專利名稱：：新延伸酶基因以及制備多不飽和脂肪酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有序列SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示序列的新延伸酶基因或它們的同系物、衍生物或類似物，涉及包含該基因或其同系物、衍生物和類似物地基因構(gòu)建體，并涉及其用途。本發(fā)明也涉及包含序列SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的延伸酶基因或其同系物、衍生物和類似物的載體或轉(zhuǎn)基因生物。本發(fā)明還涉及延伸酶基因序列單獨使用或與其它的延伸酶和/或其它的脂肪酸生物合成基因聯(lián)合使用的用途。本發(fā)明涉及具有序列SEQIDNO1的新延伸酶基因或其同系物、衍生物和類似物。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及制備多不飽和脂肪酸的方法，并涉及將DNA導(dǎo)入產(chǎn)生大量油類，且尤其是產(chǎn)生具有高含量不飽和脂肪酸的油類的生物體的方法。而且，本發(fā)明涉及具有較高含量多不飽和脂肪酸(具有至少兩個雙鍵)的油和/或脂肪酸制品，和/或具有較高含量多不飽和脂肪酸(具有至少兩個雙鍵)的三?；视椭破?。
背景技術(shù)：
：在細(xì)胞中天然存在的代謝過程的某些產(chǎn)物和副產(chǎn)物可用于大范圍的工業(yè)中，包括動物飼料工業(yè)、食品工業(yè)、化妝品工業(yè)和制藥工業(yè)。這些分子(統(tǒng)稱為“精細(xì)化學(xué)品”)也包括脂類和脂肪酸，其中多不飽和脂肪酸構(gòu)成了一類實例。將多不飽和脂肪酸(PUFAs)例如加至兒童的配方中，以增加配方的營養(yǎng)價值。例如PUFAs對人血液中的膽固醇水平具有積極的作用，并因此適用于抗心臟疾病的保護(hù)?？蓮膭游镌?如魚)或微生物分離精細(xì)化學(xué)品和多不飽和脂肪酸(PUFAs)。培養(yǎng)這些微生物使得一種或多種目標(biāo)分子可大量產(chǎn)生并被分離。特別適于制備PUFAs的微生物為微生物(例如破囊壺菌(Thraustochytria)或Schizochytria菌株)、藻類(例如三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)或隱甲藻類(Crypthecodinium))、纖毛蟲綱(Ciliata)(例如棘尾蟲(Stylonychia)或豆形蟲屬(Colpidium))、真菌(例如被孢霉屬(Mortierella)、蟲霉屬(Entomophthora)或毛霉菌屬(Mucor)。已通過菌株篩選開發(fā)了一些微生物的突變菌株，它們可產(chǎn)生一系列所希望的化合物，包括PUFAs。但篩選對某種分子具有提高產(chǎn)量的菌株是一個費時且艱苦的過程。同時存在的不足之處是實際上只有特定的不飽和脂肪酸，或只有特定的脂肪酸譜可由定義的微生物產(chǎn)生。作為可供選擇的方法，精細(xì)化學(xué)品適于通過植物的生產(chǎn)大規(guī)模生產(chǎn)，其中所述植物已開發(fā)為可產(chǎn)生上述PUFAs。尤其適用于該目的的植物為油料作物，其含有大量的脂類化合物，例如油料種子油菜、蕓苔、亞麻籽、大豆、向日葵、琉璃苣和月見草。但正如在本發(fā)明詳述中所提到的那樣，含有油類或脂類和脂肪酸的其它作物也很適用。常規(guī)的植物育種已導(dǎo)致了對一系列產(chǎn)生所希望的脂類和脂肪酸、輔因子和酶的突變植物的開發(fā)。但篩選對某種分子具有提高產(chǎn)量的新植物品種是一個費時且艱苦的過程，或者如果該化合物在所討論的植物中為非天然存在的話，例如當(dāng)化合物為多不飽和C20-脂肪酸和C22-脂肪酸和那些具有較長碳鏈的多不飽和脂肪酸時，篩選甚至是不可能的。發(fā)明概要本發(fā)明提供了新核酸分子，其適用于鑒定和分離PUFA生物合成的延伸酶基因，且其可用于油類、脂肪酸、脂類、脂類衍生的化合物的修飾，且最優(yōu)選地，其可用于制備多不飽和脂肪酸，因為對編碼參與不飽和脂肪酸生物合成的酶的新基因仍有大的需求，并且新基因可使這些酶以工業(yè)規(guī)模制備成為可能。具體地說，人們需要可使多不飽和脂肪酸的延伸變?yōu)榭赡艿闹舅嵘锖铣擅?，其中所述多不飽和脂肪酸?yōu)選地在分子中具有兩個或多個雙鍵。本發(fā)明的核酸編碼具有這種能力的酶。微生物(如褐指藻、豆形蟲屬、被孢霉屬、蟲霉屬、毛霉菌屬、隱甲藻類)以及其它藻類、真菌和植物，尤其是油料作物，通常用于工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)大量的精細(xì)化學(xué)品。只要克隆載體和技術(shù)可用于對上述微生物和纖毛蟲綱的遺傳操作(正如在WO98/01572和WO00/23604中所公開的)，或可用于對藻類及相關(guān)生物，如三角褐指藻的遺傳操作(描述見Falciatore等人，[1999，海洋生物技術(shù)(MarineBiotechnology)1(3)239-251]；和Dunahay等人，[1995，硅藻的遺傳轉(zhuǎn)化(Genetictransformationofdiatoms)，藻類學(xué)雜志(J.Phycol.)3110004-1012]以及它們所引用的文獻(xiàn))，那么本發(fā)明的核酸分子可用于對這些生物體進(jìn)行重組修飾，使得它們成為一種或多種精細(xì)化學(xué)品尤其是不飽和脂肪酸的更好或更有效的生產(chǎn)者。精細(xì)化學(xué)品的這種提高的生產(chǎn)率或生產(chǎn)效率可由操作本發(fā)明的基因的直接作用引起或由這種操作的間接作用引起。蘚類植物和藻類是僅知的產(chǎn)生相當(dāng)量的多不飽和脂肪酸如花生四烯酸(＝ARA)和/或二十碳五烯酸(＝EPA)和/或二十二碳六烯酸(＝DHA)的植物體系。蘚類植物在其膜脂中含有PUFAs，而藻類、藻類相關(guān)生物和一些真菌也在三?；视筒糠种蟹e聚了相當(dāng)量的PUFAs。因此，從此類也在三酰基甘油部分中積聚PUFAs的種系中分離的核酸分子尤其適用于修飾宿主的脂類和PUFA的產(chǎn)生體系，其中所述宿主尤其是為微生物(例如上述微生物)和植物(例如油料作物，如油料種子油菜、蕓苔、亞麻籽、大豆、向日葵、琉璃苣、蓖麻油植物、油棕、紅花(carthamustinctorius)、椰子、花生或可可豆)。而且，來自積聚三?；视偷奈⑸锏暮怂岱肿涌捎糜谄渌N類中此類DNA序列和酶的鑒定，其中所述此類DNA序列和酶適于修飾所討論的生物體中PUFA前體分子的生物合成。在三?；视椭蟹e聚PUFAs(如ARA、EPA或DHA)的微生物尤其為如寇氏隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii)和破囊壺菌類的微生物。就系統(tǒng)發(fā)生而言，破囊壺菌也與Schizochytria種系密切相關(guān)。即使這些生物與蘚類植物如劍葉蘚(Physcomitrella)為非密切相關(guān)，仍可觀察到DNA序列以及尤其是在多肽水平的序列相似性可達(dá)到如下程度，也就是說即使就進(jìn)化而言DNA分子來自親緣關(guān)系遠(yuǎn)的微生物，但在異源雜交實驗、序列排列和應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)的實驗中仍可鑒定、分離和功能鑒定DNA分子。尤其是可推導(dǎo)出契合序列，其適用于在第三種類中進(jìn)行異源篩選或基因功能的功能互補和預(yù)測。鑒定這些功能(例如預(yù)測酶的底物特異性)的能力因此相當(dāng)重要。而且，這些核酸分子可作為參照序列，用于繪出相關(guān)的基因組圖譜或用于推導(dǎo)出PCR引物。新核酸分子編碼本發(fā)明上下文中稱為PUFA-特異性延伸酶(＝PSEs或單數(shù)PSE)的蛋白質(zhì)。這些PSEs例如可發(fā)揮以下的作用參與脂類或脂肪酸合成所需的化合物如PUFAs的代謝(如生物合成或分解)，或參與一種或多種脂類/脂肪酸組合物轉(zhuǎn)運入細(xì)胞或轉(zhuǎn)運出細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運。該新申請較詳細(xì)顯示了此類新延伸酶基因的分離。我們首次分離了適用于產(chǎn)生長鏈多不飽和脂肪酸的延伸酶基因，其來自于在三?；视筒糠种泻吆縋UFAs的典型生物，其中所述長鏈多不飽和脂肪酸優(yōu)選脂肪酸的碳骨架具有多于18或20個碳原子和/或在碳鏈中具有至少2個雙鍵。這意味著單數(shù)時表示一種PSE基因或PSE蛋白質(zhì)，或復(fù)數(shù)時表示多種PSE基因或PSE蛋白質(zhì)。其它公知的專利申請和出版物公開了或顯示了無功能活性的PSE基因，即使存在顯示對短的或中等鏈長度的飽和脂肪酸具延伸作用(WO98/46776和US5,475,099)或延伸或產(chǎn)生長鏈脂肪酸的多個公知的專利申請，但其中脂肪酸具有的雙鍵不超過一個或會導(dǎo)致長鏈脂肪酸蠟酯的產(chǎn)生(參見WO98/54954，WO96/13582，WO95/15387)。此處呈現(xiàn)的本發(fā)明描述了對具有新特性的新延伸酶的分離。由SEQIDNO1中陳述的序列開始，可能發(fā)現(xiàn)更多編碼延伸不飽和脂肪酸的延伸酶的核酸。WO99/64616、WO98/46763、WO98/46764和WO98/46765描述了在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生PUFAs，并闡述了尤其是來自真菌的對應(yīng)的去飽和酶活性的克隆和功能表達(dá)，但沒有闡述編碼PSE的基因和功能的PSE活性。去飽和酶活性的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物中脂肪酸譜的移動，但沒有觀察到不飽和脂肪酸含量的增高。已闡述了具C18-碳鏈的三烯酸的產(chǎn)生，并要求保護(hù)γ-亞麻酸，但至今為止尚未闡述很長鏈的多不飽和脂肪酸(具有C20-和更長碳鏈并屬于三烯酸類和更高的不飽和類型)的產(chǎn)生。為制備長鏈PUFAs，必須通過延伸酶的酶活性延伸多不飽和C16-或C18-脂肪酸至少兩個碳原子。本發(fā)明的核酸序列SEQIDNO1編碼第一種植物延伸酶，其可將脂肪酸中具有至少兩個雙鍵的C16-或C18-脂肪酸延伸至少兩個碳原子。一個延伸循環(huán)后，該酶活性導(dǎo)致了C20-脂肪酸的產(chǎn)生，且在二、三和四個延伸循環(huán)后，產(chǎn)生了C22-、C24-或C26-脂肪酸。也可在公開的其它延伸酶(SEQIDNO3，SEQIDNO5，SEQIDNO7，SEQIDNO9andSEQIDNO11)的協(xié)助下合成更長鏈的PUFAs。在用于制備PUFAs的一個新方法中上述延伸酶可單獨使用、也可相加使用或例如加至來自蘚類植物展葉劍葉蘚(SEQIDNO1)的PUFA延伸酶之中使用，以增加PUFA的含量。本發(fā)明的延伸酶活性優(yōu)選地導(dǎo)致脂肪酸分子中具有至少兩個雙鍵，優(yōu)選地具有三個或四個雙鍵，尤其優(yōu)選脂肪酸分子中具有三個雙鍵的C20-脂肪酸產(chǎn)生，和/或?qū)е轮舅岱肿又芯哂兄辽賰蓚€雙鍵，優(yōu)選地具有四個、五個或六個雙鍵，尤其優(yōu)選分子中具有五個或六個雙鍵的C22-脂肪酸產(chǎn)生。在用本發(fā)明的酶延伸后，可進(jìn)行進(jìn)一步的去飽和步驟，以獲得高度不飽和的脂肪酸。因此延伸酶活性的產(chǎn)物及進(jìn)一步去飽和的產(chǎn)物可能導(dǎo)致具更高去飽和度的優(yōu)選PUFAs產(chǎn)生，例如二十二碳二烯酸、花生四烯酸、ω6-二十碳三烯雙高-γ-亞麻酸、二十碳五烯酸、ω3-二十碳三烯酸、ω3-二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。本發(fā)明的酶活性底物為例如紫杉醇酸(taxolacid)、7，10，13-十六碳三烯酸、6，9-十八碳二烯酸、亞油酸、亞麻酸，α-或γ-亞麻酸或stearidonicacid，以及花生四烯酸、二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸。優(yōu)選的底物為亞油酸、γ-亞麻酸和/或α-亞麻酸，以及花生四烯酸、二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸和二十碳五烯酸?；ㄉ南┧?、二十二碳五烯酸和二十碳五烯酸為尤其優(yōu)選的。用本發(fā)明的酶活性可延伸游離脂肪酸形式或酯形式(如磷脂、糖脂、神經(jīng)鞘脂類、磷酸甘油酯、單?；视?、二酰基甘油或三?；视?的脂肪酸分子中具有至少兩個雙鍵的C16-或C18-脂肪酸。對人類營養(yǎng)尤其重要的為共軛亞油酸“CLA”。應(yīng)明白CLA尤其是指如C1829順，11反脂肪酸或其異構(gòu)體C18210反，12順脂肪酸，它們在攝入體內(nèi)后可被人類的酶系統(tǒng)去飽和或延伸，并且可對提高健康起作用。本發(fā)明的延伸酶也可延伸分子中具有至少兩個雙鍵的那些共軛脂肪酸并因此使此類提高健康的脂肪酸可用于人類營養(yǎng)。共軛脂肪酸的其它實例為α-十八碳四烯酸、桐酸和金盞花酸(calendulicacid)。用于植物和植物轉(zhuǎn)化的特定克隆載體為在例如下列文獻(xiàn)中所公開引用的克隆載體植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)(PlantMolecularBiologyandBiotechnology)(CRCPress，BocaRaton，弗羅里達(dá))，第6/7章，71-119頁(1993)；轉(zhuǎn)基因植物(TransgenicPlants)，第1卷，設(shè)計和應(yīng)用(EngineeringandUtilization)，Kung和R.Wu編輯，AcademicPress，1993一書中的F.F.White，用于高等植物基因轉(zhuǎn)移的載體(VectorsforGeneTransferinHigherPlants)15-38；轉(zhuǎn)基因植物，第1卷，設(shè)計和應(yīng)用，Kung和R.Wu編輯，AcademicPress(1993)一書中的B.Jenes等人，用于基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)(TechniquesforGeneransfer)，128-143；Potrykus，植物生理學(xué)和植物分子生物學(xué)年鑒(Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.)42(1991)，205-225。本發(fā)明的核酸可用于對大范圍的植物進(jìn)行重組修飾，這樣使它們成為一種或多種脂類衍生產(chǎn)物如PUFAs的更好、更有效的或改良生產(chǎn)者。脂類衍生產(chǎn)物如PUFAs的這種提高的生產(chǎn)率或生產(chǎn)效率可由該操作的直接作用或由這種操作的間接作用而引起。存在一系列通過改變本發(fā)明的PSE蛋白質(zhì)而可直接影響來自油料作物或微生物的精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)量、生產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率的機制，這歸因于改性蛋白質(zhì)。可提高PSE蛋白質(zhì)或PSE基因的數(shù)量或活性，這樣可從頭產(chǎn)生較大量的這些化合物，因為在導(dǎo)入所討論的基因前生物缺乏這種活性和生物合成能力。還有，多種不同序列(即在DNA序列水平上不同的序列)的使用在此上下文中是有利的。向生物或細(xì)胞中導(dǎo)入一種PSE基因或多種PSE基因不僅可提高生物合成流向終產(chǎn)物，而且提高或從頭產(chǎn)生對應(yīng)的三?；视徒M合物。同樣，正如下述的那樣，可提高其它參與輸入一種或多種精細(xì)化學(xué)品(例如脂肪酸、極性和中性脂類)生物合成所需營養(yǎng)物質(zhì)的基因的活性數(shù)量，這樣這些前體、輔因子或中間體在細(xì)胞內(nèi)或存貯區(qū)室內(nèi)的濃度升高，從而進(jìn)一步提高了細(xì)胞產(chǎn)生PUFAs的能力。希望脂肪酸和脂類自身為精細(xì)化學(xué)品；對參與這些化合物生物合成的一種或多種PSEs的活性進(jìn)行優(yōu)化或提高它們的數(shù)量，或?qū)⑴c這些化合物分解的一種或多種PSEs的活性進(jìn)行破壞，可能使來自植物或微生物的脂肪酸分子和脂類分子的產(chǎn)量、生產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率提高。本發(fā)明PSE基因的誘變也可導(dǎo)致具有改變活性的PSE蛋白質(zhì)產(chǎn)生，后者直接或間接影響一種或多種目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)生。例如可提高本發(fā)明PSE基因的數(shù)量或活性，這樣細(xì)胞的正常代謝廢物或副產(chǎn)物(其量會因為目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的超量產(chǎn)生而增加)可在它們破壞細(xì)胞內(nèi)其它分子或加工(這可降低細(xì)胞的成活力)之前或在它們可能會妨礙精細(xì)化學(xué)品生物合成途徑(這可降低目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)量、生產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率)之前以有效方式輸出。而且，目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品自身相當(dāng)大的胞內(nèi)數(shù)量可能對細(xì)胞具有毒性，并可能妨礙酶反饋機制如變構(gòu)調(diào)節(jié)；例如由于PUFA途徑下游的其它酶或解毒酶的活性或數(shù)量提高，可提高PUFA在三酰基甘油部分中的定位；種子細(xì)胞的成活力可提高，其接下來可導(dǎo)致培養(yǎng)物中細(xì)胞的較好發(fā)育，或?qū)е庐a(chǎn)生目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的種子。另外，本發(fā)明的PSE基因可以某種方式操作，以產(chǎn)生對應(yīng)數(shù)量的多種脂類分子和脂肪酸分子。這可對細(xì)胞膜的脂類組成起決定性作用并產(chǎn)生除存在的已從頭合成的PUFAs外的新油類。由于每種脂類具有不同的物理特性，膜的脂類組成變化可基本上改變膜的流動性。膜流動性的改變會影響分子的跨膜轉(zhuǎn)運并且會影響細(xì)胞的完整性，這兩者均對精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)生有決定性的影響。而且在植物中的這些變化會影響其它特性，如對非生物和生物應(yīng)激情況的耐受性。生物和非生物應(yīng)激耐受性是一種通性，其在大范圍植物中的存在是為人們所希望的，其中所述植物例如玉米、小麥、裸麥、燕麥、黑小麥、稻米、大麥、大豆、花生、棉花、油料種子油菜和蕓苔、木薯、胡椒、向日葵和萬壽菊屬、茄科植物(如馬鈴薯、煙草、茄子和番茄)、野豌豆類、豌豆、苜蓿、灌木植物(咖啡樹、可可樹、茶樹)、柳屬、樹(油棕、椰子)和多年生草和飼料作物。作為本發(fā)明的一個進(jìn)一步的實施方案，這些作物也為優(yōu)選的用于基因工程的目標(biāo)植物。本發(fā)明非常尤其優(yōu)選的植物為油料作物例如大豆、花生、油料種子油菜、蕓苔、向日葵、紅花、樹(油棕、椰子)或作物如玉米、小麥、裸麥、燕麥、黑小麥、稻米、大麥、苜蓿，或灌木植物(咖啡樹、可可樹、茶樹)。因此，本發(fā)明一方面涉及分離的核酸分子(如cDNAs)或適于作為引物或雜交探針的核酸片段，其中所述分離的核酸分子包括編碼一種PSE或多種PSEs或其生物活性部分的核苷酸序列，其中所述引物或雜交探針用于檢測或擴增編碼PSE的核酸(如DNA或mRNA)。