一種促成骨化的生長(zhǎng)因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程醫(yī)用材料領(lǐng)域。更具體地，涉及一種促成骨化的生長(zhǎng)因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高分子生物材料由于具有良好的物理機(jī)械性能和化學(xué)穩(wěn)定性能而被廣泛應(yīng)用于人造器官、組織工程、外形整形，以及藥物控釋等領(lǐng)域。然而大多數(shù)人工合成的高分子材料如聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)和聚氨酯(PU)等，表面都是生物學(xué)惰性的，不具有生物活性和細(xì)胞組織相容性，缺乏細(xì)胞特異性識(shí)別位點(diǎn)，也缺乏高效的生物調(diào)節(jié)功能，因此與基體有更多相互作用的生物材料越來(lái)越受到研宄重視。人工合成的高分子生物材料表面改性技術(shù)既可賦予材料表面良好的細(xì)胞相容性，又可以保留材料本體的性質(zhì)如化學(xué)與降解性能、物理機(jī)械性能等不發(fā)生變化，因而被廣泛采用。
[0003]在眾多生物材料表面改性方法中，靜電層層自組裝法是一種簡(jiǎn)單而又高效的方法，具有很多優(yōu)點(diǎn):普遍性、層與層之間存在較強(qiáng)的相互作用、操作簡(jiǎn)單和對(duì)基底材料形狀、尺寸沒(méi)有嚴(yán)格要求；更重要的是該方法采用的是利用靜電力而非化學(xué)鍵將生物大分子固定在材料表面，最大限度的維持了生物大分子的活性，這對(duì)于生物材料的性能來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。目前已有研宄利用膠原-肝素層層自組裝多層膜修飾鈦表面，鈦的細(xì)胞相容性得到較好改善。因此，利用該技術(shù)進(jìn)一步探索研宄出細(xì)胞相容性和綜合性能更好的高分子生物材料，對(duì)于醫(yī)學(xué)組織工程的應(yīng)用具有重大的意義。
[0004]但是，靜電層層自組裝需要使用分別帶有正負(fù)電荷的大分子中、強(qiáng)電解質(zhì)才能實(shí)現(xiàn)多層膜的組裝，對(duì)于生物材料來(lái)說(shuō)，既滿足靜電層層自組裝條件，同時(shí)具有良好的生物相容性的分子對(duì)相對(duì)較少，因此選擇、尋找、開(kāi)發(fā)新的靜電層層自組裝分子對(duì)成為該技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有促成骨化的組織工程醫(yī)用材料的不足，目的在于通過(guò)層層自組裝法引入酪蛋白和生長(zhǎng)因子到生物材料表面，使之具有生物相容性好、促成骨分化的生物材料界面，并提供一種行之有效的生長(zhǎng)因子緩釋方式；提供一種負(fù)載功能性蛋白質(zhì)的、具有細(xì)胞相容性、促成骨分化、生長(zhǎng)因子持續(xù)緩釋作用的酪蛋白-生長(zhǎng)因子復(fù)合多層膜，為骨修復(fù)與再生材料表面生物活性化和功能化提供了一種簡(jiǎn)單、行之有效的方法。
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種促成骨化的生長(zhǎng)因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜(即酪蛋白/生長(zhǎng)因子復(fù)合多層膜)及其制備方法。
[0007]本發(fā)明另一目的是提供所述促成骨化的生長(zhǎng)因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明提供了一種可促生物礦化及成骨化的生物材料表面改性方法，是利用層層自組裝技術(shù)及生長(zhǎng)因子緩控釋技術(shù)，以酪蛋白和肝素作為負(fù)電大分子層，膠原和生長(zhǎng)因子(含肝素特異性結(jié)合位點(diǎn)，如aFGF、bFGF或BMP2、VEGF )作為正電大分子層，在生物材料表面構(gòu)建層層靜電自組裝的生物多層膜；所述生物材料為醫(yī)用聚氨酯、聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸、聚己內(nèi)酯或明膠。
[0009]該技術(shù)使用超分子靜電力而非化學(xué)鍵的方式，將生物蛋白及生長(zhǎng)因子有效地引入生物材料表面，可最大限度地保證生物蛋白及生長(zhǎng)因子的活性不受破壞，多層膜中的酪蛋白具有良好的促進(jìn)生物礦化特性，膠原可有效地提高材料表面細(xì)胞親和力，肝素特異性結(jié)合生長(zhǎng)因子，可以很好地保護(hù)生長(zhǎng)因子的活性，從而獲得適宜于成骨再生的材料界面。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性好，可通過(guò)改變組裝條件有效地調(diào)節(jié)生物蛋白、生長(zhǎng)因子的負(fù)載量，可用于植入性骨科材料(如降解骨釘、骨填充材料)表面及骨組織工程材料表面修飾，具有良好的應(yīng)用前景。
[0010]本發(fā)明還提供了一種促成骨化的生長(zhǎng)因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜，是利用層層自組裝技術(shù)及生長(zhǎng)因子緩控釋技術(shù)，以酪蛋白和肝素作為負(fù)電大分子層，膠原和生長(zhǎng)因子作為正電大分子層，在生物材料表面構(gòu)建層層靜電自組裝的生物多層膜得到；制備得到的復(fù)合多層膜為酪蛋白/肝素層和生長(zhǎng)因子/膠原層的循環(huán)。
