抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的中和性單克隆抗體11f1及其雜交瘤細(xì)胞株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地設(shè)及抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的單克隆抗體及其雜交瘤 細(xì)胞株。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NG巧是具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能的一種 神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，它對(duì)中樞及周?chē)窠?jīng)元的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、再生和功能特性的表 達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。
[0003] 研究表明，神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NG巧是一種在超敏反應(yīng)的發(fā)生和異常性疼痛的產(chǎn)生中 具有關(guān)鍵作用的遞質(zhì)。大量臨床前研究表明；阻止NGF與其受體的相互作用，即可緩解疼 痛。NGF單克隆抗體與NGF中和，阻斷NGF與其感覺(jué)神經(jīng)元上的受體的相互作用從而達(dá)到緩 解疼痛的效果。（抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子單克隆抗體Tanezumab.藥學(xué)進(jìn)展.2010, 34(1): 526.)。 有報(bào)道顯示采用神經(jīng)生長(zhǎng)因子抗體括抗劑來(lái)預(yù)防或治療手術(shù)后疼痛，包括來(lái)自手術(shù)或來(lái)自 切割性或創(chuàng)傷性傷口的疼痛。還有報(bào)道顯示抗NGF抗體用于治療各種疾病，包括哮喘、關(guān)節(jié) 炎和銀屑病化L謝爾頓.抗NGF抗體用于治療各種疾病.中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?2814992.0)。 然而，目前對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子抗體的報(bào)道多是研究多克隆抗體（趙小林，由振東.神經(jīng)生長(zhǎng) 因子抗體的制備及其應(yīng)用.中國(guó)神經(jīng)科學(xué)雜志.2004, 20 (2): 171-173.)。而多克隆抗體的 特異性差，用于免疫組化時(shí)顯色背景高，質(zhì)量不易控制，難W在臨床應(yīng)用推廣。單克隆抗體 具有特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，在臨床檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，可W在免疫組化、ELISA等多種方 法中使用。國(guó)內(nèi)外對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子單抗的研究并不常見(jiàn)。現(xiàn)已有報(bào)道得到的抗rhNGF單克 隆抗體是通過(guò)采用酸處理后的沙口氏菌菌體吸附純化的NGF(抗原：菌體1 ;5)脾內(nèi)注射， 脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG融合后篩選得到雜交瘤細(xì)胞，并對(duì)得到的抗rhNGF單克隆抗體 進(jìn)行了初步的鑒定分析（蘇逵，張亞莉，尤長(zhǎng)宣，等.抗人NGF單克隆抗體的制備及初步鑒 定.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志.2002, 18 (2) : 168)，但沒(méi)有對(duì)抗rhNGF單克隆抗體的中和活性 進(jìn)行鑒定。因此，目前還需要獲得一種特異性強(qiáng)、中和活性高的抗人NGF單克隆抗體，用于 臨床疼痛的緩解和疾病的治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 根據(jù)上述領(lǐng)域的需求，本發(fā)明提供一種抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的中和性單克隆抗體及 其雜交瘤細(xì)胞株。
[0005] 本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案如下：
[0006] 抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的中和性單克隆抗體11F1，由保藏號(hào)為CGMCCNo. 8773的雜交 瘤細(xì)胞所分泌，所述中和單克隆抗體與人神經(jīng)生長(zhǎng)因子具有中和反應(yīng)效應(yīng)，其分類(lèi)亞型為： 重鏈IgGl、輕鏈Kappa。
[0007] 分泌人神經(jīng)生長(zhǎng)因子中和性單克隆抗體11F1的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)為CGMCC No.8773。
[000引基于本領(lǐng)域?qū)τ诳谷松窠?jīng)生長(zhǎng)因子的中和抗體的研究，還請(qǐng)求保護(hù)上述抗體的W下；制藥用途：
[0009] 一種止痛藥劑，其特征在于；其藥效成分包含所述的中和性單克隆抗體11F1。
[0010] 一種抗過(guò)敏藥劑，其特征在于；其藥效成分包含所述的中和性單克隆抗體11F1。
[0011] 一種抗抗哮喘的藥劑，其特征在于；其藥效成分包含所述的中和性單克隆抗體 11F1。一種用于治療銀屑病的藥劑，其特征在于；其藥效成分包含所述的中和性單克隆抗體 llFlo
[0012] 一種鑒定抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF抗體的中和活性的方法，步驟如下：
