經(jīng)遠端近末稍部位軸索腫脹、髓鞘華勒氏變性。軸突內(nèi)微絲聚集導(dǎo)致軸突擴張、軸突呈現(xiàn)節(jié)段性腫脹，形成“巨軸突”，可累及雪旺細胞，使髓鞘結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。病變也可累及中樞有髓纖維。隨著染毒時間延長，可向心性擴布。與正己烷接觸的工人可發(fā)生中毒，臨床表現(xiàn)主要為周圍神經(jīng)炎。臨床上正己烷中毒恢復(fù)較慢，通常在1年以上，但重度中毒者神經(jīng)功能不能完全恢復(fù)。在大鼠、雞等動物用正己烷或其代謝物己二酮可復(fù)制出實驗性中毒性神經(jīng)病，主要為后肢無力，周圍神經(jīng)病理改變主要是微絲聚集、巨軸突形成，軸索逆行性變性。
目前，對于丙烯酰胺、正己烷等有機溶劑中毒性周圍神經(jīng)病尚無有效治療藥物，研制對有機溶劑中毒性周圍神經(jīng)病的有效治療藥物是一急待解決的課題。
本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子對中毒性周圍神經(jīng)病大鼠有明顯的減輕癥狀的作用，隨即進行深入研究，終于完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種神經(jīng)生長因子的新用途，即其在治療有機溶劑中毒性周圍神經(jīng)病中的新應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明涉及神經(jīng)生長因子在治療有機溶劑中毒性周圍神經(jīng)病中的新用途，尤其涉及神經(jīng)生長因子在治療丙烯酰胺及正己烷中毒性周圍神經(jīng)病中的新用途。
在本發(fā)明的一個實施方案中，用丙烯酰胺造成大鼠中毒性周圍神經(jīng)病模型，用NGF肌肉內(nèi)注射治療10天，實驗結(jié)果表明首先，NGF高(20μg/kg)、中(10μg/kg)、低(5μg/kg)劑量使大鼠肢體運動能力障礙程度減輕，且有劑量依賴關(guān)系，和模型對照組比較，差別均有顯著性意義。其次，以大鼠雙后足落地間距反映本體感覺與肢力，NGF治療前丙烯酰胺染毒大鼠各組和正常對照組大鼠比較，雙后足落地間距明顯增大，用NGF治療10天時，NGF高、中、低劑量組大鼠雙后足落地間距均明顯縮小，和模型對照組比較，差別均有顯著性意義。另外，以神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期反映坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度進行實驗。結(jié)果是，給藥前模型對照組神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期較正常組輕度延長，且2組比較，差別非常顯著。各用藥組在治療前與模型對照組比較，神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期無顯著差別，治療10天時，NGF各劑量組神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期縮短，且和模型對照組比較差別有顯著性。給藥前模型對照組神經(jīng)-肌肉動作電位幅度較正常組明顯降低，且2組比較，差別非常顯著。各用藥組在治療前與模型對照組比較，神經(jīng)-肌肉動作電位幅度無顯著差別，治療10天時，NGF高、中劑量組神經(jīng)-肌肉動作電位幅度明顯較模型對照組為高，且和模型對照組比較，差別均有顯著性；NGF低劑量組神經(jīng)-肌肉動作電位幅度雖有所增加，但和模型對照組比較，差別無顯著性意義。另一方面，病理學檢查結(jié)果表明，NGF高、中、低劑量組大鼠脛神經(jīng)于治療10天時取材檢查顯示，髓鞘腫脹較模型對照組大鼠明顯為輕，變性脛神經(jīng)纖維比例較模型對照組為低，形態(tài)學基本接近正常。說明NGF有逆轉(zhuǎn)神經(jīng)軸索變性、促進損傷神經(jīng)復(fù)元的作用。
以上結(jié)果證明，NGF肌肉內(nèi)注射，能改善丙烯酰胺中毒性周圍神經(jīng)病大鼠肢體運動功能，能縮短中毒性神經(jīng)病大鼠延長的神經(jīng)-肌肉電潛伏期、糾正神經(jīng)-肌肉動作電位幅度下降，逆轉(zhuǎn)神經(jīng)軸索變性，加速損傷神經(jīng)復(fù)元。