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，核酸分子包含SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示核苷酸序列之一，或這些核苷酸序列之一的編碼區(qū)或其互補序列。在其它尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的分離核酸分子包含這樣的核酸序列，其可與序列SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示核苷酸序列或所示序列的一部分雜交，或其與所示序列具有至少約50％，優(yōu)選地至少約60％，更優(yōu)選地至少約70％、80％或90％，且甚至更優(yōu)選地至少約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。在其它優(yōu)選的實施方案中，該分離的核酸分子編碼序列SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12中所示的氨基酸序列之一。優(yōu)選地，本發(fā)明的優(yōu)選PSE基因也具有此處所述的PSE活性之一。在一個進(jìn)一步的實施方案中，該分離的核酸分子編碼一種蛋白質(zhì)或其一部分，該蛋白質(zhì)或其一部分包含這樣的氨基酸序列，其與序列SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12中所示的氨基酸序列具有足夠的同源性，以至于該蛋白質(zhì)或其一部分保留了PSE的活性。優(yōu)選地，由該核酸分子編碼的該蛋白質(zhì)或其一部分保留了參與植物細(xì)胞膜合成所需的化合物的代謝能力或保留了參與分子通過這些膜的轉(zhuǎn)運能力。在一個實施方案中，由該核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與序列SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12中所示的氨基酸序列具有至少約50％，優(yōu)選地至少約60％且更優(yōu)選地至少約70％、80％或90％且最優(yōu)選地至少約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，該蛋白質(zhì)為全長蛋白質(zhì)，其部分與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的全長氨基酸序列基本同源，(這歸因于在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示的開放讀碼框)且其可通過技術(shù)人員用所熟悉的方法和實驗以全長形式分離出來。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該分離的核酸分子來自致病疫霉(Phytophthorainfestans)、展葉劍葉蘚(Physcomitrellapatens)、寇氏隱甲藻或破囊壺菌，且其編碼的蛋白質(zhì)(如PSE融合蛋白質(zhì))包含生物活性結(jié)構(gòu)域且還包含編碼異源多肽或調(diào)節(jié)蛋白的異源核酸序列，其中所述生物活性結(jié)構(gòu)域與序列SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12中所示的氨基酸序列具有至少約50％或更高的同源性，且其保留了參與植物細(xì)胞膜合成所需的化合物的代謝能力或保留了參與分子通過這些膜的轉(zhuǎn)運能力，或其具有至少一種導(dǎo)致PUFAs(例如ARA、EPA或DHA或它們的前體分子)形成的延伸活性，或其具有至少一種表1所列出的活性。表1以mol％表示的五株轉(zhuǎn)基因酵母的脂肪酸特性。已添加和攝入的γ-亞麻酸比例以粗體打印的數(shù)字強調(diào)，對延伸產(chǎn)物下劃線并對延伸的γ-亞麻酸用粗體打印的數(shù)字強調(diào)(最后一行)。在另一個實施方案中，該分離的核酸分子至少為15個核苷酸長，且在嚴(yán)格條件下可與包含SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的核苷酸序列的核酸分子雜交。該分離的核酸分子優(yōu)選地對應(yīng)于天然存在的核酸分子。更優(yōu)選地，該分離的核酸分子編碼天然存在的隱甲藻類、疫霉屬(Phytophthora)或破囊壺菌PSE或其生物活性部分。本發(fā)明的又一個方面涉及包含至少一種本發(fā)明的核苷酸分子的載體(如重組表達(dá)載體)及這些載體所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞尤其為微生物、植物細(xì)胞、植物組織、植物器官或整株植物。在一個實施方案中，此類宿主細(xì)胞可貯存精細(xì)化學(xué)品，尤其是PUFAs；為了分離目標(biāo)化合物，可收獲這些細(xì)胞。然后可從培養(yǎng)基或從宿主細(xì)胞分離該化合物(油類、脂類、三?；视王ァ⒅舅?或PSE，其中在為植物時所述宿主細(xì)胞為包含或貯存精細(xì)化學(xué)品的細(xì)胞，最優(yōu)選貯藏組織(如種皮、塊莖)的細(xì)胞、表皮細(xì)胞和種子細(xì)胞。本發(fā)明的另外又一個方面涉及已導(dǎo)入了PSE基因的遺傳改性植物，其中所述植物優(yōu)選上面提及的油料作物，尤其優(yōu)選油菜籽、亞麻籽或展葉劍葉蘚。在一個實施方案中，已通過導(dǎo)入(即轉(zhuǎn)基因)編碼野生型或突變PSE序列的本發(fā)明之核酸分子而改變油料種子油菜、亞麻籽或展葉劍葉蘚的基因組。在另一個實施方案中，供體生物展葉劍葉蘚、致病疫霉、隱甲藻類或破囊壺菌基因組中的內(nèi)源PSE基因例如通過用改性PSE基因同源重組或通過誘變且通過DNA序列檢測表明已被改變，也就是說內(nèi)源PSE基因功能已被破壞。在一個優(yōu)選的實施方案中，植物體屬于劍葉蘚、角齒蘚屬(Ceratodon)、葫蘆蘚屬(Funaria)、油料種子油菜或亞麻籽，其中優(yōu)選劍葉蘚、油料種子油菜或亞麻籽。在一個優(yōu)選的實施方案中，也使用劍葉蘚、油料種子油菜或亞麻籽產(chǎn)生目標(biāo)化合物如脂類或脂肪酸，其中尤其優(yōu)選PUFAs。在另外又一個優(yōu)選的實施方案中，用蘚類植物展葉劍葉蘚通過基于本發(fā)明中所述核酸的同源重組來闡述延伸酶基因的功能。本發(fā)明的另外又一個方面涉及分離的PSE基因或其一部分(如生物活性部分)。在一個優(yōu)選的實施方案中，分離的PSE基因或其一部分可參與微生物或植物細(xì)胞細(xì)胞膜合成所需的化合物的代謝，或參與分子的跨膜轉(zhuǎn)運。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，該分離的PSE或其一部分與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12中的氨基酸序列具有足夠的同源性，以使該蛋白質(zhì)或其一部分保留了參與微生物或植物細(xì)胞細(xì)胞膜合成所需化合物的代謝能力，或保留了參與分子通過這些膜的轉(zhuǎn)運能力。本發(fā)明也提供了PSE的分離制品。在優(yōu)選的實施方案中，該PSE包含SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的氨基酸序列。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及分離的全長蛋白質(zhì)，其與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的全部氨基酸序列(它們由SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示的開放讀碼框編碼)基本上同源。在一個進(jìn)一步的實施方案中，該蛋白質(zhì)與序列SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12中所示的氨基酸序列具有至少約50％，優(yōu)選地至少約60％，更優(yōu)選地至少約70％、80％或90％且最優(yōu)選地至少約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。在另一些實施方案中，該分離的PSE包含的氨基酸序列與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12中的氨基酸序列之一具有至少約50％的同源性，且該分離的PSE可參與微生物或植物細(xì)胞脂肪酸合成所需化合物的代謝，或參與分子通過這些膜的轉(zhuǎn)運，或具有一種或多種PUFA-延伸活性，該延伸有利地涉及在至少兩個位置具有雙鍵的去飽和C16-或C18-或C20-碳鏈。另外，分離的PSE可包含這樣的氨基酸序列，其由例如在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼，或者其還具有至少約50％，優(yōu)選地至少約60％，更優(yōu)選地至少約70％、80％或90％且甚至更優(yōu)選地至少約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。也優(yōu)選同樣具有此處描述的PSE活性之一的優(yōu)選PSE形式?？蓪SE多肽或其生物活性部分功能性連接至非PSE多肽以形成融合蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施方案中，該融合蛋白質(zhì)具有的活性不同于PSE單獨所具有的活性。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該融合蛋白質(zhì)參與微生物或植物中脂類和脂肪酸、輔因子和酶合成所需的化合物的代謝，或參與分子通過這些膜的轉(zhuǎn)運。在尤其優(yōu)選的實施方案中，將該融合蛋白質(zhì)導(dǎo)入宿主細(xì)胞可調(diào)節(jié)該細(xì)胞產(chǎn)生目標(biāo)化合物的量。在一個優(yōu)選的實施方案中，這些融合蛋白質(zhì)單獨或聯(lián)用時也包含Δ4-、Δ5-或Δ6-、Δ8-、Δ15-、Δ17-或Δ19-去飽和酶活性。本發(fā)明的另一方面涉及產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的方法。該方法包括培養(yǎng)含有本發(fā)明的SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的核苷酸序列或其同系物、衍生物或類似物的合適微生物或植物細(xì)胞、植物組織、植物器官或整株植物，或培養(yǎng)含有包含SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11或其同系物、衍生物或類似物的基因構(gòu)建體的合適微生物或植物細(xì)胞、植物組織、植物器官或整株植物，或培養(yǎng)含有包含這些序列或基因構(gòu)建體的、可表達(dá)本發(fā)明PSE核酸分子的載體的合適微生物或植物細(xì)胞、植物組織、植物器官或整株植物，從而產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品。在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法進(jìn)一步包括收獲含有本發(fā)明的此類延伸酶核酸序列的細(xì)胞的步驟，其中所述細(xì)胞用可表達(dá)本發(fā)明PSE核酸的延伸酶核酸序列、基因構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)物中獲得精細(xì)化學(xué)品的步驟。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，細(xì)胞屬于纖毛蟲綱、微生物(如真菌)或植物王國(尤其是油料作物)，其中尤其優(yōu)選微生物或油料作物。本發(fā)明的又一個方面涉及調(diào)節(jié)微生物分子產(chǎn)量的方法。這些方法包含將細(xì)胞與調(diào)節(jié)PSE活性或調(diào)節(jié)PSE核酸表達(dá)的物質(zhì)結(jié)合，這樣細(xì)胞相關(guān)活性相對于缺乏該物質(zhì)時的同樣活性而言是改良了的。在一個優(yōu)選的實施方案中，細(xì)胞的脂類和脂肪酸、輔因子和酶的一條代謝途徑或兩條代謝途徑被調(diào)節(jié)，或跨過這些膜的化合物的轉(zhuǎn)運被調(diào)節(jié)，從而提高了由這種微生物產(chǎn)生的目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)量或產(chǎn)率。調(diào)節(jié)PSE活性的物質(zhì)可為刺激PSE活性或刺激PSE核酸表達(dá)的物質(zhì)，或其可用作脂肪酸生物合成的中間體。刺激PSE活性或刺激PSE核酸表達(dá)的物質(zhì)的實例尤其為小分子、活性PSEs和已導(dǎo)入細(xì)胞的編碼PSEs的核酸。抑制PSE活性或PSE表達(dá)的物質(zhì)的實例尤其為小分子和/或反義PSE核酸分子。本發(fā)明的又一個方面涉及調(diào)節(jié)來自細(xì)胞的目標(biāo)化合物產(chǎn)量的方法，其包含將野生型或突變型PSE基因?qū)爰?xì)胞，其中所述野生型或突變型PSE基因可仍然存在于獨立的質(zhì)粒上或整合入宿主基因組。在整合入基因組的情況下，整合可為隨機的或以天然基因被所導(dǎo)入的拷貝取代的方式重組進(jìn)行，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生的目標(biāo)化合物量，或通過使用基因內(nèi)含子，從而使該基因功能性連接至功能表達(dá)單位，其中所述功能表達(dá)單位包含至少一個確保基因表達(dá)的序列和至少一個確保功能轉(zhuǎn)錄基因聚腺苷酸化的序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，產(chǎn)量被改變。在一個進(jìn)一步的實施方案中，目標(biāo)化學(xué)品被增加，它可能減少具有副作用的不想要的化合物。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，該目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品為脂類或脂肪酸、輔因子或酶。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，該化學(xué)品為多不飽和脂肪酸。更優(yōu)選地，它選自花生四烯酸(＝ARA)、二十碳五烯酸(＝EPA)或二十二碳六烯酸(＝DHA)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了PSE核酸和PSE蛋白質(zhì)分子，其中PSE蛋白質(zhì)分子參與蘚類植物展葉劍葉蘚、致病疫霉、隱甲藻類或破囊壺菌的脂類和脂肪酸、PUFA輔因子和酶的代謝，或其參與親脂化合物的跨膜轉(zhuǎn)運。本發(fā)明的化合物可用于調(diào)節(jié)來自生物體的精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)量，其中所述生物體例如微生物(如纖毛蟲、真菌、酵母、細(xì)菌、藻類)和/或植物(如玉米、小麥、裸麥、燕麥、黑小麥、稻米、大麥、大豆、花生、棉花、蕓苔類(如油料種子油牙、蕓苔和蕪菁油芽)、胡椒、向日葵、琉璃苣、月見草和萬壽菊屬、茄科植物(如馬鈴薯、煙草、茄子和番茄)、野豌豆類、豌豆、木薯、苜宿、灌木植物(咖啡樹、可可樹、茶樹)、柳屬、樹(油棕、椰子)和多年生草和飼料作物)，本發(fā)明的化合物可具有直接(例如當(dāng)脂肪酸生物合成蛋白質(zhì)的過表達(dá)或優(yōu)化對來自改性生物的脂肪酸產(chǎn)量、生產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率有直接影響)或間接作用，該間接作用最終導(dǎo)致目標(biāo)化合物的產(chǎn)量、生產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率提高或?qū)е虏幌胍幕衔锝档?例如當(dāng)對脂類和脂肪酸、輔因子和酶代謝的調(diào)節(jié)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)化合物的產(chǎn)量、生產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率的改變或組成改變，其本身又可影響一種或多種精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)量)。對本發(fā)明諸方面較詳細(xì)的闡述如下。I.精細(xì)化學(xué)品和PUFAs術(shù)語”精細(xì)化學(xué)品”為本領(lǐng)域公知，其包含由生物產(chǎn)生的分子且其用于多種工業(yè)中，例如(以舉例方式而非以限制性方式)制藥工業(yè)、農(nóng)業(yè)工業(yè)、食品工業(yè)和化妝品工業(yè)。這些化合物包含脂類、脂肪酸、輔因子和酶等(如在生物技術(shù)(Biotechnology)第6卷，Rehm等人，VCHWeinheim編輯一書中的Kuninaka，A.(1996)核苷酸及相關(guān)化合物(Nucleotidesandrelatedcompounds)，561-612頁及其中引用的參考文獻(xiàn)中所描述的)、脂類、飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸(如花生四烯酸)、維生素和輔因子(如Ullmann’s工業(yè)化學(xué)百科全書(Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry)，第A27卷，維生素，443-613頁(1996)VCHWeinheim，及其中引用的參考文獻(xiàn)中所描述的；以及Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)聯(lián)合國教科文組織/馬來西亞科學(xué)和技術(shù)協(xié)會及亞洲自由基研究學(xué)會聯(lián)盟的營養(yǎng)、脂類、健康和疾病”論文集(Nutrition，Lipids，HealthandDiseaseProceedingsofUNESCO/ConfederationofScientificandTechnologicalAssociationsinMalaysiaandtheSocietyforFreeRadicalResearch-Asia)，于1994年9月1-3日在馬來西亞的檳榔嶼舉辦，Press(1995))、酶和所有其它Gutcho(1983)在通過發(fā)酵的化學(xué)品(ChemicalsbyFermentation)，NoyesDataCorporation，ISBN0818805086及其中所引用的參考文獻(xiàn)中描述的化學(xué)品。對某些精細(xì)化學(xué)品的代謝和用途的較詳細(xì)闡述如下。多種前體分子和生物合成酶的結(jié)合導(dǎo)致了多種脂肪酸分子的產(chǎn)生，其中所述多種脂肪酸分子對膜的組成有決定性作用?？赏贫≒UFAs不僅只摻入三?；视?，也摻入膜脂。膜的合成是一個被充分描寫了其特性的過程，其中涉及到一些成分，包括作為雙層膜一部分的脂類。新脂肪酸如PUFAs的產(chǎn)生因此會在細(xì)胞或生物體中產(chǎn)生新的膜功能特性。在細(xì)胞中細(xì)胞膜具有多種功能。首先，膜將細(xì)胞內(nèi)含物與環(huán)境定界清楚，從而賦予細(xì)胞完整性。膜也可起到屏障作用以防止危險或不想要的化合物的流入，或防止目標(biāo)化合物的流出。涉及到膜和其相關(guān)機制的較詳細(xì)描述見Bamberg，E.