二氧化硅納米顆粒及其用于疫苗接種的用圖
【專利說明】二氧化硅納米顆粒及其用于疫苗接種的用途
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?00980127650. X的中國專利申請的分案申請。
[0002] 本發(fā)明涉及由二氧化硅構成的超小型、單分散的納米顆粒，在其表面固定有至少 一種抗原。該納米顆?？梢杂糜诎┌Y的免疫預防或免疫治療。本發(fā)明的主題還在于將抗原 靶向到抗原呈遞細胞并用于活化免疫系統(tǒng)的方法，其中通過顆粒特性調(diào)節(jié)靶向和/或免疫 活化的效率。本發(fā)明還涉及用于哺乳動物的主動和被動免疫的方法。
[0003] 動物或人類有機體的健康尤其取決于，有機體以何種程度能夠自我防護源于周圍 環(huán)境的致病因素或者有機體以何種程度能夠識別和清除改變的自體材料。滿足這些功能的 人體或動物體的免疫系統(tǒng)能夠分為兩個功能范圍：先天性的和獲得性的免疫系統(tǒng)。先天性 免疫力是針對感染的第一道防線，并且在病原體例如造成可識別的感染前，使大多數(shù)潛在 的病原體變得無害。獲得性免疫系統(tǒng)對被稱為抗原的侵入的有機體或改變的自體材料的表 面結(jié)構做出反應。
[0004] 有兩種類型的獲得性免疫反應：體液免疫反應和細胞介導的免疫反應。在體液免 疫反應中，在體液中的已有抗體與抗原結(jié)合并導致其失活。在細胞介導的免疫反應中，T細 胞能夠主動破壞其它細胞。例如當在細胞中存在與疾病相關的蛋白時，它們在細胞內(nèi)部被 片段化地蛋白水解成肽。然后特異性細胞蛋白結(jié)合到如此產(chǎn)生的蛋白或抗原的片段上并將 其轉(zhuǎn)運到細胞表面，在該處它們被呈遞到分子的防御機制，尤其是機體的T細胞。
[0005] 將肽轉(zhuǎn)運到細胞表面并在該處呈現(xiàn)的分子被稱為主要組織相容性復合物（MHC) 蛋白。MHC蛋白的意義還在于，其允許T細胞將自身抗原區(qū)別于非自身抗原。例如在使用肽 疫苗的情況下，此類非自身肽序列的識別使得操縱免疫系統(tǒng)對抗患病細胞成為可能。
[0006] 在疫苗領域中用于呈遞蛋白源抗原或肽抗原的技術必須滿足兩個基本任務：將抗 原有效地轉(zhuǎn)運到樹突狀細胞和樹突狀細胞隨后活化以產(chǎn)生獲得性免疫應答。目前的疫苗發(fā) 展關注于分子策略，其針對例如在皮膚或肌肉中作為靶的外周樹突狀細胞。特別地，通過抗 體（該抗體對樹突狀細胞的細胞表面受體是特異性的，并且，或者與抗原融合，或者在顆粒 表面聚集），將抗原指引到其樹突細胞的特定部位。此類高要求的細胞特異性靶向的構建不 是強制性的，尤其如Fifis等人，（2004) J Immunol. 173 (5)，3148所能指出的，其通過將與 銀綴合的聚苯乙稀小球轉(zhuǎn)運到樹突狀細胞產(chǎn)生免疫應答。
[0007] 此外，在免疫學中已知的是，使用佐劑以便非特異性提高針對所給物質(zhì)的免疫應 答。在抗原產(chǎn)生特異性免疫應答期間，基本上是佐劑負責該應答的強度。為了產(chǎn)生獲得性免 疫應答，使用佐劑誘導樹突狀細胞成熟是不可缺少的。在此，樹突狀細胞成熟是分子危險信 號的結(jié)果，所述分子危險信號通過先天性免疫的信號通路產(chǎn)生，例如，Tol 1樣受體（TLRs) 或炎性細胞因子受體。例如WO 2004/108072 A2中描述了一種綴合物，其中將免疫應答修飾 的化合物，例如TLR激動劑，連接在金屬顆粒載體上，該載體還具有至少一種活性物質(zhì)。免 疫應答修飾的化合物在此理解為疫苗的佐劑，其雖然引起細胞毒性淋巴細胞強烈活化，但 卻使顆粒構建及其經(jīng)濟制備變得復雜和隨之產(chǎn)生增高的毒性風險和生理學上的運輸限制。
[0008] WO 2001/12221 Al描述了與蛋白原性抗原、細胞或細胞碎片結(jié)合的二氧化硅的固 有佐劑效應，該效應基于粗糙的棱角和不規(guī)則的形態(tài)，因此允許細胞膜的穿透和表面蛋白 的修飾。與此相反，WO 2007/030901 Al 和 Vallhov 等人，（2007) ,Nano Lett. 7 (12) ,3576 將 佐劑效應與二氧化硅顆粒的中孔度（MesoporosiGt)相關聯(lián)。獨立于基本原因 ，EP 〇 465 081 Bl已教導了一種制劑，其包含由金屬、陶瓷（例如二氧化硅）或聚合物組成的核心 部分、至少部分覆蓋該核心部分表面的包衣（該包衣包括基糖、改性的糖或寡核苷酸），和 與被包覆的核心部分保持接觸的至少一種病毒蛋白或肽。核心部分具有10-200nm的直徑， 但也可凝集成更大的顆粒，這甚至是可以期望的，因為由此出現(xiàn)儲藏效應（Depotwirkung)。 不利的是，通過這種凝集不能產(chǎn)生藥學上穩(wěn)定的懸浮液，也不能提供可無菌過濾性。