在本發(fā)明的另一實施方案中，用正己烷體內(nèi)活性代謝物己二酮灌胃制備大鼠中毒性周圍神經(jīng)病模型，用NGF肌肉內(nèi)注射治療12天，實驗結(jié)果表明首先，NGF高(20μg/kg)、中(10μg/kg)劑量使大鼠肢體運動能力障礙程度減輕，和模型對照組比較，差別均有顯著性意義；NGF低(5μg/kg)劑量雖使大鼠肢體運動能力障礙程度減輕，但和模型對照組比較，差別無顯著性意義。其次，對照組和治療各組中部分大鼠停止染毒后14天時肢體運動能力障礙程度無減輕跡象，此部分大鼠在對照組、NGF低、中、高劑量組分別為3/10、3/9、1/10、1/10例，分別占30、33.3、10、10％。另外以坐骨神經(jīng)-比目魚肌神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期反映坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度進行實驗，結(jié)果，給藥前模型對照組神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期較正常組輕度延長，且2組比較，差別非常顯著。另外，各用藥組在治療前與模型對照組比較，電位潛伏期差別無顯著意義。治療12天時，模型對照組潛伏期進一步延長，NGF各劑量組神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期較模型對照組縮短，且和模型對照組比較差別有顯著性意義。給藥前模型對照組坐骨神經(jīng)-比目魚肌神經(jīng)-肌肉動作電位幅度較正常組輕度降低，且2組比較，差別無顯著性。各用藥組在治療前與模型對照組比較，神經(jīng)-肌肉動作電位幅度無顯著差別。治療12天時，模型對照組神經(jīng)-肌肉動作電位幅度進一步降低，且和正常組比較，差別非常顯著；NGF高、中劑量組神經(jīng)-肌肉動作電位幅度明顯較模型對照組為高，且和模型對照組比較，差別均有顯著性意義；NGF低劑量組神經(jīng)-肌肉動作電位幅度雖有所增加，但和模型對照組比較，差別無顯著性意義。病理學檢查結(jié)果表明，NGF治療12天后，高、中劑量組大鼠脛神經(jīng)病理切片可見巨神經(jīng)纖維形成鼠數(shù)明顯減少，髓鞘腫脹發(fā)生率較低、表明NGF有逆轉(zhuǎn)軸索變性、促進神經(jīng)損傷恢復(fù)的作用。
以上結(jié)果證明，NGF肌肉內(nèi)注射，能改善己二酮中毒性周圍神經(jīng)病大鼠肢體運動功能，縮短神經(jīng)-肌肉電潛伏期、糾正神經(jīng)-肌肉動作電位幅度下降，逆轉(zhuǎn)神經(jīng)軸索變性，加速損傷神經(jīng)復(fù)元。
總之，本發(fā)明第一次闡明了神經(jīng)生長因子對治療有機溶劑特別是丙烯酰胺和正己烷中毒性周圍神經(jīng)病的作用，為開發(fā)治療所述疾病的臨床藥物提供了前景。
以下將以實施例詳細說明本發(fā)明。
實施例1本實施例用丙烯酰胺造成大鼠中毒性周圍神經(jīng)病模型，觀察了NGF肌注給藥后對大鼠中毒性周圍神經(jīng)病的治療作用。
材料與方法藥品小鼠頜下腺神經(jīng)生長因子(2.5smNGF)由北京圣日醫(yī)藥科技發(fā)展公司和北京正大天元生物技術(shù)有限公司提供，批號990716，含量9000 BU/支(20μg)。-30℃保存，臨用前用生理鹽水稀釋。丙烯酰胺，為Sigma產(chǎn)品，進口分裝，購自上海生化所申華生化公司，電泳級。
動物Wistar大鼠，♂♀各半，體重150-200g，購自甘肅省醫(yī)學科學研究院實驗動物中心，清潔級，合格證號醫(yī)動字第14-004，動物飼養(yǎng)室溫度20-25℃，濕度40-60％。