等人(1993)脂雙層膜上離子泵的電荷轉(zhuǎn)運(Chargetransportofionpumpsonlipidbilayermembranes)，生物物理季刊(Q.Rev.Biophys.)261-25；在生物膜、分子結(jié)構(gòu)和功能(Biomembranes，MolecularStructureandFunction)，SpringerHeidelberg一書中的Gennis，R.B.(1989)孔道、通道和轉(zhuǎn)運蛋白(Pores，ChannelsandTransporters)，270-322頁；和Nikaido，H.，undSaier，H.(1992)細(xì)菌中的轉(zhuǎn)運蛋白它們結(jié)構(gòu)中的共同主題(Transportproteinsinbacteriacommonthemesintheirdesign)，科學(xué)(Science)258936-942，以及這些文獻(xiàn)的每一篇中的引用文獻(xiàn)。脂類合成可分為兩部分脂肪酸的合成和它們與sn-甘油-3-磷酸酯的結(jié)合，以及極性首基的添加或修飾。常用于膜的脂類包括磷脂、糖脂、神經(jīng)鞘脂類、磷酸甘油酯。脂肪酸合成起始于將乙酰輔酶A用乙酰輔酶A羧化酶轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A，或用乙酰?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為乙酰-ACP。經(jīng)過縮合反應(yīng)后，這兩個產(chǎn)物分子一起形成乙酰乙酰基-ACP，其通過一系列縮合、還原和脫水反應(yīng)轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生具所希望鏈長度的飽和脂肪酸分子。用特異的去飽和酶通過分子氧有氧催化或通過無氧催化這些分子而產(chǎn)生不飽和脂肪酸(關(guān)于微生物中脂肪酸的合成參見F.C.Neidhardt等人(1996)大腸桿菌和沙門氏菌(E.coliandSalmonella.)ASMPress華盛頓特區(qū)，612-636頁和其中所含有的參考文獻(xiàn)；Lengeler等人(編輯)(1999)原核生物生物學(xué)(BiologyofProcaryotes).Thieme斯圖加特，紐約和其中所含有的參考文獻(xiàn)，以及Magnuson，K.等人(1993)微生物學(xué)評論(MicrobiologicalReviews)57522-542和其中所含有的參考文獻(xiàn))。用于PUFA生物合成的前體的實例為亞油酸和亞麻酸。這些C18-碳脂肪酸必須延伸至C20或C22，以產(chǎn)生二十和二十二鏈型的脂肪酸。多種去飽和酶如具有Δ6-去飽和酶、Δ5-和Δ4-去飽和酶活性的酶可導(dǎo)致花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸以及多種其它長鏈PUFAs的產(chǎn)生，它們可被提取或用于食物和飼料、化妝品或藥學(xué)應(yīng)用多種目的。為產(chǎn)生長鏈PUFAs，多不飽和C16-或C18-或C20-脂肪酸必須如上所述通過延伸酶的酶活性延伸至少兩個碳原子。本發(fā)明的核酸序列編碼了第一種微生物延伸酶，后者來自三?；视筒糠种泻蠵UFA的典型生產(chǎn)者，該延伸酶可對脂肪酸中具有至少兩個雙鍵的C16-或C18-或C20-脂肪酸延伸至少兩個碳原子，或其將它們例如順序地連續(xù)轉(zhuǎn)換，將C16-或C18-脂肪酸轉(zhuǎn)換為C20-脂肪酸，然后將C20-轉(zhuǎn)換為C22-或更高的包含2C原子單元的偶數(shù)脂肪酸。在一輪延伸循環(huán)后，該酶活性導(dǎo)致C20-脂肪酸的產(chǎn)生，在兩輪、三輪和四輪延伸循環(huán)后產(chǎn)生C22-、C24-或C26-脂肪酸。也可用本發(fā)明的延伸酶合成較長的PUFAs。本發(fā)明的延伸酶活性優(yōu)選地產(chǎn)生在脂肪酸分子中具有至少兩個雙鍵的C20-和/或C22-脂肪酸，其中所述C20-脂肪酸優(yōu)選地在脂肪酸分子中具有三個、四個或五個雙鍵，尤其優(yōu)選在脂肪酸分子中具有三個雙鍵，其中所述C22-脂肪酸優(yōu)選地在脂肪酸分子中具有三個、四個、五個或六個雙鍵，尤其優(yōu)選在脂肪酸分子中具有五個或六個雙鍵。在用本發(fā)明的酶延伸后，可進(jìn)行進(jìn)一步的去飽和步驟。這樣，延伸酶活性的產(chǎn)物及進(jìn)一步去飽和的產(chǎn)物可能產(chǎn)生具有較高不飽和度的優(yōu)選PUFAs，例如二十二碳二烯酸、花生四烯酸、ω6-二十碳三烯雙高-γ-亞麻酸、二十碳五烯酸、ω3-二十碳三烯酸、ω3-二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。本發(fā)明的該酶活性底物的實例為紫杉醇酸、7，10，13-十六碳三烯酸，6，9-十八碳二烯酸，亞油酸，γ-亞麻酸、皮諾林酸、α-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸或stearidonicacid。優(yōu)選的底物為亞油酸，γ-亞麻酸和/或α-亞麻酸或花生四烯酸、二十碳四烯酸或二十碳五烯酸。在脂肪酸分子中具有至少兩個雙鍵的C16-或C18-或C20-脂肪酸可用本發(fā)明的酶活性以游離脂肪酸形式或酯的形式延伸，其中所述酯形式如磷脂、糖脂、神經(jīng)鞘脂類、磷酸甘油酯、單酰基甘油、二酰基甘油或三?；视?。此外，脂肪酸接下來必須被轉(zhuǎn)運至多個位置并摻入三酰基甘油儲存脂類。脂類合成的另一重要步驟是例如通過甘油脂肪酸酰基轉(zhuǎn)移酶將脂肪酸轉(zhuǎn)移至極性首基(參見Frentzen，1998，脂類，100(4-5)161-166)。關(guān)于植物脂肪酸生物合成、去飽和、脂類代謝和脂肪化合物的膜轉(zhuǎn)運、β-氧化、脂肪酸修飾和輔因子、三?；视蛢Υ婧脱b配的出版物(包括其中引用的參考文獻(xiàn))參見下列文章Kinney，1997，基因工程(GeneticEngineering)，JKSetlow編輯，19149-166；Ohlrogge和Browse，1995，植物細(xì)胞(PlantCell)7957-970；Shanklin和Cahoon，1998，植物生理學(xué)和植物分子生物學(xué)年鑒(Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.)49611-641；Voelker，1996，基因工程，JKSetlow編輯，18111-13；Gerhardt，1992，脂類研究進(jìn)展(Prog.LipidR.)31397-417；Gühnemann-Schfer和Kindl，1995，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(Biochim.BiophysActa)1256181-186；Kunau等人，1995，脂類研究進(jìn)展34267-342；Stymne等人，1993，植物的膜和儲存脂類的生物化學(xué)和分子生物學(xué)(BiochemistryandMolecularBiologyofMembraneandStorageLipidsofPlants)，Murata和Somerville編輯，Rockville，美國植物生理學(xué)家學(xué)會(AmericanSocietyofPlantPhysiologists)，150-158；Murphy和Ross1998，植物雜志(PlantJournal.)13(1)1-16。維生素、輔因子和“滋補藥”(如PUFAs)中包含一組高等動物不能合成且因此必須攝取的分子，或高等動物自身不能足夠合成且因此必須額外攝入的分子，即使這些分子易于被其它生物(如細(xì)菌)合成。已或多或少地對這些分子在可產(chǎn)生它們的生物(如細(xì)菌)中的生物合成特性進(jìn)行了描述(Ullmann’s工業(yè)化學(xué)百科全書，“維生素”(“Vitamins”)，第A27卷，443-613頁，VCHWeinheim，1996；Michal，G.(1999)生物化學(xué)途徑生物化學(xué)和分子生物學(xué)文集(BiochemicalPathwaysAnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology)，JohnWiley和Sons；Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)聯(lián)合國教科文組織/馬來西亞科學(xué)和技術(shù)協(xié)會及亞洲自由基研究學(xué)會聯(lián)盟“營養(yǎng)、脂類、健康和疾病”論文集，于1994年9月1-3日在馬來西亞的檳榔嶼舉辦，AOCSPress，Champaign，ILX，374頁)。上述分子或者自身為生物活性分子，或者為生物活性物質(zhì)的前體，它們在多種代謝途徑中起電子載體或者起中間體的作用。除了它們的營養(yǎng)價值外，這些化合物也有重要的工業(yè)價值如作為著色料、抗氧化劑和催化劑或其它加工輔助物(對這些化合物的結(jié)構(gòu)、活性和工業(yè)應(yīng)用的綜述參見例如Ullmann’s工業(yè)化學(xué)百科全書，“維生素”，第A27卷，443-613頁，VCHWeinheim，1996)。多不飽和脂肪酸具有多種功能，并且例如在冠心病、炎癥機制、兒童營養(yǎng)等情況下具有促進(jìn)健康的作用。對于出版物和參考文獻(xiàn)(包括其中引用的參考文獻(xiàn))參見Simopoulos，1999，美國臨床營養(yǎng)學(xué)雜志(Am.J.Clin.Nutr.)70(增刊3)560-569；Takahata等人，生物科學(xué)、生物技術(shù)與生物化學(xué)(Biosc.Biotechnol.Biochem.)1998，62(11)2079-2085，Willich和Winther，1995，DeutscheMedizinischeWochenschrift120(7)229等。II.本發(fā)明要點和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明至少部分基于對此處稱為PSE核酸和PSE蛋白質(zhì)分子的新分子的發(fā)現(xiàn)，其中所述的新分子對展葉劍葉蘚、寇氏隱甲藻、致病疫霉、破囊壺菌和/或角齒蘚(Ceratodonpurpureus)的細(xì)胞膜的產(chǎn)生有影響，并且例如對分子跨過這些膜的運動有影響。在一個實施方案中，PSE分子參與生物(如微生物和植物)細(xì)胞膜合成所需的化合物的代謝或間接影響分子跨過這些膜的轉(zhuǎn)運。在一個優(yōu)選的實施方案中，用于調(diào)節(jié)膜成分的產(chǎn)生和膜轉(zhuǎn)運的本發(fā)明PSE分子的活性對該生物體的目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)生有影響。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明PSE分子的活性被調(diào)節(jié)，從而對調(diào)節(jié)本發(fā)明PSEs的微生物或植物代謝途徑的產(chǎn)量、生產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率起調(diào)節(jié)作用并對化合物跨膜的轉(zhuǎn)運效率起調(diào)節(jié)作用，后者直接或間接調(diào)節(jié)由微生物和植物產(chǎn)生的目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)量、生產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率。術(shù)語PSE或PSE多肽包含這樣的蛋白質(zhì)，其參與生物體(如微生物和植物)細(xì)胞膜合成所需的化合物的代謝或參與分子跨過這些膜的轉(zhuǎn)運。PSEs的實例公開為SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11或它們的同系物、衍生物或類似物。術(shù)語PSE或PSE核酸序列包含編碼PSE的核酸序列，且其一部分為編碼區(qū)以及另一部分對應(yīng)于5’-和3’-非翻譯序列區(qū)。PSE基因的實例為SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示序列。術(shù)語生產(chǎn)率為本領(lǐng)域公知并包含發(fā)酵產(chǎn)物(如目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品)的濃度，其中發(fā)酵產(chǎn)物在某期間形成并以某個發(fā)酵體積表示(如kg產(chǎn)物/小時/升)。術(shù)語生產(chǎn)效率包含達(dá)到具體的產(chǎn)生量所需的時間(例如細(xì)胞建立精細(xì)化學(xué)品的特定生產(chǎn)率所需的時間)。術(shù)語產(chǎn)量或產(chǎn)物/碳產(chǎn)量為本領(lǐng)域公知且包含碳源轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(即精細(xì)化學(xué)品)的效率。它通常表達(dá)為如kg產(chǎn)物/kg碳源。提高化合物的產(chǎn)量或產(chǎn)生可提高在特定量的培養(yǎng)物中經(jīng)過所指定的階段所獲得的分子的量或所獲得的該化合物的合適分子的量。術(shù)語生物合成或生物合成途徑為本領(lǐng)域公知并包含細(xì)胞從中間體例如在強調(diào)節(jié)下以多步驟合成化合物，優(yōu)選地合成有機化合物。術(shù)語分解代謝或分解代謝途徑為本領(lǐng)域公知并包含由細(xì)胞例如在強調(diào)節(jié)下以多步驟分解化合物(優(yōu)選有機化合物)產(chǎn)生分解代謝物(通常為較小或較不復(fù)雜的分子)。術(shù)語代謝為本領(lǐng)域公知并包含在生物體內(nèi)發(fā)生的全部生物化學(xué)反應(yīng)。某個化合物的代謝(例如脂肪酸的代謝)因此包含細(xì)胞內(nèi)與該化合物相關(guān)的所有該化合物生物合成、修飾和分解代謝途徑。在另一個實施方案中，本發(fā)明的PSE分子可調(diào)節(jié)微生物或植物中目標(biāo)分子如精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)生。存在一系列這樣的機制，通過這些機制修飾本發(fā)明的PSE可直接影響含有該經(jīng)修飾蛋白質(zhì)的微生物株或植物植株中精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)量、生產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率。在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外參與精細(xì)化學(xué)品分子轉(zhuǎn)運的PSEs的數(shù)目或活性均增加，這樣較大量的這些化合物通過膜轉(zhuǎn)運，由此可獲得它們且它們相互間很容易轉(zhuǎn)換。此外，脂肪酸、三酰基甘油和/或脂類本身為所想要的精細(xì)化學(xué)品；優(yōu)化參與這些化合物生物合成的一種或多種本發(fā)明PSEs的活性或增加它們的數(shù)量，或通過干擾參與這些化合物分解代謝的一種或多種PSEs的活性可增加生物體如微生物或植物中脂肪酸分子和脂類分子的產(chǎn)量、生產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率。誘變本發(fā)明的PSE基因也可產(chǎn)生活性改變的PSEs，其間接影響微生物或植物中一種或多種目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)生。例如參與廢物輸出的本發(fā)明的PSEs可顯示較大的數(shù)量或較高的活性，這樣在正常代謝廢物(其量可因為目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的超量產(chǎn)生而增加)損害細(xì)胞內(nèi)的分子(其會降低細(xì)胞成活力)或干擾精細(xì)化學(xué)品的生物合成途徑(其會降低目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)量、生產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率)前有效輸出它們。目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品自身相對大的細(xì)胞內(nèi)含量還可對細(xì)胞有毒性，這樣增加可從細(xì)胞輸出這些化合物的轉(zhuǎn)運蛋白的活性或數(shù)量可導(dǎo)致培養(yǎng)物中細(xì)胞的成活力提高，接下來導(dǎo)致培養(yǎng)物中有更大量的產(chǎn)生目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的細(xì)胞。也可以某種方式操作本發(fā)明的PSEs，以產(chǎn)生對應(yīng)量的不同脂類分子和脂肪酸分子。這對細(xì)胞膜的脂類組成有相當(dāng)大的影響。由于每種脂類型有不同的物理特性，改變膜的脂類組成可明顯改變膜的流動性。膜流動性的改變可影響分子的跨膜轉(zhuǎn)運和細(xì)胞的完整性，其中所述每一種影響對大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)物中的微生物和植物的精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)生都有相當(dāng)大的影響。植物膜具有特異的性質(zhì)，如對高溫和低溫、鹽、干旱的耐性以及對病原體如細(xì)菌和真菌的耐性。膜成分的調(diào)變因此對植物在上述壓力參數(shù)下的存活能力具有關(guān)鍵性的作用。調(diào)變可通過信號級聯(lián)的改變或直接通過改變的膜組成(參見例如Chapman，1998，植物科學(xué)趨勢(TrendsinPlantScience)，3(11)419-426)和信號級聯(lián)(參見Wang1999，植物生理學(xué)(PlantPhysiology)，120645-651)或如在WO95/18222中所公開的影響低溫耐性而進(jìn)行。本發(fā)明分離的核酸序列存在于例如破囊壺菌菌株的基因組，其中破囊壺菌菌株可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)獲得，菌株號為ATCC26185(破囊壺菌)，或存在于例如隱甲藻類的基因組時，可從Provasoli-GuillardNationalCenterforCultureofMarinePhytoplankton((CCMP)WestBoothbayHarbour，ME，美國)獲得，株培養(yǎng)物號為No.CCMP316。在為致病疫霉時，所陳述的核酸分子分離自菌株ATCC48886。分離的劍葉蘚、隱甲藻類、致病疫霉或破囊壺菌cDNA的核苷酸序列和推斷的展葉劍葉蘚PSEs的氨基酸序列為SEQIDNO1至SEQIDNO12所示。通過進(jìn)行計算機分析來將這些核苷酸序列分類和/或鑒定為編碼下列蛋白質(zhì)的序列，它們所編碼的蛋白質(zhì)參與細(xì)胞膜成分的代謝或參與化合物通過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運或PUFA生物合成的代謝。在發(fā)明者的數(shù)據(jù)庫中具有數(shù)據(jù)庫輸入號No.PP001019019F、CC001042041R、PI001002014R、TC002034029R、TC002034029R-11和TC002014093R的ESTs構(gòu)成了在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中的本發(fā)明序列。