[0009] 本發(fā)明的任務在于克服現(xiàn)有技術中出現(xiàn)的缺點并開發(fā)納米顆粒，該納米顆粒具有 單分散的粒徑并使在免疫預防或免疫治療上的有效應用成為可能，特別是作為疫苗，其在 降低副作用的同時，改善治療的有效性。
[0010] 本發(fā)明任務根據(jù)獨立權利要求得以解決。從屬權利要求包含優(yōu)選的具體實施方 式。根據(jù)本發(fā)明，提供包含基質(zhì)的納米顆粒，該基質(zhì)包含超過50%的二氧化硅，其中該二氧 化硅具有至少一種表面官能團，在該表面官能團上固定有至少一種抗原，并且其中納米顆 粒具有5-50nm的粒徑。在此，如此解釋粒徑，在整個5-50nm的范圍內(nèi)不存在隨機分布，而 是在上述范圍內(nèi)選擇預定的粒徑，其標準偏差最大為15%，優(yōu)選最大為10%。在本發(fā)明的 一個【具體實施方式】中，顆粒的粒徑為10_30nm，優(yōu)選20-30nm，特別優(yōu)選13-29nm，完全特別 優(yōu)選 25nm±10%。
[0011] 令人驚奇地顯示，通過在5-50nm的狹窄粒徑范圍內(nèi)提供二氧化娃納米顆粒，抗原 靶向到抗原呈遞細胞的效率可以明顯提高。特別是，不再靶向淺表外周的樹突狀細胞，而是 靶向淋巴結(jié)中的那些樹突狀細胞。依據(jù)其粒徑和材料選擇如此構造根據(jù)本發(fā)明的納米顆 粒，使得樹突狀細胞的成熟被高效誘導。該誘導特別在補體系統(tǒng)活化下發(fā)生。鑒于靶向到 具有高樹突狀細胞密度的淋巴結(jié)和鑒于作為T細胞增生和免疫的前提條件的樹突狀細胞 成熟的途徑，根據(jù)本發(fā)明的二氧化硅納米顆粒由此展現(xiàn)了全新的可能性。值得注意的是，出 現(xiàn)了基于該納米顆粒的疫苗，該疫苗在免疫接種中無需常規(guī)不可缺少的佐劑。
[0012] 目前，僅由US 6, 086, 881可知，疫苗材料應具有大的分子量，這提高針對抗原決 定簇的概率。同樣期望的是，將疫苗材料聚集到或吸附到明礬或其它凝膠上，因為細胞表面 分子的細胞連接和刺激會通常變得更有效，以及由于緩慢的解吸附速率，抗原在較長的時 間間隔中保留在組織中。這也通過Vallhov等人，（2007)，Nano Lett. 7(12)，3576,證實， 由中孔二氧化硅構成的較大顆粒對由單核細胞衍生的人樹突狀細胞具有較大影響。此外， 在本領域中根據(jù)WO 2008/019366 A2描述了用于靶向抗原呈遞細胞的抗原-二氧化硅-綴 合物，對于該綴合物，0. 3-20 μ m的粒徑被視為是對于吞噬作用所必須的前提條件。與此相 反，本發(fā)明揭示了，恰恰是二氧化硅納米顆粒以所定義的5-50nm的狹窄粒徑范圍能夠用于 被動靶向到抗原呈遞細胞和用于補體活化。
[0013] 在本發(fā)明的意義中，"抗原呈遞細胞"理解為可以誘導將抗原呈遞到T細胞的各種 細胞，其中也包括前體細胞，其可以分化成抗原呈遞細胞并可以活化?？乖蔬f細胞包括樹 突狀細胞、朗格漢氏細胞、PBMCs、巨噬細胞、B-淋巴細胞或其它活化或修飾的細胞類型，如 上皮細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞，MHC分子在其細胞表面表達，優(yōu)選樹突狀細胞，特別優(yōu)選 淋巴結(jié)的樹突狀細胞?？乖蔬f細胞的前體包括CD34+細胞、單核細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮 細胞。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明，顆粒狀的連接基質(zhì)包含大于50%的二氧化硅。連接基質(zhì)也可以和其 它組分混合，其中在多組分體系中二氧化硅顯示最高的組分。對于其它組分的實例是金屬、 金屬衍生物、金屬氧化物、聚合物、有機硅烷、其它陶瓷或玻璃。然而，在本發(fā)明的一個實施 方案中，作為其它組分，排除聚合物。優(yōu)選的是，所述基質(zhì)包含直至至少80 %的二氧化硅，特 別優(yōu)選至少90 %。在本發(fā)明的一個完全特別優(yōu)選的【具體實施方式】中，納米顆粒包含基本上 是純的二氧化硅基質(zhì)，即其僅具有制備方法過程中預期的雜質(zhì)。在本發(fā)明最優(yōu)選的具體實 施方式中，顆粒狀的連接基質(zhì)由二氧化硅組成。