儀器MS302型微電腦多媒體生理記錄儀，廣東藥學院產(chǎn)品，CIAMIS8型多媒體圖象分析儀，北京航空航天大學產(chǎn)品。方法(一) 丙烯酰胺中毒性大鼠周圍神經(jīng)病動物模型的制備大鼠80只，10只為正常對照組，70只為造型組。造型組大鼠用丙烯酰胺ig，一日一次，根據(jù)體重減輕程度、大鼠全身狀態(tài)及飼料消耗量的變化調(diào)整間歇時間，以大鼠出現(xiàn)一側(cè)后肢癱瘓為造型終點。具體造型過程如下最初12天用丙烯酰胺40 mg/kg,ig，一日一次，連續(xù)4天，休2天，連續(xù)2個周期。從第13天起，根據(jù)全身狀態(tài)適當調(diào)整用藥間隔，丙烯酰胺劑量仍為40 mg/kg,ig，一日一次。于末次染毒后次日進行實驗分組，開始用NGF治療。丙烯酰胺累計劑量640mg/kg，累計染毒22天。
(二)動物分組取上述正常對照組10只大鼠及造型合格的大鼠48只，隨機分組其中正常組10只；中毒性周圍神經(jīng)病大鼠48只，隨機分為4組模型對照組12只，NGF低劑量(5μg/kg)組12只，NGF中劑量(10μg/kg)組12只，NGF高劑量(20μg/kg)組12只。
(三)給藥方法及測定時間于造型結(jié)束后次日開始肌肉內(nèi)注射NGF 1ml/kg，正常對照組及模型對照組肌注等體積生理鹽水，每天一次，共10次。以模型對照組臨床癥狀開始恢復(fù)及治療組臨床癥狀明顯改善作為治療終點，于末次給藥后次日進行電生理學測定及取材病檢。
(四)測定方法及指標雙后足落地間距測定參考Edward IM等的方法(Toxical ApplPharmacol 1977；40:589-591)。令大鼠從水平位30cm高處自由落下，測量落地時兩后足第四趾間距離，即為雙后足落地間距，此指標反映肢體本體感覺與肢體肌力。
大鼠肢體運動能力障礙程度評分大鼠后肢肌力的定量測定非常困難，目前尚無成熟的方法。本發(fā)明人根椐觀察本模型中大鼠肢體肌力的變化過程，進行了半定量測定。將后肢肌力定義為三級，將肌力減退最嚴重者定義為第三級，較正常輕度減退者定義為第一級，介于兩者之間者定義為第二級。另外隨著病情加重，相繼出現(xiàn)足外翻、前肢無力、后肢回縮能力喪失，后肢靠軀干牽拉被動前移(拖拉腿)、步態(tài)異常(蛙式步態(tài))均相應(yīng)給與加分。此指標變化與雙后足落地間距、生物電測定、病檢結(jié)果一致，說明本指標在本模型中確可反映肢體運動能力障礙程度。
1)后肢肌力1級輕度減退有以下之一表現(xiàn)者，計1分。重復(fù)出現(xiàn)者只計分一次。
①從鼠尾向后拉動時，后肢完全背伸，停留片刻后自動收回。
②表現(xiàn)為一側(cè)后肢肌力輕度減退，鼠軀體向同側(cè)推進式旋轉(zhuǎn)。
③表現(xiàn)為一側(cè)后肢回縮輕度遲緩。
3級重度減退有下述之一表現(xiàn)者，一側(cè)計3分。
①從鼠尾向后拉動時，一側(cè)或者雙側(cè)后肢完全背伸，停留數(shù)分鐘不能收回。
②表現(xiàn)為一側(cè)后肢運動力消失，鼠軀體向同側(cè)推進式旋轉(zhuǎn)。
③后肢運動力重度減退或消失，軀體靠前肢拉動呈匍伏式前進。
④臀部無力，表現(xiàn)為后肢呈蛙式撐開，腹部緊貼地面，用疼痛刺激尾部，也不向前移動。
2級介于1-3級之間。計2分。
2)加分①拖拉腿一側(cè)腿失去主動回縮能力，靠軀干運動被動前移，一側(cè)加1分。
②足外翻，一側(cè)足外翻加1分。
③前肢癱瘓一側(cè)加1分。
④步態(tài)異常表現(xiàn)為蛙式步態(tài)，加1分。
神經(jīng)-肌肉動作電位測定測定時用乙醚吸入麻醉大鼠，背位固定。由坐骨切跡作為骨性定位標志，于坐骨切跡坐骨神經(jīng)旁1-2 mm經(jīng)皮刺入針狀刺激電極刺激坐骨神經(jīng)，在距刺激電極3.5 cm的比目魚肌肌腹部位刺入針狀并行引導(dǎo)電極記錄神經(jīng)-肌肉動作電位。無關(guān)電極置于刺激電極與記錄電極之間。用2.5倍閾電壓(0.5 V)連續(xù)方波刺激坐骨神經(jīng)近端，波寬0.1 ms，波間隔200 ms。每批實驗各組及組內(nèi)各大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)刺激參數(shù)相同。用MS302型微機型三導(dǎo)生理記錄系統(tǒng)對誘發(fā)電位進行放大、12位A/D轉(zhuǎn)換后輸入IBM 486電子計算機，用MS302型軟件對神經(jīng)-肌肉動作電位進行分析處理，測定神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期(N-M電潛伏期)反映坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。同時記錄動作電位幅度(NMAP，峰峰值)。掃描速度4000 mm/s，刺激由MS302型生理記錄系統(tǒng)內(nèi)含程控刺激器輸出。