以類似方式，部分多肽被稱為PP001019019F、CC001042041R、PI001002014R、TC002034029R、TC002034029R-11和TC002014093R并構(gòu)成表2的在SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12中的本發(fā)明序列。對ESTsTC002034029R的全片段插入物測序并得到TC002034029R的全序列SEQIDNO3。TC002034029R-11描述了來自破囊壺菌的延伸酶的全長序列。對其它克隆的命名也是相似的。也對不同的克隆賦予了對應(yīng)的基因名稱?？s寫Tc＝破囊壺菌，Cc＝隱甲藻類，Pp＝展葉劍葉蘚，Pi致病疫霉。表2本發(fā)明也涉及這樣的蛋白質(zhì)，其具有的氨基酸序列與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的氨基酸序列基本上同源。如本發(fā)明上下文中所用的，具有與一個所選擇的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列的蛋白質(zhì)與該選擇的氨基酸序列例如所選擇的全部氨基酸序列具有至少約50％的同源性。具有與一個所選擇的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列的蛋白質(zhì)與所選擇的氨基酸序列也可具有至少約50至60％，優(yōu)選地至少約60至70％，更優(yōu)選地至少約70至80％、80至90％或90至95％，且最優(yōu)選地至少約96％、97％、98％、99％或更高的同源性。本發(fā)明的PSE或其生物活性部分或其片段可參與微生物或植物細(xì)胞膜合成所需的化合物的代謝或參與分子跨過這些膜的轉(zhuǎn)運或具有延伸C16-或C18-或C20-PUFAs所需的一種或多種活性，從而獲得C20-、C22-或C24-PUFAs以及相關(guān)PUFAs。在下列子段落中較詳細(xì)描述了本發(fā)明的多個方面。A.分離的核酸分子本發(fā)明的一個實施方案包含來自產(chǎn)生PUFA的微生物的分離核酸和編碼的多肽，其中所述編碼的多肽對在脂肪酸中具有至少兩個雙鍵的C16-或C18-脂肪酸延伸至少兩個碳原子或其對在脂肪酸中具有至少兩個雙鍵的C20-脂肪酸延伸至少兩個碳原子。本發(fā)明進(jìn)一步的實施方案包含含有編碼多肽的核苷酸序列的分離核酸，其中所述多肽可延伸在脂肪酸中具有至少兩個雙鍵的C16-、C18-或C20-脂肪酸，且分離的核酸選自a)在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11所示的核酸序列，b)按照遺傳密碼的簡并性而衍生自SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示序列之一的核酸序列，或c)編碼具在SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12中所示氨基酸序列的多肽的SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示序列的衍生物，其在氨基酸水平上具至少50％的同源性并基本上不降低多肽的酶活性。作為C16-、C18-或C20-延伸酶的上述本發(fā)明的核酸來自可合成PUFAs的生物體如纖毛蟲、真菌、藻類、植物或溝鞭藻，優(yōu)選地來自植物或藻類，尤其優(yōu)選地來自疫霉屬、劍葉蘚、隱甲藻類、破囊壺菌或Schizochytrium，最優(yōu)選地來自致病疫霉、展葉劍葉蘚、寇氏隱甲藻或破囊壺菌sp.、Schizochytriumsp.或與它們緊密相關(guān)的生物體。本發(fā)明的一方面涉及編碼PSE多肽或其生物活性部分的分離核酸分子，并涉及足以用作雜交探針或引物用于鑒定或擴增編碼PSE的核酸(例如PSEDNA)的核酸片段。用在本發(fā)明上下文中的術(shù)語“核酸分子”包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)和通過核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。該術(shù)語另外包括在編碼基因區(qū)3′和5′末端的非翻譯序列在編碼區(qū)5′末端上游有至少約100個核苷酸序列和在編碼基因區(qū)3′末端下游有至少約20個核苷酸序列。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但優(yōu)選雙鏈DNA?！胺蛛x的”核酸分子為將該核酸從存在于其天然來源中的其它核酸分子分離?！胺蛛x的”核酸優(yōu)選地不具有在生物體基因組DNA中天然位于核酸側(cè)翼的序列(例如位于該核酸5’和3’末端的序列)，其中所述核酸來自該生物體。在多個實施方案中，分離的PSE核酸分子可含有在細(xì)胞基因組DNA中天然位于該核酸側(cè)翼的例如小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其中所述核酸來自該細(xì)胞(例如展葉劍葉蘚細(xì)胞)。此外，“分離的”核酸分子(如cDNA分子)如果是通過重組技術(shù)產(chǎn)生的，則可基本上不含其它細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或如果是通過化學(xué)合成的，則可基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品?？捎脴?biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)和此處提供的序列信息分離本發(fā)明的核酸分子，例如具有SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的核苷酸序列或其一部分的核酸分子。同樣，可借助于排列算法鑒定例如在DNA水平或氨基酸水平的同源序列或同源保守序列區(qū)。例如通過使用雜交探針和標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)(例如Sambrook等人，在分子克隆實驗室手冊，第二版(MolecularCloningALaboratoryManual，2ndEd.)，冷泉港實驗室，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989一書中所描述的)從疫霉屬、劍葉蘚、隱甲藻類或Thraustochtrium文庫分離疫霉屬、劍葉蘚、隱甲藻類或破囊壺菌cDNA，其中所述雜交探針為全長的SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和/或SEQIDNO11或其一部分。而且，當(dāng)使用的寡核苷酸引物是基于SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的序列或其部分而產(chǎn)生的時，尤其是基于SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12或它們各自的明確氨基酸變體的His-盒基序周圍的區(qū)域而產(chǎn)生的時，可用聚合酶鏈反應(yīng)分離包含SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的全序列或其一部分的核酸分子(例如，可用基于同樣的SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11序列產(chǎn)生的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈反應(yīng)分離包含SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的全序列或其一部分的核酸分子)。而且，尤其適用于該目的的為那些在圖10中所示的部分序列。例如可從細(xì)胞分離mRNA(例如通過Chirgwin等人，(1979)生物化學(xué)(Biochemistry)185294-5299所描述的硫氰酸胍提取法)，并且可借助于反轉(zhuǎn)錄酶(例如可用從Gibco/BRL，Bethesda，MD獲得的莫洛尼鼠類白血病病毒(MoloneyMLV)反轉(zhuǎn)錄酶或可用從SeikagakuAmerica，Inc.，St.Petersburg，F(xiàn)L獲得的AMV反轉(zhuǎn)錄酶)產(chǎn)生cDNA。用于聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴增反應(yīng)的合成寡核苷酸引物可基于SEQIDNO1、3、5、7、9或11所示的核苷酸序列之一或通過圖10中所示的氨基酸序列產(chǎn)生?？捎胏DNA或另外地用基因組DNA作為模板并用合適的寡核苷酸引物，按照標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴增技術(shù)來擴增本發(fā)明的核酸。可將這樣擴增的核酸克隆入合適的載體并通過DNA序列分析了解其特性?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)的合成方法，例如用自動DNA合成儀產(chǎn)生對應(yīng)于PSE核苷酸序列的寡核苷酸。在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示的cDNA包含編碼PSEs的序列(即“編碼區(qū)”)、5′-非翻譯序列和3′-非翻譯序列。另外核酸分子可僅包含SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11所示序列之一的編碼區(qū)，或核酸分子可包含從基因組DNA分離的全基因組片段。為便于對應(yīng)，可通過輸入與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11相同的EST數(shù)據(jù)代碼來鑒別SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含這樣的核酸分子，其為在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示的核苷酸序列之一或其一部分的互補序列。如果核酸分子可與在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所述序列之一雜交產(chǎn)生穩(wěn)定的雙鏈，則互補于SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示的核苷酸序列之一的核酸分子是充分互補的。具有序列SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的新延伸酶核酸序列的同系物是指例如與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示的核苷酸序列之一具有至少約50至60％，優(yōu)選地至少約60至70％，更優(yōu)選地至少約70至80％、80至90％或90至95％，以及甚至更優(yōu)選地至少約95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的等位基因變體或它們的同系物、衍生物或類似物或其部分。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含這樣的核苷酸序列，其在嚴(yán)格條件下可與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示的核苷酸序列之一或其一部分雜交。等位基因變體尤其包含可通過從/對SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示序列的核苷酸的刪除、插入或替換而獲得的功能變體，但對于合成所獲得的蛋白質(zhì)的酶活性，規(guī)定為有利地保留一個或多個基因的插入。保留延伸酶酶活性的蛋白質(zhì)指的是與由SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12編碼的蛋白質(zhì)相比，具有原始酶活性至少10％，優(yōu)選地20％，尤其優(yōu)選地30％，非常特別優(yōu)選40％的蛋白質(zhì)。保留上述活性的延伸酶為酶活性基本上不降低的延伸酶。SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的同系物也指例如編碼和非編碼DNA序列的細(xì)菌、真菌和植物同系物、截短序列、單鏈DNA或RNA。SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的同系物也指如啟動子變體衍生物?？赏ㄟ^一個或多個核苷酸的替換、插入和/或刪除改變所述核苷酸序列上游的啟動子，但不妨礙啟動子的功能或活性。而且，通過改變啟動子的序列或甚至用來自異種生物的更具活性的啟動子完全替代它們，可增強啟動子的活性。而且，本發(fā)明的核酸分子可只包含SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的序列之一的編碼區(qū)的一部分，例如可用作探針或引物的片段或編碼PSE生物活性部分的片段。所測定的來自展葉劍葉蘚、致病疫霉、破囊壺菌和隱甲藻類PSE基因克隆的核苷酸序列使得可產(chǎn)生這樣的探針和引物，其用來鑒定和/或克隆在其它細(xì)胞種類和生物中的PSE同系物以及來自其它蘚類植物或相關(guān)種類的PSE同系物。該探針/引物通常包含基本上純化的寡核苷酸。該寡核苷酸通常包含這樣的核苷酸序列區(qū)域，其在嚴(yán)格條件下與在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所述序列之一的有義鏈或與在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所述序列之一的反義鏈或其同系物、衍生物和類似物或其天然存在的突變體的至少約12個，優(yōu)選地約16個，更優(yōu)選地約25個、40個、50個或75個連續(xù)的核苷酸雜交?；赟EQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的核苷酸序列的引物可用于PCR反應(yīng)以克隆PSE同系物?；赑SE核苷酸序列的探針可用于檢測編碼相同或同源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本或基因組序列。在優(yōu)選的實施方案中，該探針另外還包含與其結(jié)合的標(biāo)記基團(tuán)例如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶的輔因子。這些探針可用作試驗試劑盒的一部分，用作鑒定錯表達(dá)PSE的細(xì)胞的基因組標(biāo)記物，例如通過測定細(xì)胞樣本中編碼PSE的核酸量(如測定PSEmRNA水平)，或用于確定基因組的PSE基因是否被突變或被刪除。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼這樣的蛋白質(zhì)或其一部分，所述蛋白質(zhì)或其一部分包含與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的氨基酸序列具有充分同源性的氨基酸序列，該蛋白質(zhì)或其一部分保留了參與微生物或植物的細(xì)胞膜合成所需的化合物的代謝或保留了參與分子通過這些膜的轉(zhuǎn)運。正如在本發(fā)明的上下文中所用，術(shù)語“充分的同源性”涉及這樣的蛋白質(zhì)或其一部分，其氨基酸序列具有等同于或等值于SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的氨基酸序列的最小數(shù)目的氨基酸殘基(例如具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基，其中所述氨基酸殘基如在SEQIDNO2至12序列之一中的氨基酸殘基)，這樣蛋白質(zhì)或其一部分可參與微生物或植物的細(xì)胞膜合成所需的化合物的代謝或參與分子通過這些膜的轉(zhuǎn)運。如此處所述，用于膜成分或膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的這些代謝途徑的蛋白質(zhì)成分可在產(chǎn)生和分泌一種或多種精細(xì)化學(xué)品中起作用。也在此處描述了這些活性的實例。因此“PSE的功能”對一種或多種精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)量、生產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率起直接或間接作用。表1中陳述了催化活性的PSE底物特異性的實例。在一個進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子的衍生物編碼這樣的蛋白質(zhì)，其與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12中的全部氨基酸序列具有至少約50至60％，優(yōu)選地至少約60至70％，且更優(yōu)選地至少約70至80％、80至90％、90至95％，且最優(yōu)選地至少約96％、97％、98％、99％或更高的同源性。用程序PileUp(分子進(jìn)化雜志(J.Mol.Evolution.)，25，351-360，1987，Higgins等人，CABIOS，5，1989151-153)或BESTFIT或GAP(Henikoff，S.和Henikoff，J.G.(1992)蛋白質(zhì)模塊中的氨基酸替換矩陣。美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8910915-10919)測定了整個序列區(qū)氨基酸序列的同源性。本發(fā)明的PSE核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的一部分優(yōu)選地為PSEs之一的生物活性部分。如此處所用，術(shù)語“PSE的生物活性部分”是指包含PSE的片斷(例如結(jié)構(gòu)域/基序)，其可參與微生物或植物細(xì)胞膜合成所需的化合物的代謝或參與分子通過這些膜的轉(zhuǎn)運，或其具有表1中所述的活性。可進(jìn)行酶活性測定，以確定PSE或其生物活性片段是否可參與微生物或植物細(xì)胞膜合成所需的化合物的代謝或參與分子通過這些膜的轉(zhuǎn)運。這些測定方法如實施例部分的實施例8中所詳述的，為技術(shù)人員公知。其它編碼PSE生物活性部分的核酸片段可通過分離序列SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12之一的一部分、表達(dá)PSE或肽的編碼部分(例如通過體外重組表達(dá))并測定PSE或肽的編碼部分的活性而產(chǎn)生。而且，因為遺傳密碼的簡并性，本發(fā)明包含不同于SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11(以及其部分)中所示的核苷酸序列之一的核酸分子，且該核酸分子編碼的PSE與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示核苷酸編碼的相同。在另一個實施方案中，本發(fā)明分離的核酸分子具有這樣的核苷酸序列，其編碼的蛋白質(zhì)具有在SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12中所示的氨基酸序列。在一個進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼基本上與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的氨基酸序列(其由在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示的開放讀碼框編碼)同源的全長PSE蛋白質(zhì)且可用常規(guī)方法鑒定和分離該核酸分子。除了在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示的PSE核苷酸序列外，技術(shù)人員知道可存在DNA序列的多態(tài)現(xiàn)象，后者會導(dǎo)致群體內(nèi)(例如劍葉蘚、疫霉屬、隱甲藻類或破囊壺菌群體)的PSEs氨基酸序列的改變。