[0015] 為了制備顆粒尤其還提供了經(jīng)典的St0ber合成，其中通過在水-醇-氨堿 性介質(zhì)中水解四乙氧基硅烷（TEOS)，可以制備預定粒徑的單分散的、納米級二氧化硅 (J. Colloid Interface Sci. 1968, 26, 62)。發(fā)明人可以令人驚奇地顯示，盡管表面官能化， 但納米顆粒的穩(wěn)定性仍然保留，由此獲得不傾向于聚集的單分散顆粒。根據(jù)本發(fā)明因此優(yōu) 選納米顆粒，其根據(jù)具有以下步驟的方法制備：
[0016] (a)在含有水、至少一種增溶劑和至少一種胺或氨的介質(zhì)中水解縮聚四烷氧基硅 烷和/或有機三烷氧基硅烷，其中首先產(chǎn)生初級粒子的溶膠，并隨即通過連續(xù)地、按照終止 反應措施地控制地計量加入相應的硅烷阻止進一步成核，使獲得的納米顆粒達到在5-50nm 范圍內(nèi)的所期望的粒徑，和
[0017] (b)將抗原固定在所述納米顆粒的表面官能團上。
[0018] 如果氨是介質(zhì)的成分，則特別使用醇作為增溶劑，從而在水-醇-氨介質(zhì)中進行反 應，就此獲得高分散的顆粒，其平均粒徑的標準誤差不超過10%。目前發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)， 采用這種方法甚至實現(xiàn)具有所期望的單分散特性在50nm以下的粒徑。該方法的步驟（a) 已描述于EP 0 216 278 BI和WO 2005/085135 Al中，因此這些文獻以其整體被引入本申 請公開中作為參考。優(yōu)選在介質(zhì)中使用至少一種胺。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒的二氧化硅基質(zhì)既可以是有孔的也可以是無孔的?？锥然?本上取決于制備方法。參見根據(jù)EP 0 216 278 Bl的合成特別得到無孔的顆粒。在5-50nm 的起始范圍內(nèi)，對于無孔納米顆粒優(yōu)選的粒徑為l〇-30nm，而對于有孔顆粒優(yōu)選的粒徑為 10-40nm。本發(fā)明的優(yōu)選顆粒是固體。
[0020] 在本發(fā)明中，"納米顆粒"被理解為在其表面上具有官能團的顆粒狀的連接基質(zhì)， 其對于最終待連接的或待吸附的抗原作用為識別部位。所述表面在此包括所有的面，即除 了外表面外，還有顆粒中空腔（孔）的內(nèi)面。在根據(jù)本發(fā)明的實施方案中抗原因此可以收 納于顆粒中，這以二氧化硅基質(zhì)的孔度為先決條件。
[0021] 表面官能團可以不僅由一種或多種化學基團組成，其可以是相同的或不同的，其 中所述基團或者以其特性作為接頭允許納米顆粒與抗原的特異性固定，或者形成用以固定 的非特異性的Z電勢（Zetapotential)。
[0022] 術語"固定"此處是指在表面官能團和抗原之間的各種類型的相互作用，特別是 共價或非共價連接，如共價連接、疏水/親水相互作用、范德華力、離子鍵、氫鍵、配體-受 體-相互作用、核酸的堿基配對或者表位和抗體結(jié)合位點間的相互作用。
[0023] 在本發(fā)明優(yōu)選的【具體實施方式】中，抗原與納米顆粒共價連接。共價連接可以直接 或間接進行。在直接的變化形式中，將抗原直接綴合到顆粒上的化學基團上，這大多以位 點非特異性的方式發(fā)生，并可使在抗原呈遞細胞的吞噬體中的隨后釋放變得困難。在本發(fā) 明的實施方案中期望的是，排除硫醚、碳水化合物和/或寡核苷酸作為表面官能團。共價 連接的非直接方法使用接頭或標記，通過其將抗原位點特異性地連接到顆粒上，并受控地 再次釋放。位點特異性綴合的標記在本領域是已知的，如SNAP-標記、Halo-標記、C-末端 LPXTG-標記、生物素-受體-肽、PCP或ybbR-標記，并且尤其描述于WO 2008/019366 A2 中，使得這些文獻以其整體被引入到本發(fā)明的公開內(nèi)容中作為參考。該參考也適用在本申 請文獻中所有關于這些文獻的進一步提及。
[0024] 在表面官能團的優(yōu)選的【具體實施方式】中，其通過不穩(wěn)定的接頭呈現(xiàn)，特別優(yōu)選通 過腙接頭、二硫化物接頭或酶易接近的肽序列。在第一臨床候選物中，多柔比星經(jīng)酸不穩(wěn)定 的腙連接作為預期斷裂點與聚合物連接（Angew. Chem. 2006, 118,