病理學檢查電生理學測定后立即取脛神經(jīng)，10％福馬林生理鹽水溶液固定、鋨酸染色，石臘包埋，取脛神經(jīng)髁上段0.3 cm切為5μm組織切片，用顯微攝像機攝像，觀察神經(jīng)軸索病理形態(tài)學變化。用圖象分析儀(北京航空航天大學產(chǎn)品)放大400倍觀察神經(jīng)纖維變性程度。鋨酸為親脂性染料，含脂量高的髓鞘黑染而軸突不著色，故髓鞘的形態(tài)在本染色切片上極易判定(見圖5圖例)。神經(jīng)纖維變性程度可用髓鞘腫脹程度來判定。在鏡下可見神經(jīng)髓鞘向心性增厚，神經(jīng)軸突變細甚至消失，反映神經(jīng)髓鞘水腫、變性。
(五)統(tǒng)計分析計量資料用t-檢驗，等級資料用等級序值法。結(jié)果一、丙烯酰胺誘導(dǎo)的大鼠中毒性周圍神經(jīng)病模型特點造型期間各指標變化如下大鼠體重與飼料消耗量變化染毒1周時大鼠體重下降，飼料消耗量減少，2周時飼料消耗量接近正常組，體重逐漸回升。
雙后足落地間距變化染毒終了時，染毒組大鼠雙后足落地間距明顯增大，和正常組比較，差別非常顯著(表1)。
表1、染毒終了時大鼠雙后足落地間距的變化
和正常組比，***P＜0.01。#為模型對照組數(shù)據(jù)。
后肢肌力變化于造型結(jié)束時，大鼠后肢肌力明顯減退，于1-2天內(nèi)出現(xiàn)一側(cè)或兩側(cè)后肢無力動作電位變化神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期輕度延長，動作電位幅度明顯下降(表4)。
周圍神經(jīng)病理學變化模型對照組大鼠脛神經(jīng)粗軸索廣泛變性，髓鞘腫脹、變性，軸索外膜增厚，軸突變細甚至消失。二、NGF對丙烯酰胺中毒性大鼠周圍神經(jīng)病的治療作用1．對大鼠肢體運動能力障礙程度的影響結(jié)果見表2A-G。治療前各組大鼠肢體運動能力障礙程度基本一致，各用藥組和模型對照組比較，均無顯著性差別。治療3天時，模型對照組大鼠肢體運動能力障礙程度進一步惡化。治療4天時，高劑量組大鼠肢體運動能力障礙程度輕度減輕，和模型對照組比較，差別有顯著性意義。治療6天后各用藥組大鼠肢體運動能力障礙程度均較模型對照組為輕，且有劑量依賴關(guān)系，和模型對照組比較，差別均有顯著性意義。
表2A、治療前大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)表2B、NGF治療2天大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)
表2C、NGF治療4天大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)表2D、NGF治療6天大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)
表2E、NGF治療8天大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)表2F、NGF治療9天大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)
表2G、NGF治療10天大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)2．對大鼠雙后足落地間距的影響NGF治療前丙烯酰胺染毒大鼠各組和正常對照組大鼠比較，雙后足落地間距明顯增大，且差別非常顯著(表3)。用NGF治療10天時，NGF高、中劑量組大鼠雙后足落地間距均明顯縮小，和模型對照組比較，差別均有顯著性意義(表3)；NGF低劑量組大鼠雙后足落地間距雖較模型對照組為小，但和模型對照組比較，差別無顯著性(P＞0.05)。
表3．對大鼠雙后足落地間距的影響