由于自然變異，PSE基因中的這些遺傳多態(tài)性可在群體內(nèi)的個體間存在。如在本上下文中所用，術(shù)語“基因”和“重組基因”指具有編碼PSE開放讀碼框的核酸分子，優(yōu)選地編碼疫霉屬、劍葉蘚、隱甲藻類或破囊壺菌PSE開放讀碼框的核酸分子。這些天然變體通常引起PSE基因核苷酸序列的1至5％的差異。PSE中的所有這些核苷酸變異和所導(dǎo)致的氨基酸多態(tài)現(xiàn)象(其為自然變異的結(jié)果且不改變PSEs的功能活性)均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可用標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)在嚴(yán)格的雜交條件下，用劍葉蘚、疫霉屬、隱甲藻類或破囊壺菌cDNA或其一部分作為雜交探針，分離對應(yīng)的天然變體的核酸分子以及分離非劍葉蘚、非疫霉屬、非隱甲藻類或非破囊壺菌的疫霉屬、劍葉蘚、隱甲藻類或破囊壺菌cDNA同系物、衍生物和類似物，因為它們與此處公開的疫霉屬、劍葉蘚、隱甲藻類或破囊壺菌PSE核酸的同源性。在另一個實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子具有15個核苷酸的最小長度，并且在嚴(yán)格條件下其與包含SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11核苷酸序列的核酸分子雜交。在另一個實施方案中，該核酸的最小長度具有25個、50個、100個、250個或更多的核苷酸。在本上下文中所用的術(shù)語“在嚴(yán)格條件下雜交”是描述雜交和洗滌條件，在所描述的條件下，相互間具有至少60％同源性的核苷酸序列通常仍然與另一方雜交。條件優(yōu)選地為可使相互間具有至少約65％，更優(yōu)選地至少約70％，且甚至更優(yōu)選地至少約75％或更高同源性的序列通常仍然與另一方雜交的條件。這些嚴(yán)格的雜交條件為技術(shù)人員公知且可在分子生物學(xué)最新方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，JohnWiley&Sons，紐約(1989)，6.3.1-6.3.6一書中找到。嚴(yán)格的雜交條件的優(yōu)選非限制性實例為在約45℃時，于6×氯化鈉/檸檬酸鈉(氯化鈉/檸檬酸鈉＝SSC)中雜交，然后在約50至65℃時，于0.2×SSC、0.1％SDS中進(jìn)行一次或多次洗滌步驟。技術(shù)人員公知這些雜交條件依據(jù)核酸類型的不同而不同，且如當(dāng)存在有機溶劑時，緩沖液的溫度和濃度也不同。在“標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下”溫度依核酸類型的不同而為在具有0.1至5×SSC(pH7.2)的含水緩沖液中的42℃和58℃之間。如果在上述緩沖液中存在有機溶劑，例如50％甲酰胺，標(biāo)準(zhǔn)條件下的溫度為約42℃。對DNADNA雜交體，雜交條件優(yōu)選例如0.1×SSC以及20℃至45℃，優(yōu)選地在30℃和45℃之間。對DNARNA雜交體，雜交條件優(yōu)選例如0.1×SSC以及30℃至55℃，優(yōu)選地在45℃和55℃之間。上述雜交溫度是例如在缺乏甲酰胺時對核酸長度在約100bp(＝堿基對)且G+C含量為50％時進(jìn)行的測定。技術(shù)人員公知如何參考課本確定所需的雜交條件，例如參考上面提及的課本或以下課本Sambrook等人，“分子克隆”(“MolecularCloning”)，冷泉港實驗室，1989；Hames和Higgins(編輯)1985，“核酸雜交實用方法”(“NucleicAcidsHybridizationAPracticalApproach”)，在牛津大學(xué)出版社的IRLPress，牛津；Brown(編輯)1991，“基本分子生物學(xué)實用方法”(“EssentialMolecularBiologyAPracticalApproach”)，在牛津大學(xué)出版社的IRLPress，牛津。優(yōu)選地，在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的序列雜交的本發(fā)明分離的核酸分子對應(yīng)于天然存在的核酸分子。如在本上下文中所用的，“天然存在的”核酸分子指在自然界中存在的具有核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如其編碼天然蛋白質(zhì))。在一個實施方案中，核酸編碼天然存在的展葉劍葉蘚PSE、致病疫霉PSE、寇氏隱甲藻PSE或破囊壺菌PSE。除了可在群體中具有的、天然PSE序列變體外，技術(shù)人員還意識到通過突變也可將變化導(dǎo)入SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的核苷酸序列，其導(dǎo)致所編碼的PSE氨基酸序列的變化，而對PSE蛋白質(zhì)的功能沒有不利影響。例如可在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的序列中產(chǎn)生這樣的核苷酸替換，其導(dǎo)致“非必需”氨基酸殘基上的氨基酸替換?！胺潜匦琛卑被釟埢鶠檫@樣的殘基，可對在PSEs之一的野生型序列(SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12)中改變該殘基，而并不改變PSE的活性，但“必需”氨基酸殘基為PSE活性所需要。但其它氨基酸殘基(例如那些在PSE活性結(jié)構(gòu)域中不保守或只是半保守的殘基)可能不是必需的，因此可改變之且同時不改變PSE活性。因此，本發(fā)明的又一方面涉及這樣的核酸分子，其編碼包含改變了的、對PSE活性為非必需的氨基酸殘基的PSEs。這些PSEs在氨基酸序列上不同于SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的序列，但仍保留了此處描述的至少一種PSE活性。在一個實施方案中，分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述蛋白質(zhì)包含的氨基酸序列與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的氨基酸序列具有至少約50％的同源性，且蛋白質(zhì)可參與疫霉屬、劍葉蘚、隱甲藻類或破囊壺菌的細(xì)胞膜合成所需的化合物的代謝或可參與分子通過這些膜的轉(zhuǎn)運。該核酸分子所編碼的蛋白質(zhì)與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的序列之一優(yōu)選地具有至少約50至60％的同源性，更優(yōu)選地與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的序列之一具有至少約60至70％的同源性，甚至更優(yōu)選地與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的序列之一具有至少約70至80％、80至90％、90至95％的同源性，且最優(yōu)選地與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的序列之一具有至少約96％、97％、98％或99％的同源性。為確定兩個氨基酸序列(例如SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的序列之一和其突變形式)或兩個核苷酸序列的百分同源性，將一個序列寫在另一個序列下面使得可進(jìn)行最佳比較(例如可在蛋白質(zhì)或核酸序列中導(dǎo)入間隔，以產(chǎn)生與其它蛋白質(zhì)或其它核酸的最佳排列)。然后比較對應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。如果在一個序列(例如SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的序列之一)中的某個位置占據(jù)著如另一序列(例如選自SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12序列的突變形式)對應(yīng)位置處的同樣的氨基酸殘基或同樣的核苷酸，那么該分子在此位置處為同源的(即如本上下文中所用的氨基酸或核酸的“同源性”對應(yīng)于氨基酸或核酸的“同一性”)。兩個序列間的百分同源性為序列于同一位置處共有氨基酸或核酸數(shù)目的函數(shù)(即％同源性＝同一位置的數(shù)目/位置總數(shù)×100)?？赏ㄟ^將一個或多個核苷酸的替換、添加或刪除導(dǎo)入SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的核苷酸序列而產(chǎn)生編碼與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的蛋白質(zhì)序列同源的PSE的分離核酸分子，這樣在所編碼的蛋白質(zhì)中導(dǎo)入了一個或多個氨基酸的替換、添加或刪除?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如定點誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的序列之一中導(dǎo)入突變。優(yōu)選地，在一個或多個預(yù)測的非必需氨基酸殘基處進(jìn)行保守的氨基酸替換。在“保守的氨基酸替換”中，將氨基酸殘基與具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基交換。已在專門領(lǐng)域中對具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的分類進(jìn)行了定義。分類中包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不帶電荷的極性側(cè)鏈氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-分支側(cè)鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。預(yù)測的PSE中非必需氨基酸殘基因此優(yōu)選地用來自同一側(cè)鏈分類的另一個氨基酸殘基互換。另外，在另一實施方案中，于所有或部分PSE-編碼序列中可隨機導(dǎo)入突變，例如通過飽和誘變并對所得到的突變體篩選此處描述的PSE活性，以鑒定保留了PSE活性的突變體。在對SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的序列之一誘變后，可重組表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)并用如此處描述的測定法(參見實施例部分)確定蛋白質(zhì)的活性。除了編碼上述PSEs的核酸分子外，本發(fā)明的又一方面涉及與其“反義”的分離核酸分子。”反義”核酸包含這樣的核苷酸序列，其與編碼蛋白質(zhì)的“有義”核酸互補，例如互補于雙鏈cDNA分子的編碼鏈或互補于mRNA序列。因此，反義核酸可通過氫鍵與有義核酸結(jié)合。反義核酸可互補于整個PSE-編碼鏈或僅僅互補于其一部分。在一個實施方案中，反義核酸分子“反義”于編碼PSE的核苷酸序列的編碼鏈的“編碼區(qū)”。術(shù)語“編碼區(qū)”指這樣的核苷酸序列區(qū)，其包括翻譯為氨基酸殘基的密碼子(例如起始并終止于終止密碼子的全部編碼區(qū)，即在終止密碼子前的最后一個密碼子)。在又一個實施方案中，反義核酸分子“反義”于編碼PSE的核苷酸序列的編碼鏈的“非編碼區(qū)”。術(shù)語“非編碼區(qū)”指在編碼區(qū)的側(cè)翼且不翻譯為氨基酸的5′和3′序列(即，其也稱為5’-和3’-非翻譯區(qū))?？紤]到編碼鏈的此處公開的PSE-編碼序列(例如在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中所示的序列)，可根據(jù)Watson-Crick堿基配對原則設(shè)計本發(fā)明的反義核酸。反義核酸分子可互補于全部的PSEmRNA編碼區(qū)，但更優(yōu)選僅”反義”于PSEmRNA編碼區(qū)或非編碼區(qū)的一部分的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸可互補于PSEmRNA翻譯起始的周圍區(qū)域。反義寡核苷酸可具有長度為例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個以及更多的核苷酸。反義寡核苷酸有利地為15至25個核苷酸長?？赏ㄟ^本領(lǐng)域公知的方法使用化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)構(gòu)建本發(fā)明的反義核酸。例如，可用天然存在的核苷酸或多種修飾的核苷酸化學(xué)合成反義核酸(如反義寡核苷酸)，其中所述修飾的核苷酸可提高分子的生物穩(wěn)定性或提高反義和有義核酸之間形成的雙螺旋的物理穩(wěn)定性；例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于產(chǎn)生反義核酸的修飾核苷酸的實例尤其為5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌吟、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、次黃嘌呤核苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基次黃嘌呤核苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊基腺嘌吟、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、甲基尿嘧啶-5-羥基乙酸、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌吟。另外，可用表達(dá)載體以生物方式產(chǎn)生反義核酸，在表達(dá)載體中核酸以反義方向亞克隆(即由所導(dǎo)入的核酸轉(zhuǎn)錄的RNA相對于目標(biāo)靶核酸為反義方向，下面將對此進(jìn)更詳細(xì)的描述)。通常將本發(fā)明的反義核酸分子施與細(xì)胞或在原位產(chǎn)生，這樣它們與編碼PSE的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，從而例如通過抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯來抑制該蛋白質(zhì)的表達(dá)?？赏ㄟ^與穩(wěn)定的雙螺旋形成體的常規(guī)核苷酸互補性實現(xiàn)雜交，或例如在為結(jié)合DNA雙螺旋的反義核酸分子的情況下，通過在雙螺旋大溝中的特異相互作用實現(xiàn)雜交?？梢阅撤N方式修飾反義分子，例如通過將反義核酸分子結(jié)合至肽或抗體，以使修飾的反義分子特異性與受體結(jié)合或與所選擇的細(xì)胞表面表達(dá)的抗原結(jié)合，其中所述肽或抗體各自與細(xì)胞表面受體或抗原結(jié)合。也可使用此處描述的載體提供具有反義核酸分子的細(xì)胞。載體構(gòu)建體中優(yōu)選反義核酸分子在強的原核、病毒或真核啟動子(包括植物啟動子)控制下的載體構(gòu)建體，以得到足夠濃度的胞內(nèi)反義分子。在又一個實施方案中，本發(fā)明的反義核酸分子為α-差向異構(gòu)體的核酸分子。α-差向異構(gòu)體的核酸分子與互補的RNA形成特殊的雙鏈雜交體，這些鏈相互平行，與常見的β-單元相反[Gaultier等人(1987)核酸研究156625-6641]。而且，反義核酸可包含2’-o-甲基核糖核苷酸[Inoue等人(1987)核酸研究156131-6148]或嵌合RNA-DNA類似物(analogon)[Inoue等人(1987)FEBSLett.215327-330]。在又一個實施方案中，本發(fā)明的反義核酸分子為核酶。核酶為具核糖核酸酶活性的催化RNA分子，其可切割與其有互補區(qū)的單鏈核酸如mRNA。因此，核酶例如錘頭狀核酶[描述見Haselhoff和Gerlach(1988)自然(Nature)334585-591]可用于PSEmRNA轉(zhuǎn)錄本的催化切割，以抑制PSEmRNA的翻譯?；诖颂幑_的PSEcDNA序列(即在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11中的38℃k21_g07fwd)或基于欲分離的異源序列，按照本發(fā)明所教的方法，可設(shè)計對編碼PSE的核酸具特異性的核酶。例如可構(gòu)建四膜蟲-L-19-IVSRNA，其中活性位點的核苷酸序列互補于欲切割的編碼PSE的mRNA的核苷酸序列。參見例如Cech等人，US4,987,071和Cech等人，US5,116,742。另外，可用PSEmRNA從一堆RNA分子中選擇具特異核糖核酸酶活性的催化RNA[參見例如Bartel，D.和Szostak，J.W.(1993)科學(xué)2611411-1418]。另外，通過指導(dǎo)互補于PSE核苷酸序列調(diào)節(jié)區(qū)(例如PSE啟動子和/或增強子)的核苷酸序列，以形成三股螺旋結(jié)構(gòu)，從而抑制PSE基因表達(dá)，其中所述三股螺旋結(jié)構(gòu)可抑制PSE基因在靶細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄[通常參見Helene，C.(1991)抗癌藥研究(AnticancerDrugRes.)6(6)569-84；Helene，C.等人(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；以及Maher.L.J.(1992)生物鑒定(Bioassays)14(12)807-815]。B.基因構(gòu)建體本發(fā)明的又一個實施方案為新的基因構(gòu)建體，其包含衍生自劍葉蘚、疫霉屬、隱甲藻類或破囊壺菌的分離核酸并編碼對脂肪酸分子中具有至少兩個雙鍵的C16-、C18-或C20-脂肪酸延伸至少兩個碳原子的多肽，或其包含功能性與一個或多個調(diào)節(jié)信號(優(yōu)選地可提高基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號)連接的SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的基因序列、其同系物、衍生物或類似物。這些調(diào)節(jié)信號的實例為結(jié)合誘導(dǎo)者或阻遏物的序列，并以這種方式調(diào)節(jié)核酸的表達(dá)。除了這些新的調(diào)節(jié)序列外，還存在對實際的結(jié)構(gòu)基因之前的這些序列的天然調(diào)節(jié)，且如果合適的話，這些序列的天然調(diào)節(jié)已被遺傳修飾，這樣關(guān)閉了天然調(diào)節(jié)并增強了基因的表達(dá)。但是基因構(gòu)建體也可具有較簡單的結(jié)構(gòu)，即在序列SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11或它們的同系物之前沒有插入其它調(diào)節(jié)信號且未刪除具有調(diào)節(jié)作用的天然啟動子。取而代之的是，以某種方式突變天然調(diào)節(jié)序列，以使調(diào)節(jié)不再發(fā)生且基因表達(dá)被增強。而且，基因構(gòu)建體可有利地包含一種或多種功能性與啟動子連接的、可提高核酸序列表達(dá)的稱為增強子的序列。在DNA序列的3’末端也可另外插入有利的序列，如進(jìn)一步的調(diào)節(jié)元件或終止子。在基因構(gòu)建體中可存在一個或多個延伸酶基因拷貝。如果在基因構(gòu)建體中存在更多的基因，將更多的基因插入生物體是有利的。