[0011]利用層層自組裝技術(shù)構(gòu)建促成骨化的生長(zhǎng)因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜，能有效和持續(xù)地釋放生長(zhǎng)因子，并具有良好的細(xì)胞相容性和促礦化性能。其中生物材料包括但不限于常用于骨科修復(fù)中經(jīng)常采用的醫(yī)用聚氨酯、聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸、聚己內(nèi)酯、明膠等，材料表面包含氨基或可通過(guò)簡(jiǎn)單表面化學(xué)改性后帶有氨基的生物材料均適用于本發(fā)明。其中生長(zhǎng)因子包括但不限于aFGF、bFGF、BMP2或VEGF等，含有肝素特異性結(jié)合位點(diǎn)、可與肝素形成特異性生物結(jié)合的生長(zhǎng)因子均適用于本發(fā)明。
[0012]具體地，上述促成骨化的生長(zhǎng)因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜的制備方法包括如下步驟:
51.將基片表面進(jìn)行氨基化處理；
52.將表面氨基化的基片置于肝素/酪蛋白混合溶液中，浸泡5?30min，使得肝素和酪蛋白吸附到基片表面；然后移至PH值為5?12的HEPES溶液中漂洗3?5次；所述肝素/酪蛋白混合溶液中肝素的濃度為0.01?10mg/mL，酪蛋白的濃度為0.1?10mg/mL ；
53.將S2得到的完成組裝聚陰電解質(zhì)的基片置于生長(zhǎng)因子/膠原混合溶液中，浸泡5?30min，使得生長(zhǎng)因子和膠原吸附到膜表面，然后移至pH值為5?12的HEPES溶液中漂洗3?5次；所述生長(zhǎng)因子/膠原混合溶液中生長(zhǎng)因子的濃度為0.1?10mg/mL，膠原的濃度為0.1?10mg/mL ；
54.步驟S3完成后，多次循環(huán)重復(fù)步驟S2和S3(即將S3處理后的基片按照步驟S2和S3交替浸入酪蛋白/肝素溶液和生長(zhǎng)因子膠原溶液中)，即得到促成骨化的生長(zhǎng)因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜。
[0013]該制備方法將天然具有礦化能力的酪蛋白引入到材料表面，并使之穩(wěn)定和保持良好的生物活性；肝素和生長(zhǎng)因子特異性的結(jié)合，從而保護(hù)生長(zhǎng)因子的生物活性，而且可以通過(guò)改變肝素的濃度，調(diào)控肝素的負(fù)載量，從而調(diào)控生長(zhǎng)因子的負(fù)載量，得到結(jié)構(gòu)及釋放速率可控的生長(zhǎng)因子復(fù)合多層膜。
[0014]其中，步驟SI所述氨基化處理是指將基片浸泡在體積比1:9的己二胺異丙醇溶液中，37 °C胺解Ih，再用純水清洗干凈。
[0015]優(yōu)選地，步驟SI所述基片是醫(yī)用聚氨酯、聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸、聚己內(nèi)酯或明膠。
[0016]優(yōu)選地，步驟S2所述肝素/酪蛋白溶液中肝素的濃度為0.04,0.4或4mg/mL ;酪蛋白的濃度為0.2mg/mL。
[0017]優(yōu)選地，步驟S3所述生長(zhǎng)因子/膠原溶液中生長(zhǎng)因子的濃度為0.2mg/mL ;膠原的濃度為lmg/mL。
[0018]優(yōu)選地，所述aFGF/膠原溶液用乙酸調(diào)節(jié)其pH至4.8。
[0019]優(yōu)選地，步驟S2或S3所述HEPES溶液的配方為:2.383g Hepes和8.770g NaCl溶于100mL純水，加NaOH調(diào)PH 7.0。
[0020]另外，步驟S3所述生長(zhǎng)因子是細(xì)胞粘附因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子或細(xì)胞分化因子，可根據(jù)不同應(yīng)用需求而負(fù)載相應(yīng)的生長(zhǎng)因子，具有靈活性。
[0021]優(yōu)選地，步驟S3所述生長(zhǎng)因子為酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)、bFGF、BMP2或VEGF。更優(yōu)選地，所述生長(zhǎng)因子為酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)。
[0022]上述促成骨化的生長(zhǎng)因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜在作為組織工程醫(yī)用材料方面的應(yīng)用也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，是作為組織工程中骨缺損修復(fù)材料的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明涉及醫(yī)用材料的表面改性，功能性的蛋白質(zhì)負(fù)載，生長(zhǎng)因子緩釋，具體涉及利用層層自組裝技術(shù)構(gòu)建促成骨化的生長(zhǎng)因子可控緩釋體系復(fù)合多層膜的方法。選取酪蛋白和肝素作為負(fù)電大分子層，膠原和生長(zhǎng)因子為正電大分子層，很好地滿