和模型對照組比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.013．對神經(jīng)-肌肉動作電位的影響(1)對神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期的影響由于大鼠坐骨神經(jīng)較短，潛伏期過短，難以記錄神經(jīng)干動作電位，故本實驗以神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期(N-M電潛伏期)反映坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。結(jié)果，給藥前模型對照組神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期較正常組輕度延長，且2組比較，差別非常顯著。各用藥組在治療前與模型對照組比較，神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期無顯著差別，治療10天時，NGF高、中、低劑量組神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期縮短，且和模型對照組比較差別有顯著性(表4)。
(2)對神經(jīng)-肌肉動作電位幅度的影響結(jié)果，給藥前模型對照組神經(jīng)-肌肉動作電位幅度較正常組明顯降低，且2組比較，差別非常顯著。各用藥組在治療前與模型對照組比較，神經(jīng)-肌肉動作電位幅度無顯著差別，治療第10天時，NGF高、中劑量組神經(jīng)-肌肉動作電位幅度明顯較模型對照組為高，且和模型對照組比較，差別均有顯著性(表4)，NGF低劑量組神經(jīng)-肌肉動作電位幅度雖有所增加，但和模型對照組比較，差別無顯著性意義(P＞0.05)。
表4．NGF對大鼠中毒性周圍神經(jīng)病神經(jīng)．肌肉動作電位的影響
和模型對照組比，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01(多組均數(shù)t檢驗)4．病理學檢查結(jié)果和正常脛神經(jīng)纖維比較，見丙烯酰胺染毒大鼠脛神經(jīng)粗纖維變性，細纖維受累較輕，變性纖維髓鞘增厚，軸突變細甚至消失。模型對照組大鼠脛神經(jīng)粗纖維廣泛變性，髓鞘腫脹明顯。NGF高、中、低量組大鼠脛神經(jīng)取材標本病檢顯示，髓鞘腫脹較模型對照組大鼠明顯為輕，形態(tài)學基本接近正常，粗神經(jīng)纖維變性比例減小，說明NGF有逆轉(zhuǎn)神經(jīng)纖維變性、促進損傷神經(jīng)復(fù)元的作用。
實施例2本實施例用正己烷的體內(nèi)活性代謝物己二酮造成大鼠中毒性周圍神經(jīng)病模型，觀察了NGF肌注給藥后對大鼠中毒性周圍神經(jīng)病的治療作用。
現(xiàn)己證明，正己烷中毒性周圍神經(jīng)病是其在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的代謝物己二酮所致。動物實驗進一步證明外源性己二酮可產(chǎn)生與正己烷中毒相同的周圍神經(jīng)病。由于己二酮的神經(jīng)毒性是正己烷的33倍，其產(chǎn)生中毒性周圍神經(jīng)病的時間較短，通常在20天-2月內(nèi)，因此采用己二酮代替正己烷來誘發(fā)周圍神經(jīng)病是一方便可靠的方法。
本實施例所用己二酮為Fluka產(chǎn)品，用前用蒸餾水稀釋。其余實驗動物及材料同實施例1。
(一)己二酮中毒性大鼠周圍神經(jīng)病動物模型的制備大鼠70只，10只為正常對照組，60只為造型組。造型組大鼠用己二酮ig，一日一次，根據(jù)體重減輕程度、大鼠全身狀態(tài)及飼料消耗量的變化調(diào)整間歇時間，以大鼠出現(xiàn)雙后肢癱瘓為造型終點。具體造型過程如下最初12天用己二酮400 mg/kg,ig，一日一次，連續(xù)4-5天，休2天，連續(xù)2個周期。從第14天起，用己二酮600 mg/kg,ig，一日一次，連續(xù)5天，休2天后，再用400 mg/kg劑量ig，中間間以休息，最后用500 mg/kg ig 5天，于末次染毒后隔1日后進行實驗分組，開始用NGF治療。己二酮累計劑量11,900 mg/kg，累計染毒36天。