對新方法有利的調(diào)節(jié)序列例如存在于啟動子中，如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL啟動子，且有利地用于革蘭氏陰性細(xì)菌。更有利的調(diào)節(jié)序列例如存在于革蘭氏陽性啟動子amy和SPO2中、存在于酵母或真菌啟動子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中或存在于植物啟動子CaMV/35S[Franck等人，細(xì)胞(Cell)21(1980)285-294]、PRP1[Ward等人，植物分子生物學(xué)(Plant.Mol.Biol.)22(1993)]、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos中或存在于遍在蛋白或菜豆蛋白啟動子中。在此上下文中也優(yōu)選誘導(dǎo)型啟動子，如在EP-A-0388186(芐基氨磺?？烧T導(dǎo)的)、植物雜志(PlantJ.)2，1992397-404(Gatz等人，四環(huán)素-可誘導(dǎo)的)、EP-A-0335528(脫落酸-可誘導(dǎo)的)或WO93/21334(乙醇-或環(huán)已醇-可誘導(dǎo)的)中描述的啟動子。其它合適的植物啟動子為胞質(zhì)FBPase或馬鈴薯ST-LSI啟動子(Stockhaus等人、EMBOJ.8，1989，2445)、甘氨酸max磷酸核糖焦磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶啟動子(Genbank登錄號U87999)或EP-A-0249676中描述的結(jié)節(jié)特異的啟動子。尤其有利的啟動子為使得在參與脂肪酸生物合成的組織中表達(dá)的啟動子。非常尤其有利的是種子特異的啟動子，如usp、LEB4、菜豆蛋白或napin啟動子。進(jìn)一步尤其有利的啟動子為可用于單子葉植物或雙子葉植物的種子特異啟動子，其在US5,608,152(油料種子油菜napin啟動子)、WO98/45461(擬南芥的菜豆蛋白啟動子)、US5,504,200(菜豆(Phaseolusvulgaris)的菜豆蛋白啟動子)、WO91/13980(蕓苔屬Bce4-啟動子)、Baeumlein等人，植物雜志，2，2，1992233-239(豆科LEB4啟動子)中描述的啟動子，這些啟動子適用于雙子葉植物。下列啟動子適用于單子葉植物，大麥lpt-2或lpt-1啟動子(WO95/15389和WO95/23230)、大麥的大麥醇溶蛋白啟動子以及在WO99/16890中描述的其它合適啟動子。大體而言，可使用所有的具調(diào)節(jié)序列的天然啟動子以用于新方法，如上述的那些啟動子。也可以并方便地額外使用合成啟動子。如上所述，基因構(gòu)建體也可包含更多的欲導(dǎo)入生物體的基因?？梢圆⒎奖愕貙⒒驑?gòu)建體導(dǎo)入宿主生物并在其中表達(dá)，其中的調(diào)節(jié)基因如針對誘導(dǎo)者、阻遏物或酶的基因(因為它們的酶活性)參與生物合成途徑的一個或多個基因的調(diào)節(jié)。這些基因可為異源或同源起源。插入基因可有它們自身的啟動子，或在序列SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11或其同系物、衍生物或類似物的啟動子控制下。為了表達(dá)其它存在的基因，基因構(gòu)建體有利地包含進(jìn)一步的用于促進(jìn)表達(dá)的3’-和/或5’-末端調(diào)節(jié)序列，并對它們進(jìn)行選擇，用于所選擇的宿主生物功能和基因的最佳表達(dá)。如上所述，這些調(diào)節(jié)序列使基因的特異性表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)成為可能。根據(jù)宿主生物的不同，這意味著例如基因只是在誘導(dǎo)后表達(dá)或過表達(dá)，或基因立即表達(dá)和/或過表達(dá)。而且，調(diào)節(jié)序列或調(diào)節(jié)因子優(yōu)選地對所導(dǎo)入基因的表達(dá)具有有利的作用，從而促進(jìn)基因的表達(dá)。以這種方式，可使用強轉(zhuǎn)錄信號如啟動子和/或增強子在轉(zhuǎn)錄水平有利地增強調(diào)節(jié)元件。但是，進(jìn)一步也可通過例如提高mRNA的穩(wěn)定性來增強翻譯。有利地將本發(fā)明的核酸序列與至少一個報告基因一同克隆入基因構(gòu)建體(＝表達(dá)盒，核酸構(gòu)建體)，且將該基因構(gòu)建體通過載體導(dǎo)入生物體或直接導(dǎo)入基因組。報告基因通過生長、熒光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或抗性測試或通過光度測定法應(yīng)易于檢測到?？商峒暗膱蟾婊虻膶嵗秊榭股鼗虺輨┛剐曰?、水解酶基因、熒光蛋白基因、生物發(fā)光基因、糖或核苷酸代謝基因或生物合成基因如Ura3基因、Ilv2基因、螢光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、gfp基因、2-脫氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酯基因、β-葡糖苷酸酶基因、β-內(nèi)酰胺酶基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因或BASTA(＝草銨膦抗性)基因。這些基因具有轉(zhuǎn)錄活性，且因此易于測定和定量基因的表達(dá)。這使得可確定在基因組中顯示不同產(chǎn)量的位置。編碼延伸酶的、具有SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的本發(fā)明的核酸序列可以一個拷貝或多個拷貝存在于表達(dá)盒(＝基因構(gòu)建體)中。表達(dá)盒(＝基因構(gòu)建體，核酸構(gòu)建體)可額外地包含至少另一個編碼基因的、欲導(dǎo)入宿主生物體的核酸，其優(yōu)選地來自脂肪酸生物合成。這些基因可位于本發(fā)明的延伸酶基因分別的調(diào)節(jié)或位于同一調(diào)節(jié)區(qū)。這些基因為例如另外的生物合成基因，有利地為脂肪酸生物合成基因，其使得合成增加成為可能?？梢詫嵗绞教峒暗幕驗槟切┯糜讦?9-、Δ17-、Δ15-、Δ12-、Δ9-、Δ8-、Δ6-、Δ5-、Δ4-去飽和酶、多種羥化酶、Δ12-乙炔酶(acetylenase)、酰基-ACP硫酯酶、β-酮脂?；?ACP合成酶或β-酮脂?；?ACP還原酶。有利地將去飽和酶基因用于核酸構(gòu)建體。再者，這些基因可以一個拷貝或多個拷貝存在于基因構(gòu)建體。C.重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明的又一方面涉及載體，優(yōu)選地涉及表達(dá)載體，其包含編碼PSE(或其一部分)的本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的基因構(gòu)建體。如在此上下文中所用，術(shù)語”載體”指這樣的核酸分子，其可轉(zhuǎn)移另一個與其結(jié)合的核酸。載體的一種類型是”質(zhì)?！保浯砜蛇B接入其它DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。載體的又一類型為病毒載體，它使其它DNA片段連接入病毒基因組成為可能。某些載體可在它們所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點的細(xì)菌載體和游離型哺乳動物載體)。其它載體(例如非游離型哺乳動物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后被整合入宿主細(xì)胞基因組且如此與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體可支配與其功能性連接的基因的表達(dá)。這些載體此處稱為“表達(dá)載體”。通常，適用于重組DNA技術(shù)的表達(dá)載體采用質(zhì)粒。在本描述中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。但本發(fā)明還包含其它形式的表達(dá)載體，例如發(fā)揮類似功能的病毒載體(如復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。而且，術(shù)語載體也包含為技術(shù)人員所公知的其它載體，例如噬菌體、病毒(如SV40、CMV、桿狀病毒、腺病毒)、轉(zhuǎn)座子、插入序列、噬菌粒、噬粒、粘粒、線狀或環(huán)狀DNA和RNA。本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的基因構(gòu)建體，其中重組表達(dá)載體為適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸的形式，這意味著重組表達(dá)載體包含一種或多種調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)序列是根據(jù)用于表達(dá)的宿主細(xì)胞而選擇的，其與欲表達(dá)的核酸序列功能性連接。在重組表達(dá)載體中，“功能性連接”指目標(biāo)核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以某種方式連接，從而使核苷酸序列的表達(dá)是可能的，且它們被相互連接，從而(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或當(dāng)載體被導(dǎo)入宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中時)使這兩種序列完成序列所具有的預(yù)定功能。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”指包含啟動子、增強子和其它表達(dá)控制元件(如聚腺苷酸化信號)。這些調(diào)節(jié)序列例如見Goeddel基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology)185，學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)，SanDiego，CA(1990)，或見Gruber和Crosby，在植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)中的方法(MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnolgy)，CRCPress，BocaRaton，佛羅里達(dá)，編輯Glick和Thompson，第7章，89-108中的描述，包括其中的參考文獻(xiàn)。調(diào)節(jié)序列包含那些在許多宿主細(xì)胞類型中控制核苷酸序列組成型表達(dá)的序列和那些只在某些宿主細(xì)胞中控制核苷酸序列在某些條件下直接表達(dá)的序列。技術(shù)人員公知表達(dá)載體的設(shè)計可依賴于一些因素如欲轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇、目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)程度等?？蓪⒈景l(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生此處所述核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽，其中包括融合蛋白質(zhì)或融合肽(例如PSEs、PSEs的突變形式、融合蛋白質(zhì)等)?？稍O(shè)計用于在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)PSEs的本發(fā)明的重組表達(dá)載體。例如可使用載體并按WO98/01572中所述的轉(zhuǎn)化方法在細(xì)菌細(xì)胞(如谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum))、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母和其它真菌細(xì)胞[參見Romanos，M.A.等人，(1992)“外源基因在酵母中的表達(dá)綜述”(“Foreigngeneexpressioninyeastareview”)，酵母(Yeast)8423-488；vandenHondel，C.A.M.J.J.等人，(1991)真菌中更多的基因操作(MoreGeneManipulationsinFungi)，J.W.Bennet&L.L.Lasure編輯的“異源基因在絲狀真菌中的表達(dá)”(“Heterologousgeneexpressioninfilamentousfungi”)，396-428頁學(xué)術(shù)出版社SanDiego；以及vandenHondel，C.A.M.J.J.，&Punt，P.J.(1991)在真菌應(yīng)用分子遺傳學(xué)(AppliedMolecularGeneticsofFungi)，Peberdy，J.F.等人編輯的“開發(fā)用于絲狀真菌的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和載體”(“Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi”)，1-28頁，劍橋大學(xué)出版社劍橋]、藻類[Falciatore等人，1999，海洋生物技術(shù)(MarineBiotechnology.)1，3239-251]、下列類型的纖毛蟲全毛亞綱(Holotrichia)、緣毛亞綱(Peritrichia)、旋唇亞綱(Spirotrichia)、吸管亞綱(Suctoria)、四膜蟲屬、草履蟲、豆形蟲屬、瞬目蟲(Glaucoma)、匙口蟲(Platyophrya)、Potomacus、假康纖蟲屬(Pseudocohnilembus)、游仆蟲(Euplotes)、Engelmaniella和棘尾蟲，尤其是Stylonychialemnae，以及多細(xì)胞植物的細(xì)胞[參見Schmidt，R.和Willmitzer，L.(1988)“高效根癌土壤桿菌介導(dǎo)的擬南芥菜葉和子葉外植體的轉(zhuǎn)化”(“HighefficiencyAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofArabidopsisthalianaleafandcotyledonexplants”)，植物細(xì)胞報告(PlantCellRep.)583-586；植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)(PlantMolecularBiologyandBiotechnology)，CPress，BocaRaton，F(xiàn)lorida，第6/7章，71-119頁(1993)；F.F.White，B.Jenes等人，基因轉(zhuǎn)移技術(shù)(TechniquesforGeneTransfer)，在轉(zhuǎn)基因植物(TransgenicPlants)，Bd.1，工程和應(yīng)用(EngineeringandUtilization)，編輯Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)，128-43；Potrykus，植物生理學(xué)和植物分子生物學(xué)年鑒(Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.)42(1991)，205-225(以及其中引用的參考文獻(xiàn))]或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)PSE基因。另外在Goeddel，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology)185，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)中描述了合適的宿主細(xì)胞。另外，例如用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶可體外轉(zhuǎn)錄和翻譯重組表達(dá)載體。在原核生物中，通常用含有組成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體表達(dá)蛋白質(zhì)，其中所述組成型或誘導(dǎo)型啟動子控制融合蛋白質(zhì)或非融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。融合載體向其中編碼的蛋白質(zhì)添加了一系列氨基酸，通常在重組蛋白質(zhì)的氨基末端，但也可在C末端，或融合入蛋白質(zhì)中的合適區(qū)域。這些融合載體通常具有三個作用1)增強重組蛋白質(zhì)的表達(dá)；2)提高重組蛋白質(zhì)的可溶性；以及3)通過在親和純化中作為配體(例如通過稱為his的標(biāo)簽)支持重組蛋白質(zhì)的純化。在為融合表達(dá)載體的情況下，通常在融合單元和重組蛋白質(zhì)連接位點處導(dǎo)入原核切割位點，這樣在純化了融合蛋白質(zhì)后，可將重組蛋白質(zhì)從融合單元分離出來。這些酶和它們對應(yīng)的識別序列包含Xa因子、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達(dá)載體尤其為pGEX[PharmaciaBiotechInc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)基因(Gene)6731-40]、pMAL[NewEnglandBiolabs，Beverly，MA]和pRIT5[Pharmacia，Piscataway，NJ]，其中將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖-E-結(jié)合蛋白質(zhì)或蛋白A融合至重組的目標(biāo)蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，將PSE-編碼序列克隆入pGEX表達(dá)載體，以產(chǎn)生編碼融合蛋白質(zhì)的載體，其中所述融合蛋白質(zhì)包含從N末端至C末端依次為GST-凝血酶切割位點-X-蛋白質(zhì)?？捎霉入赘孰?瓊脂糖樹脂通過親和層析純化融合蛋白質(zhì)。通過用凝血酶切割融合蛋白質(zhì)可獲得不與GST融合的重組PSE。合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌(E.coli)表達(dá)系統(tǒng)的實例特別為pTrc(Amann等人(1988)基因69301-315)和pET11d(Studier等人，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology)185，AcademicPress，SanDiego，California(1990)60-89)。PTrc載體的靶基因表達(dá)是基于宿主RNA聚合酶從雜合的trp-lac融合啟動子進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄。pET11d載體的靶基因表達(dá)是基于由共表達(dá)的病毒RNA聚合酶(T7gn1)介導(dǎo)的從T7-gn10-lac融合啟動子進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄。宿主菌BL21(DE3)或HMS174(DE3)通過位于其中的帶有在lacUV5啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的T7gn1基因的λ噬菌體提供該病毒聚合酶。