[0013] (1)用維持培養(yǎng)基配制抗體樣品溶液，在預(yù)稀釋濃度40yg/ml的基礎(chǔ)上，進(jìn)行2 倍系列稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度，將待測(cè)樣品溶液轉(zhuǎn)移至96孔板中，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，每孔 50y1，另選擇3個(gè)孔加入不含抗體的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，每孔100y1 ;
[0014] 所述 9 個(gè)稀釋度分別為；10yg/ml、5yg/ml、2. 5yg/ml、l. 25yg/ml、0. 625yg/ ml、0. 3125yg/ml、0. 15625yg/ml、0. 078125yg/ml、0. 039063yg/ml;
[0015] (2)另用維持培養(yǎng)基配制20化g/ml的NGF蛋白溶液，將其添加至含有抗NGF抗體 樣品溶液的96孔板中，每孔50y1，陰性對(duì)照孔不添加NGF培養(yǎng)基，另選擇3個(gè)孔加入陽(yáng)性 對(duì)照溶液10化g/mlNGF，每孔100y1，然后將96孔板放置于37°C培養(yǎng)箱解育比；
[0016] 做取足量TF-1細(xì)胞培養(yǎng)物，離屯、收集TF-1細(xì)胞，PBS洗漆2次，離屯、收集的細(xì)胞 用維持培養(yǎng)基重懸，配成每1ml含5X104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中含 有NGF蛋白及抗NGF抗體的孔、陰性對(duì)照孔和陽(yáng)性對(duì)照孔中，每孔100y1 ;將96孔板置于 37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)；7化后，每孔加入MTS溶液20y1，于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)3小 時(shí)；
[0017] (4)從培養(yǎng)箱中取出96孔板，放入酶標(biāo)儀，于波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度，記錄測(cè)定 結(jié)果；
[001引 妨通過(guò)待測(cè)制品的吸光度，按照公式；抗NGF抗體孔的中和抑制率（％ )=[(陽(yáng) 性孔0D490nm平均值-陰性孔0D490nm平均值）-(抗體孔0D490nm平均值-陰性孔0D490nm平均值）]/ (陽(yáng)性孔〇D490nm平均值-陰性孔0D490nm平均值），計(jì)算每孔的中和抑制率，中 和抑制率越高，則抗NGF抗體的中和活性越強(qiáng)。
[0019] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的中和單克隆抗體能夠與人神經(jīng)生長(zhǎng) 因子特異性結(jié)合，具有中和反應(yīng)活性，因此可W作為hNGF的括抗劑。與現(xiàn)有的抗人神經(jīng)生 長(zhǎng)因子多克隆抗體相比，本發(fā)明提供的單抗特異性強(qiáng)，能夠避免交叉反應(yīng)，而且本發(fā)明提供 的單抗經(jīng)過(guò)了中和活性的鑒定，其效價(jià)高、親和力強(qiáng)、特異性好，能夠與人神經(jīng)生長(zhǎng)因子發(fā) 生明顯的中和反應(yīng)。
[0020] 本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)分泌抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其保藏 號(hào)分別為CGMCCNo. 8773。
[0021] 另一方面，本發(fā)明還提供一種鑒定抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF抗體的中和活性的方法， 所述方法為T(mén)F-1細(xì)胞增殖法。本發(fā)明首次采用TF-1細(xì)胞增殖法檢測(cè)抗NGF抗體的中和活 性，該方法可W準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)出抗NGF抗體的中和活性，其原理是；NGF依賴(lài)的TF-1細(xì) 胞在NGF蛋白存在的條件下可W促進(jìn)TF-1細(xì)胞增殖，然而在添加了 一定濃度的抗NGF抗體 后，抗NGF抗體與NGF發(fā)生中和作用，從而抑制TF-1細(xì)胞的良好生長(zhǎng)，然后通過(guò)添加MTS混 合溶劑細(xì)胞顯色，在酶標(biāo)儀上〇D490nm處測(cè)吸光度，計(jì)算每孔的中和抑制率，中和抑制率越 高，抗NGF抗體的中和活性也就越強(qiáng)。
[0022] 生物保藏信息：
[0023] 生物材料名稱(chēng)；12C11
[0024] 分類(lèi)命名：小鼠雜交瘤細(xì)胞 [002引保藏日期；2014年1月16日
[0026]保藏號(hào)：CGMCCNo. 8772
[0027] 保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、 地址；北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
[002引生物材料名稱(chēng)；11F1
[0029] 分類(lèi)命名：小鼠雜交瘤細(xì)胞
[0030] 保藏日期；2014年1月16日
[0031]保藏號(hào)：CGMCCNo. 8773
[0032] 保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、 地址；北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1.免疫后小鼠血清效價(jià)檢測(cè)結(jié)果
[0034] 圖2.抗hNGF單克隆抗體純化效果的SDS-PAGE鑒定
[0035] 圖3.抗hNGF單克隆抗體蛋白的WesternBlot結(jié)果
[0036] 圖4.抗hNGF單克隆抗體中和抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述，需要說(shuō)明的是，W下實(shí)施