(二) 動物分組取上述正常對照組10只大鼠及造型合格的大鼠40只，隨機分組正常組10只；中毒性周圍神經(jīng)病大鼠40只，隨機分4組模型對照組10只，NGF低劑量(5μg/kg)組，10只，NGF中劑量(10μg/kg)組，10只，NGF高劑量(20μg/kg)組，10只。
(三)給藥方法及測定時間于造型結(jié)束后第3日開始肌肉內(nèi)注射NGF 1 ml/kg，正常對照組及模型對照組肌注等體積生理鹽水，每天一次，共12次。以模型對照組臨床癥狀開始恢復(fù)及治療組臨床癥狀明顯改善作為治療終點，于末次給藥后次日進行電生理學測定及取材病檢。
(四)動物飼養(yǎng)動物造型期間一律喂以普通飼料，周圍神經(jīng)病發(fā)生后，部分動物攝食困難，喂以30％全脂無糖奶粉，每次2-5ml，每天3-5次。
(五)測定方法及指標1．大鼠肢體運動能力障礙程度評分大鼠后肢肌力的定量測定非常困難，目前尚無成熟的方法。本實驗根椐觀察本模型中大鼠肢體肌力的變化過程，進行了半定量測定。大鼠后肢運動功能障礙程度分2部分，第一部分為膝關(guān)節(jié)以下肌力的變化，將膝關(guān)節(jié)以下肢力的變化定義為三級，將肌力減退最嚴重者(膝關(guān)節(jié)及其以下收縮力減退)定義為第三級，將踝關(guān)節(jié)及其以下收縮力減退定義為第二級，將后肢行動遲緩定義為第一級。第二部分隨著病情加重，相繼出現(xiàn)足外翻、后肢不能回縮到自然位，給與相應(yīng)加分(各計1分)。
己二酮誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病形成后，肢體肌力的減退順序是從后肢末稍向心性發(fā)展，依次為踝關(guān)節(jié)受累、膝關(guān)節(jié)受累、髖關(guān)節(jié)受累，時間順序依次是(1)步履遲緩后肢行走動作遲緩，足掌落地，行走時足掌緩慢抬起，如放錄象之慢鏡頭。踝關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)不著地。定義為后肢運動功能障礙1級，計1分。
(2)行走艱難后肢踝關(guān)節(jié)以下喪失運動能力，足掌喪失支撐能力，踝關(guān)節(jié)著地，膝關(guān)節(jié)懸空。定義為后肢運動功能障礙2級，計2分。
(3)跪行后肢膝關(guān)節(jié)以下完全喪失回縮力，足掌、踝關(guān)節(jié)喪失支撐能力，膝關(guān)節(jié)著地，大鼠呈跪行狀態(tài)，定義為后肢運動功能障礙3級，計3分。
(4)后肢不能縮回到自然位髖關(guān)節(jié)、腰肌、或(及)后肢膝關(guān)節(jié)以下肌肉受累嚴重而使后肢肌肉收縮力嚴重減弱或消失，后肢靠軀干拖拉移動，不能縮回到自然位置。
大鼠肢體肌力停止染毒后膝關(guān)節(jié)以下功能恢復(fù)的順序依次為(3)→(2)→(1)。后肢位置不能縮回到自然位置，時間順序無一定規(guī)律性，因此，將后肢不能縮回到自然位另行加分，計1分。
(5) 左、右足外翻各計1分。
2．神經(jīng)-肌肉動作電位測定同實施例1。
3．病理學檢查電生理學測定后立即取脛神經(jīng)，10％福馬林生理鹽水溶液固定、鋨酸染色，取脛神經(jīng)踝上段，0.3cm石蠟包埋，切為4-6μm組織切片，用顯微攝像機攝像，觀察神經(jīng)纖維病理形態(tài)學變化。用圖象分析儀(北京航空航天大學產(chǎn)品)放大400倍觀察神經(jīng)纖維變性程度。鋨酸為親脂性染料，含脂量高的髓鞘黑染而軸突不著色，故髓鞘的形態(tài)在本染色切片上極易判定。本模型主要觀察下述2種神經(jīng)纖維變性指標，計算陽性率(1)巨神經(jīng)纖維形成為微絲增生型，表現(xiàn)為軸突極度擴張，髓鞘壁變薄，形成巨神經(jīng)纖維(巨軸突)。
(2)髓鞘腫脹變性，在鏡下可見神經(jīng)髓鞘向心性增厚，神經(jīng)軸突變細甚至消失。
巨神經(jīng)纖維發(fā)生率=(形成巨神經(jīng)纖維鼠數(shù)/病檢鼠數(shù))×100％髓鞘腫脹發(fā)生率=(髓鞘腫脹鼠數(shù)/病檢鼠數(shù))×100％(六)、統(tǒng)計分析計量資料用t-檢驗，方差不齊時用較正t′值法。等級資料用等級序值法，四格表計數(shù)資料用Fisher直接概率法。結(jié)果一、己二酮誘導(dǎo)的大鼠中毒性周圍神經(jīng)病模型特點