其它適用于原核生物的載體為技術(shù)人員公知；這些載體例如為在大腸桿菌中的pLG338、pACYC184、pBR系列(如pBR322)、pUC系列(如pUC18或pUC19)、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、pgt11或pBdCI，在鏈霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，在芽孢桿菌中的pUB110、pC194或pBD214，在棒狀桿菌中的pSA77或pAJ667。最佳的重組蛋白表達(dá)策略為在蛋白酶剪切重組蛋白質(zhì)的能力被破壞的宿主菌中表達(dá)蛋白質(zhì)[Gottesman，S.，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法185，AcademicPress，圣地亞哥，加利福利亞(1990)119-128]。還有一個策略是修飾欲插入表達(dá)載體的核酸序列，以使每個氨基酸單獨的密碼子為細(xì)菌如谷氨酸棒桿菌優(yōu)先使用的、選擇用于表達(dá)的密碼子[Wada等人(1992)核酸研究(NucleicAcidsRes.)202111-2118]。通過標(biāo)準(zhǔn)的DNA合成技術(shù)進(jìn)行本發(fā)明的這些核酸序列的修飾。又在一個實施方案中，PSE表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體。用于在釀酒酵母(釀酒酵母)中表達(dá)的載體的實例包括pYepSec1[Baldari等人(1987)EmboJ.6229-234]、pMFa[Kurjan和Herskowitz(1982)細(xì)胞(Cell)30933-943]、pJRY88[Schultz等人(1987)基因(Gene)54113-123]和pYES2[InvitrogenCorporation，圣地亞哥，CA]。適用于其它真菌如絲狀真菌的載體和構(gòu)建載體的方法包括那些在vandenHondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)開發(fā)的用于絲狀真菌的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和載體(Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi)，在真菌的應(yīng)用分子遺傳學(xué)(AppliedMolecularGeneticsoffungi)，J.F.Peberdy等人編輯，1-28頁，劍橋大學(xué)出版社劍橋，或在真菌中更多的基因操作(MoreGeneManipulationsinFungi)[J.W.Bennet&L.L.Lasur編輯，396-428頁AcademicPress圣地亞哥]中所詳述的。其它合適的酵母載體為例如pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。另外，可使用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的PSEs。在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(如Sf9細(xì)胞)中有用的表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括pAc系列[Smith等人(1983)分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.CellBiol.)32156-2165]和pVL系列[Lucklow和Summers(1989)病毒學(xué)(Virology)17031-39]。上述載體只是對可能的合適載體進(jìn)行的一段短綜述。另外的質(zhì)粒為技術(shù)人員公知且在例如克隆載體(CloningVectors)(Pouwels，P.H.等人編輯，Elsevier，Amsterdam-NewYork-Oxford，1985，ISBN0444904018)中進(jìn)行了描述。又在一個進(jìn)一步的實施方案中，用哺乳動物表達(dá)載體在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的核酸。哺乳動物表達(dá)載體的實例包括pCDM8[Seed，B.(1987)自然(Nature)329840]和pMT2PC[Kaufman等人(1987)EMBOJ.6187-195]。當(dāng)用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時，通常由病毒的調(diào)節(jié)元件提供表達(dá)載體的調(diào)控功能。常用的啟動子衍生于例如多形瘤、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40?？稍赟ambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.，分子克隆實驗室手冊，第二版(MolecularCloningALaboratoryManual，2ndEdition)，冷泉港實驗室，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989一書的第16和17章中找到其它適用于原核和真核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)。在另一個實施方案中，重組哺乳動物表達(dá)載體優(yōu)選地在特定細(xì)胞類型中可控制核酸的表達(dá)(例如用組織特異的調(diào)節(jié)元件表達(dá)核酸)。組織特異的調(diào)節(jié)元件為本領(lǐng)域所公知。合適的組織特異啟動子的非限制性實例尤其為白蛋白啟動子[肝特異的；Pinkert等人(1987)基因進(jìn)展(GenesDev.)1268-277]、淋巴樣特異的啟動子[Calame和Eaton(1988)免疫學(xué)進(jìn)展(Adv.Immunol.)43235-275](尤其是T細(xì)胞受體的啟動子[Winoto和Baltimore(1989)EMBOJ.8729-733]和免疫球蛋白啟動子[Banerji等人(1983)細(xì)胞33729-740；Queen和Baltimore(1983)細(xì)胞33741-748])、神經(jīng)元特異的啟動子[如神經(jīng)絲啟動子；Byrne和Ruddle(1989)PNAS865473-5477]、胰腺特異的啟動子[Edlund等人(1985)科學(xué)(Science)230912-916]和乳房特異的啟動子[如乳清啟動子；US4,873,316和EP-A-0264166]。也包括調(diào)節(jié)發(fā)育的啟動子，如小鼠hox啟動子[Kessel和Gruss(1990)科學(xué)249374-379]和胎兒球蛋白啟動子[Campes和Tilghman(1989)基因進(jìn)展3537-546]。在又一個實施方案中，可在單細(xì)胞的植物細(xì)胞(如藻類)中表達(dá)本發(fā)明的PSEs，參見Falciatore等人，1999，海洋生物技術(shù)(MarineBiotechnology)1(3)239-251及其中引用的文獻(xiàn)，以及可在高等植物的植物細(xì)胞(如種子植物(如作物))中表達(dá)本發(fā)明的PSEs。植物表達(dá)載體的實例包括那些在Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)“具有位于接近左邊界的選擇性標(biāo)記的新植物雙元載體”(“Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder”)，植物分子生物學(xué)(PlantMol.Biol.)201195-1197以及Bevan，M.W.(1984)”用于植物轉(zhuǎn)化的雙元土壤桿菌載體”(”BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation”)，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)128711-8721；在轉(zhuǎn)基因植物(TransgenicPlants)，第1卷，工程和應(yīng)用(EngineeringandUtilization)，Kung和R.Wu編輯，AcademicPress，1993中的高等植物中用于基因轉(zhuǎn)移的載體(VectorsforGeneTransferinHigherPlants)，15-38頁中詳述的載體。在“植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)中的方法”(“MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology”)(CRCPress)，第6/7章，71-119頁等中描述了更多合適的植物載體。有利的載體為在大腸桿菌和土壤桿菌中復(fù)制的稱為穿梭載體或二元載體。植物表達(dá)盒優(yōu)選地包含可控制植物細(xì)胞中的基因表達(dá)并被功能性連接的調(diào)節(jié)序列，這樣每個序列可履行其作用，如轉(zhuǎn)錄終止由例如聚腺苷酸化信號履行。優(yōu)選的聚腺苷酸化信號為衍生自根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的T-DNA，如Ti質(zhì)粒pTiACH5的基因3，其公知為章魚堿合成酶[Gielen等人，EMBOJ.3(1984)835以及下列等等]或其功能等同物，但所有其它植物中的功能活性終止子也是適用的。由于植物基因表達(dá)往往不限于轉(zhuǎn)錄水平，植物表達(dá)盒優(yōu)選地包含其它功能性連接的序列，如翻譯增強子，例如超驅(qū)動序列，其包含增加蛋白質(zhì)/RNA比值的5’-非翻譯煙草花葉病毒前導(dǎo)序列[Gallie等人，1987，核酸研究158693-8711]。必須將植物基因表達(dá)功能性連接至合適的影響基因以具正確時序的細(xì)胞或組織特異性方式表達(dá)的啟動子上。優(yōu)選的啟動子為那些導(dǎo)致組成型表達(dá)的啟動子[Benfey等人，EMBOJ.8(1989)2195-2202]，如那些衍生自植物病毒的啟動子(如35SCAMV[Franck等人，細(xì)胞(Cell)21(1980)285-294]、19SCaMV(也參見US5,352,605和WO84/02913)或植物啟動子(如在US4,962,028中描述的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞單位啟動子)。在植物基因表達(dá)盒中優(yōu)選用于功能連接的其它序列為引導(dǎo)肽，其為將基因產(chǎn)物靶向在其對應(yīng)的細(xì)胞區(qū)室中所必需[綜述可參見Kermode，植物科學(xué)評論(Crit.Rev.PlantSci.)15，4(1996)285-423及其中引用的文獻(xiàn)]，如進(jìn)入液泡、核、各種類型的質(zhì)體(如造粉體、葉綠體、色質(zhì)體)、胞外空間、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、油質(zhì)體、過氧化物酶體以及進(jìn)入植物細(xì)胞的其它區(qū)室。也可通過化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子促進(jìn)植物基因表達(dá)[綜述參見Gatz1997，植物生理學(xué)和植物分子生物學(xué)年鑒(Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.)，4889-108]。當(dāng)希望基因表達(dá)以與時序有關(guān)的特定方式進(jìn)行時，化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子尤其適用。此類啟動子的實例為水楊酸-誘導(dǎo)型啟動子(WO95/19443)、四環(huán)素-誘導(dǎo)型啟動子[Gatz等人，(1992)植物雜志(PlantJ.)2，397-404]和乙醇-誘導(dǎo)型啟動子。其它合適的啟動子為對生物或非生物壓力條件反應(yīng)的啟動子，如病原體-誘導(dǎo)的PRP1基因啟動子[Ward等人，植物分子生物學(xué)(Plant.Mol.Biol.)22(1993)361-366]、熱誘導(dǎo)的番茄hsp80啟動子(US5,187，267)、低溫誘導(dǎo)的馬鈴薯α淀粉酶啟動子(WO96/12814)或創(chuàng)傷誘導(dǎo)的pinII啟動子(EP-A-0375091)。尤其優(yōu)選的啟動子為那些導(dǎo)致基因在進(jìn)行脂類和油合成的組織和器官、種子細(xì)胞(如胚乳細(xì)胞和發(fā)育中的胚芽細(xì)胞)中表達(dá)的啟動子。合適的啟動子為油料種子油菜napin基因啟動子(US5,608,152)、蠶豆(Viciafaba)USP啟動子[Baeumlein等人，分子普通遺傳學(xué)(MolGenGenet)，1991，225(3)459-67]、鼠耳芥油質(zhì)蛋白啟動子(WO98/45461)、菜豆(Phaseolusvulgaris)的云扁豆蛋白啟動子(US5,504,200)、蕓苔Bce4啟動子(WO91/13980)或豆球蛋白B4啟動子[LeB4；Baeumlein等人，1992，植物雜志(PlantJournal)，2(2)233-9]，以及導(dǎo)致在單子葉植物如玉米、大麥、小麥、稻米等中進(jìn)行種子特異性表達(dá)的啟動子。值得注意的合適啟動子為大麥lpt2或lpt1基因啟動子(WO95/15389和WO95/23230)，或在WO99/16890中描述的啟動子(來自大麥的大麥醇溶蛋白基因、稻米谷蛋白基因、稻米的oryzin基因、稻米醇溶谷蛋白基因、小麥麥醇溶基因、小麥谷蛋白基因、玉米的玉米蛋白基因、燕麥的谷蛋白基因、高梁kasirin基因和裸麥的裸麥醇溶蛋白基因的啟動子)。也尤其適用的啟動子為那些導(dǎo)致質(zhì)體-特異性表達(dá)的啟動子，因為質(zhì)體為脂類生物合成的前體和一些終產(chǎn)物在其中合成的區(qū)室。合適的啟動子如病毒RNA聚合酶啟動子于WO95/16783和WO97/06250中進(jìn)行了描述，以及鼠耳芥clpP啟動子于WO99/46394中進(jìn)行了描述。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的DNA分子的重組表達(dá)載體，其中DNA分子以反義方向克隆入表達(dá)載體，即DNA分子以某種方式功能性連接至調(diào)節(jié)序列，可使得與PSEmRNA“反義”的RNA分子(通過轉(zhuǎn)錄該DNA分子)表達(dá)?？蛇x擇功能性連接至以反義方向克隆的核酸且控制該反義RNA分子在多種細(xì)胞類型中連續(xù)表達(dá)的的調(diào)節(jié)序列，例如病毒啟動子和/或增強子，或可選擇控制反義RNA的組成型、組織特異的或細(xì)胞類型特異的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。反義表達(dá)載體可以重組質(zhì)粒、噬菌?；驕p毒病毒的形式存在，其中在高效調(diào)節(jié)區(qū)的控制下產(chǎn)生反義核酸，可通過測定載體所導(dǎo)入的細(xì)胞類型確定反義核酸的活性。對于通過反義基因調(diào)節(jié)基因表達(dá)的說明參見Weintraub，H.等人，反義RNA作為分子工具用于基因分析，綜述—遺傳學(xué)趨勢(Antisense-RNAasamoleculartoolforgeneticanalysis，Reviews-TrendsinGenetics)，1卷(1)1986。本發(fā)明的又一方面涉及本發(fā)明的重組表達(dá)載體導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在本上下文中可互換使用。當(dāng)然，這些術(shù)語不僅僅指具體的靶細(xì)胞，也指該細(xì)胞的子代或潛在的子代。因為突變或環(huán)境的影響，在接下來的代中可產(chǎn)生特定的改變，因此該子代不必與親代細(xì)胞同一，但仍位于如本上下文中所用的術(shù)語范圍內(nèi)。宿主細(xì)胞可為原核或真核細(xì)胞。例如可在細(xì)菌細(xì)胞(如谷氨酸棒桿菌)、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞(如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞)、藻類、纖毛蟲、植物細(xì)胞、真菌或其它微生物(如谷氨酸棒桿菌)中表達(dá)PSE。其它合適的宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)，可將載體DNA導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞。如在本上下文中所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”、接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)意在包含多種本領(lǐng)域公知的用于將外源核酸(如DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、天然的感受態(tài)、化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、電穿孔或粒子轟擊?？稍赟ambrook等人，(分子克隆實驗室手冊，第二版(MolecularCloningALaboratoryManual.，2ndEd.)，冷泉港實驗室，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)和其它實驗室教科書(如分子生物學(xué)方法(MethodsinMolecularBiology)，1995，44卷，土壤桿菌方法(Agrobacteriumprotocols)，Gartland和Davey編輯，HumanaPress，Totowa，新澤西)中找到用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞(包括植物細(xì)胞)的合適方法。人們公知在哺乳動物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中僅有一小部分細(xì)胞將外源DNA整合入其基因組中，這取決于所用的表達(dá)載體和所用的轉(zhuǎn)染技術(shù)。為了鑒定和選擇這些整合體，通常將編碼選擇性標(biāo)記物(例如抗生素抗性)的基因與目的基因一同導(dǎo)入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記物包含那些賦予對藥物(如G418、潮霉素和氨甲蝶吟)抗性的選擇性標(biāo)記物，或在植物中為賦予對除草劑(草甘膦或草銨膦)抗性的選擇性標(biāo)記物。其它合適的標(biāo)記物為例如編碼參與如糖類或氨基酸生物合成途徑的基因，例如β-半乳糖苷酶、ura3或ilv2。由螢光素酶基因、gfp基因或其它熒光基因編碼的標(biāo)記物也是適用的。這些標(biāo)記物可用于這些基因不起作用的突變體中，因為它們已被例如通過常規(guī)方法刪除了。而且，可將編碼選擇性標(biāo)記的核酸標(biāo)記物與編碼PSE的核酸于同一載體上導(dǎo)入宿主細(xì)胞，或者也可在分別的載體上導(dǎo)入宿主細(xì)胞?？赏ㄟ^例如藥物選擇鑒定已被所導(dǎo)入核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如，已整合有選擇性標(biāo)記物的的細(xì)胞存活，而其它細(xì)胞死亡)。為了產(chǎn)生同源重組微生物，所產(chǎn)生的載體包含至少一段已導(dǎo)入了刪除、添加或替換的PSE基因，以借此改變PSE基因，例如功能性破壞它。