1．一般特點造型時間36天，累計染毒劑量11,900 mg/kg。60只大鼠中有43只在2-3天范圍內(nèi)出現(xiàn)對稱性雙后肢癱瘓，占71.7％，中毒死亡9只，占15.0％，不符合周圍神經(jīng)病模型要求大鼠8只，占13.3％。停止染毒后在治療過程中NGF低劑量組大鼠死亡1只。
2．后肢肌力變化于造型結(jié)束時，大鼠雙后肢肌力明顯減退，于2-3天內(nèi)出現(xiàn)對稱性雙后肢無力，停止染毒后短時間內(nèi)肌力進一步減退，于10天左右開始自發(fā)性恢復(fù)。個別大鼠于實驗終了時后肢肌力無恢復(fù)跡象。
3．動作電位變化于造型結(jié)束時神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期輕度延長，于治療結(jié)束時，模型對照組潛伏期進一步延長。動作電位幅度于造型結(jié)束時個別大鼠輕度下降，為正常對照組的93.9％，模型對照組和正常組比較，差別無顯著性。于治療終了時，動作電位幅度進一步下降，模型對照組僅為正常組的13.6％，和正常組比較，差別非常顯著。
4．周圍神經(jīng)病理學變化于造型結(jié)束、NGF治療前脛神經(jīng)病檢顯示，己二酮中毒性周圍神經(jīng)病大鼠脛神經(jīng)纖維主要出現(xiàn)2種病理改變，脛神經(jīng)纖維廣泛變性，表現(xiàn)為軸突極度擴張，髓鞘壁變薄，形成巨神經(jīng)纖維。間或有單純髓鞘腫脹變性，在鏡下可見神經(jīng)髓鞘向心性增厚，神經(jīng)軸突變細甚至消失。
二、NGF對己二酮中毒性大鼠周圍神經(jīng)病的治療作用1．對大鼠肢體運動能力障礙程度的影響結(jié)果見表5A-J。治療前各組大鼠肢體運動能力障礙程度基本一致，各用藥組和模型對照組比較，均無顯著性差別。治療2天時，模型對照組大鼠肢體運動能力障礙程度進一步惡化。治療5天時，高劑量組大鼠肢體運動能力障礙程度輕度減輕，和模型對照組比較，差別有顯著性意義。治療6天后NGF中、高劑量組大鼠肢體運動能力障礙程度均較模型對照組為輕，和模型對照組比較，差別均有顯著性意義。NGF低劑量組大鼠在治療各時點肢體運動能力障礙程度雖較模型對照組為輕，但2組比較，差別無顯著性。對照組和治療各組中部分大鼠停止染毒后14天時肢體運動能力障礙程度無減輕跡象，此部分大鼠在對照組、NGF低、中、高劑量組分別為3/10、3/9、1/10、1/10例，分別占30、33.3、10、10％。
表5A、治療前大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)表5B、NGF治療2天大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比,*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)表5C、NGF治療4天大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)
表5D、NGF治療5天大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)表5E、NGF治療6天大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)表5F、NGF治療7天大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)
表5G、NGF治療8天大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)表5H、NGF治療9天大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)表5I、NGF治療10天大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)
表5J、NGF治療11天大鼠肢體運動能力障礙程度
和對照比，*P＞0.05,**P＜0.05,***P＜0.01(等級序值法)2．對神經(jīng)-肌肉動作電位的影響(1)對神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期的影響由于大鼠坐骨神經(jīng)較短，難以記錄神經(jīng)干動作電位，故本實驗以神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期(N-M電潛伏期)反映坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。結(jié)果，給藥前模型對照組神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期較正常組輕度延長，且2組比較，差別非常顯著。各用藥組在治療前與模型對照組比較，神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期差別無顯著性意義。治療12天時，模型對照組神經(jīng)-肌肉電潛伏期進一步延長，NGF高、中、低劑量組神經(jīng)-肌肉動作電位潛伏期較模型對照組明顯為短，且和模型對照組比較差別有顯著性意義(表6)。
(2)對神經(jīng)-肌肉動作電位幅度的影響 給藥前模型對照組神經(jīng)-肌肉動作電位幅度較正常組輕度降低，且2組比較，差別無顯著性意義。各用藥組在治療前與模型對照組比較，神經(jīng)-肌肉動作電位幅度無顯著差別。治療第12天時，模型對照組大鼠神經(jīng)-肌肉動作電位幅度進一步降低，且和正常組比較，差別非常顯著。NGF高、中劑量組神經(jīng)-肌肉動作電位幅度明顯較模型對照組為高，且和模型對照組比較，差別均有顯著性意義(表6)；NGF低劑量組神經(jīng)-肌肉動作電位幅度雖有所增加，但和模型對照組比較，差別無顯著性意義(P＞0.05)。
表6．NGF對己二酮中毒性大鼠周圍神經(jīng)病神經(jīng)-肌肉動作電位的影響
和模型對照組比，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01。
4．病理學檢查結(jié)果結(jié)果見表7，和正常脛神經(jīng)纖維比較，見己二酮染毒大鼠脛神經(jīng)纖維變性，變性纖維軸突極度擴張、髓鞘變薄，形成“巨神經(jīng)纖維”。模型對照組大鼠脛神經(jīng)纖維巨神經(jīng)纖維廣泛形成，髓鞘壁明顯變薄，同時部分神經(jīng)纖維髓鞘腫脹變性，髓鞘壁增厚、軸突變細。NGF高、中、低劑量組大鼠脛神經(jīng)取材標本顯示，巨神經(jīng)纖維形成鼠數(shù)明顯減少，且和對照組比較，高、中劑量組差別非常顯著。NGF治療各組髓鞘腫脹發(fā)生率也明顯減少，但和對照組比較，各劑量組差別均不顯著。NGF各組神經(jīng)髓鞘內(nèi)壁伸出偽足樣突起，巨神經(jīng)纖維減少或消失。
表7、己二酮誘導(dǎo)的大鼠中毒性周圍神經(jīng)病NGF治療后病檢結(jié)果
和對照比，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01(Fisher直接機率法)。
本實施例證實對己二酮中毒性大鼠周圍神經(jīng)病，肌內(nèi)注射神經(jīng)生長因子治療使神經(jīng)軸索變性逆轉(zhuǎn)，改善神經(jīng)傳導(dǎo)功能，促進神經(jīng)-肌肉動作電位的恢復(fù)，加快提高肢體運動功能。NGF的這種治療效果，對治療正己烷等工業(yè)毒物中毒性周圍神經(jīng)病有重要的臨床價值。
權(quán)利要求
1.神經(jīng)生長因子在制備治療有機溶劑中毒性周圍神經(jīng)病的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的有機溶劑為丙烯酰胺。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的有機溶劑為正己烷。
全文摘要
本發(fā)明涉及神經(jīng)生長因子在治療有機溶劑中毒性周圍神經(jīng)病中的新用途,尤其涉及神經(jīng)生長因子在治療丙烯酰胺及正己烷中毒性周圍神經(jīng)病中的新用途。
文檔編號A61P25/00GK1301570SQ9912730
公開日2001年7月4日 申請日期1999年12月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月28日
發(fā)明者沈心亮, 潘曉東, 白明綱, 翟雷 申請人:潘曉東