該PSE基因優(yōu)選地為劍葉蘚、疫霉屬、隱甲藻類或破囊壺菌PSE基因，但也可用來自其它生物，甚至來自哺乳動物、真菌或昆蟲來源的同系物或類似物。在一個優(yōu)選的實施方案中，以使內(nèi)源PSE基因在同源重組后被功能性破壞的方式設(shè)計載體(即不再編碼功能蛋白質(zhì)，也稱為敲除載體)。另外，也可這樣設(shè)計載體，使內(nèi)源PSE基因在同源重組后突變或以其它方式被改變同時仍編碼功能蛋白質(zhì)(例如可以某種方式修飾上游調(diào)節(jié)區(qū)，以導(dǎo)致內(nèi)源PSE表達(dá)的改變)。也可使用DNA-RNA雜交體通過同源重組產(chǎn)生點突變，其也公知為嵌合修復(fù)術(shù)，并從Cole-Strauss等人，1999，核酸研究27(5)1323-1330和Kmiec，基因治療(Genetherapy)，1999，美國科學(xué)家(AmericanScientist)，87(3)240-247公知。在用于同源重組的載體中，PSE基因之改性片段的5′和3′末端側(cè)翼為其它的PSE基因核酸，從而使位于載體上的外源PSE基因和微生物或植物中的內(nèi)源PSE基因之間的同源重組可進(jìn)行。該其它的側(cè)翼PSE核酸是足夠長的，以便與內(nèi)源基因成功地進(jìn)行同源重組。通常在載體中存在幾百個堿基對至上千個堿基的側(cè)翼DNA(在5′和3′末端均存在)[有關(guān)用于同源重組的載體的描述參見如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)細(xì)胞(Cell)51503或?qū)τ谡谷~劍葉蘚的基于cDNA的重組參見Strepp等人，1998，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)95(8)4368-4373]。用本領(lǐng)域公知的方法將載體(例如通過聚乙二醇介導(dǎo)的DNA方法)導(dǎo)入微生物或植物細(xì)胞，以及選擇已導(dǎo)入了PSE基因的、經(jīng)歷了與內(nèi)源PSE基因同源重組的細(xì)胞。在另一個實施方案中，可產(chǎn)生包含選擇系統(tǒng)的、允許對導(dǎo)入基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的重組生物如植物或微生物。PSE基因包含在一個載體中，其中PSE基因位于lac-操縱子的控制下，允許例如只有在存在IPTG時表達(dá)該PSE基因。這些調(diào)節(jié)系統(tǒng)為本領(lǐng)域公知。本發(fā)明的宿主細(xì)胞如原核或真核宿主細(xì)胞，或培養(yǎng)生長或在田間生長，可用于產(chǎn)生(即表達(dá))PSE。在植物中，可另外使用其它方法，所述其它方法為通過電穿孔或土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移將DNA直接轉(zhuǎn)移入正在發(fā)育的花中。因此，本發(fā)明還提供了用本發(fā)明的宿主細(xì)胞產(chǎn)生PSEs的方法。在一個實施方案中，方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(編碼PSE的重組表達(dá)載體已導(dǎo)入其中，或編碼野生型或修飾PSE的基因已導(dǎo)入其基因組中)直至產(chǎn)生PSE。在進(jìn)一步的一個實施方案中，方法包含從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞分離PSEs。原則上適于攝入本發(fā)明的核酸、本發(fā)明的新基因產(chǎn)物或本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞為所有的原核或真核生物。所用宿主生物有利地為如細(xì)菌、真菌、酵母、動物細(xì)胞或植物細(xì)胞生物。更有利的生物為動物或優(yōu)選地植物或其一部分。應(yīng)明白此處的術(shù)語“動物”不包括人類。優(yōu)選地使用真菌、酵母或植物，尤其優(yōu)選地為真菌或植物，非常尤其優(yōu)選植物，如含有大量脂類化合物的油料作物如油料種子油菜、月見草、蓖麻油植物、蕓苔、花生、亞麻籽、大豆、紅花、向日葵、琉璃苣、油棕、椰子或以下植物(如玉米、小麥、裸麥、燕麥、黑小麥、稻米、大麥、棉花、木薯、胡椒、萬壽屬)、茄科植物(如馬鈴薯、煙草、茄子和番茄)、野豌豆類、豌豆、苜蓿、灌木植物(咖啡樹、可可樹、茶樹)、柳屬、樹(油棕、椰子)和多年生草和飼料作物。本發(fā)明尤其優(yōu)選的植物為油料作物，如大豆、花生、油料種子油菜、蕓苔、蓖麻油植物、亞麻籽、月見草、向日葵、紅花、樹(油棕、椰子)。本發(fā)明尤其優(yōu)選的方面涉及包含本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的載體的植物細(xì)胞。進(jìn)一步地優(yōu)選包含本發(fā)明植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物或植物組織。本發(fā)明的又一個方面涉及本發(fā)明的那些可收獲的植物部分，并涉及適用于繁殖本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的材料，其中所述繁殖材料含有表達(dá)本發(fā)明核酸的本發(fā)明的植物細(xì)胞或含有提高水平的本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞。原則上可收獲植物的所有部分，尤其是花、花粉、果實、秧苗、根、葉、種子、塊莖、莖等。繁殖材料包括例如種子、果實、秧苗、塊莖、插條和根狀莖。D.分離的PSE本發(fā)明的又一方面涉及分離的PSEs及其生物活性部分?！狈蛛x的”或”純化的”蛋白質(zhì)或其生物活性部分當(dāng)通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時，基本上不含細(xì)胞物質(zhì)，或當(dāng)它通過化學(xué)合成時，不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。術(shù)語”基本上不含細(xì)胞材料”包含從天然或重組產(chǎn)生該PSE蛋白質(zhì)的細(xì)胞的細(xì)胞成分中分離該蛋白質(zhì)得到的PSE制品。在一個實施方案中，術(shù)語“基本上不含細(xì)胞材料”包含少于約30％(基于干重)非PSE(此處也稱為“污染蛋白質(zhì)”)的PSE制品，更優(yōu)選地包含少于約20％的非PSE，甚至更優(yōu)選地包含少于約10％的非PSE，且最優(yōu)選地包含少于約5％的非PSE。當(dāng)已通過重組技術(shù)產(chǎn)生了PSE或其生物活性部分，它也基本上不含培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基占少于約20％，更優(yōu)選地少于約10％，且最優(yōu)選地少于約5％的蛋白質(zhì)制品體積。術(shù)語“基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品”包含從參與PSE蛋白質(zhì)合成的化學(xué)前體或其它化學(xué)品中分離該蛋白質(zhì)而得到的PSE制品。在一個實施方案中，術(shù)語“基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品”包含化學(xué)前體或非PSE化學(xué)品少于約30％(基于干重)的PSE制品，更優(yōu)選地包含化學(xué)前體或非PSE化學(xué)品少于約20％的PSE制品，甚至更優(yōu)選地包含化學(xué)前體或非PSE化學(xué)品少于約10％的PSE制品，且最優(yōu)選地包含化學(xué)前體或非PSE化學(xué)品少于約5％的PSE制品。在優(yōu)選的實施方案中，分離的蛋白質(zhì)或其生物活性部分顯示了沒有來自產(chǎn)生PSE的相同生物的污染蛋白質(zhì)。當(dāng)本發(fā)明的蛋白質(zhì)為含有SEQIDNO10所示序列時，或其是由包含SEQIDNO9的基因編碼時，則必須考慮到序列由兩個Met起始。當(dāng)對應(yīng)的編碼核酸序列翻譯時，這會導(dǎo)致本發(fā)明蛋白質(zhì)起始于第一個或第二個Met的兩種衍生物的表達(dá)。兩種衍生物的表達(dá)比率在0和1之間變化，這取決于表達(dá)的類型或宿主生物。本發(fā)明因此包含含有所提及的兩種衍生物的PSE，或只含有衍生物之一的PSE。這兩種衍生物可具有不同的活性、定位、半衰期、調(diào)節(jié)機制等。這些蛋白質(zhì)如劍葉蘚、疫霉屬、隱甲藻類或破囊壺菌PSE通常通過在植物中(如展葉劍葉蘚或上面提及的植物)或在微生物如細(xì)菌(諸如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、谷氨酸棒桿菌)、真菌(諸如被孢霉屬)、酵母(諸如酵母屬(Saccharomyces))、或纖毛蟲(諸如豆形蟲屬)或藻類(如褐指藻)中重組表達(dá)產(chǎn)生。本發(fā)明的分離PSE或其部分也可參與劍葉蘚、疫霉屬、隱甲藻類或破囊壺菌的細(xì)胞膜合成所需化合物的代謝或參與分子跨過這些膜的轉(zhuǎn)運。在優(yōu)選的實施方案中，該蛋白質(zhì)或其部分包含與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的氨基酸序列具有足夠同源性的氨基酸序列，以使該蛋白質(zhì)或其部分保留參與劍葉蘚、疫霉屬、隱甲藻類或破囊壺菌的細(xì)胞膜合成所需化合物的代謝能力或保留參與分子跨過這些膜的轉(zhuǎn)運能力。該蛋白質(zhì)的部分優(yōu)選地為此處所述的生物活性部分。又在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的PSE具有SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12中所示的氨基酸序列之一。又在一個優(yōu)選的實施方案中，PSE具有由與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的核苷酸序列例如在嚴(yán)格的雜交條件下雜交的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。還在另一個優(yōu)選的實施方案中，PSE具有這樣的由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的氨基酸序列之一具有至少約50至6O％，優(yōu)選地至少約60至70％，更優(yōu)選地至少約70至80％、80至90％、90至95％，且更優(yōu)選地至少約96％、97％、98％、99％或更高的同源性。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的PSE優(yōu)選地也具有至少一個此處描述的PSE活性。例如，本發(fā)明優(yōu)選的一種PSE包含由與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11的核苷酸序列例如在嚴(yán)格的雜交條件下雜交的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，且該PSE可參與劍葉蘚、疫霉屬、隱甲藻類或破囊壺菌的細(xì)胞膜合成所需化合物的代謝或參與分子跨過這些膜的轉(zhuǎn)運，并能延伸一種或多種具有至少兩個雙鍵且鏈長為C16或C18的多不飽和脂肪酸。在另一個實施方案中，PSE基本上與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的氨基酸序列同源，并保留SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12序列之一的蛋白質(zhì)的功能活性，正如上述部分I所詳述的，由于自然變異或誘發(fā)突變，它們的氨基酸序列是不同的。在一個進(jìn)一步的實施方案中，PSE因此為包含這樣的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，該氨基酸序列與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的全長氨基酸序列具有至少約50至6O％，優(yōu)選地至少約60至70％，更優(yōu)選地至少約70至80％、80至90％、90至95％，且最優(yōu)選地至少約96％、97％、98％、99％或更高的同源性，且具有至少一種此處描述的PSE活性。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及全長的劍葉蘚、疫霉屬、隱甲藻類或破囊壺菌蛋白質(zhì)，它們基本上與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12的全長氨基酸序列同源。PSE的生物活性部分包含含有這樣的氨基酸序列的肽，其中所述氨基酸序列衍生于PSE的氨基酸序列，例如在SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10和SEQIDNO12中所示的氨基酸序列，PSE的生物活性部分或包含與PSE同源的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其中肽具有的氨基酸少于全長的PSE或者肽為全長的與PSE同源的蛋白質(zhì)且具有至少一種PSE活性。生物活性部分(肽，例如具有長為如5個、10個、15個、20個、30個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、50個、100個或更多氨基酸的肽)通常包含具有至少一種PSE活性的一個結(jié)構(gòu)域或一個基序。而且，可通過重組技術(shù)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的其它區(qū)被刪除的其它生物活性部分，并研究有關(guān)的此處描述的一種或多種活性。PSE的生物活性部分優(yōu)選地包含具有生物活性的一個或多個所選擇結(jié)構(gòu)域/基序或其一部分。此類結(jié)構(gòu)域和基序中的一些結(jié)構(gòu)域和基序可通過如使用計算機輔助方法進(jìn)行序列分析而鑒定。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的序列包含如KK基序。Kermode1996，植物科學(xué)評論(CriticalReviewsinPlantSciences)15(4)285-423，描述了KK基序，其為兩個賴氨酸，發(fā)現(xiàn)其主要為KKXX或KXKXXX基序且其影響從ER至高爾基體的再循環(huán)并因此影響蛋白質(zhì)及其酶活性在特定位置尤其是在ER的滯留時間。例如在Δ12-去飽和酶中也發(fā)現(xiàn)了雙賴氨酸基序(Arondel等人1992，科學(xué)2581353)，并且它們也存在于本發(fā)明的延伸酶中。已描述了可定位于C-末端的特定基序。在本發(fā)明的序列中，C-末端存在明顯的賴氨酸聚集。蘚類植物延伸酶PSE1C-末端KQKGAKTESEQIDNO2KTKKASEQIDNO4KKSTPAAKKTNSEQIDNO6KHLK這些可為可能的基因變異。存在影響在ER或于ER中靶向、尋址或定位的Lys基團(tuán)。在C-末端的末端附近遮蔽、修飾或空間修飾該序列，如與GFP“綠色熒光蛋白”融合可用于影響區(qū)室化。優(yōu)選地通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生PSEs。例如將編碼蛋白質(zhì)的核酸分子克隆入表達(dá)載體(如上所述)，將該表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞(如上所述)，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)該PSE。然后通過合適的純化方案，用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)可從細(xì)胞分離PSE。作為重組表達(dá)的替代方法，可通過標(biāo)準(zhǔn)的肽合成技術(shù)化學(xué)合成PSE、PSE多肽或PSE肽。而且，可用如抗PSE抗體從細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞)中分離天然的PSE，其中所述抗PSE抗體可利用本發(fā)明的PSE或其片段通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生。本發(fā)明也提供了嵌合的PSE蛋白質(zhì)或PSE融合蛋白質(zhì)。如在本上下文中所用，“嵌合的PSE蛋白質(zhì)”或“PSE融合蛋白質(zhì)”包含與非PSE多肽功能性連接的PSE多肽。”PSE多肽”指具有對應(yīng)于PSE的氨基酸序列的多肽，而“非PSE多肽”指具有對應(yīng)于基本上不與PSE同源的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的多肽，例如不同于PSE的且來自同一生物或另一生物的蛋白質(zhì)。在融合蛋白質(zhì)中，應(yīng)明白術(shù)語“功能性連接”是指PSE多肽和非PSE多肽以某種方式相互連接，從而使兩種序列執(zhí)行預(yù)測的功能，其中所述功能是所用序列所具有的?？蓪⒎荘SE多肽融合至PSE多肽的N末端或C末端。在一個實施方案中融合蛋白質(zhì)為例如GST-PSE融合蛋白質(zhì)，其中PSE序列融合在GST序列的C末端。這些融合蛋白質(zhì)可使重組PSEs的純化變得容易。在又一個實施方案中，融合蛋白質(zhì)為在其N末端具有異源信號序列的PSE。在某些宿主細(xì)胞中(如哺乳動物宿主細(xì)胞)，通過使用異源信號序列可提高PSE的表達(dá)和/或分泌。通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合PSE蛋白質(zhì)或PSE融合蛋白質(zhì)。例如用常規(guī)技術(shù)將編碼不同多肽序列的DNA片段以正確的閱讀框架相互連接，其中所述常規(guī)技術(shù)如通過使用平末端或粘性末端用于連接，限制性酶切割以提供合適的末端，補平粘末端，如所需要的用堿性磷酸酶處理以避免不想要的連接，并進(jìn)行酶連接反應(yīng)。在又一個實施方案中，可用常規(guī)技術(shù)包括DNA合成儀合成融合基因。另一種方法是，用錨定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴增，這樣在連續(xù)的基因片段之間產(chǎn)生互補的突出端，它們接下來可雜交并再次擴增以產(chǎn)生嵌合的基因序列(參見例如，分子生物學(xué)最新方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，Ausubel等人編輯，JohnWiley&Sons1992)。并且大量的編碼融合單元(如GST多肽)的表達(dá)載體可通過商業(yè)途徑獲得?？蓪⒕幋aPSE的核酸克隆入此類表達(dá)載體，從而將融合單元以正確的閱讀框連接至PSE蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^誘變(如通過特定的點突變)或截短PSE產(chǎn)生PSE同系物。在本上下文中所用術(shù)語“同系物”是指PSE的變體形式，其為PSE活性的激動劑或拮抗劑。PSE激動劑可基本上保留與PSE相同的活性或保留PSE的一些生物活性。PSE拮抗劑可抑制天然存在的PSE形式的一種或多種活性，如通過競爭性結(jié)合用于包含PSE的細(xì)胞膜成分的代謝級聯(lián)的上游或下游因子，或通過結(jié)合于介導(dǎo)化合物通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運的PSE，從而抑制轉(zhuǎn)運。在另一個實施方案中，可通過篩選PSE突變體(如截短的突變體)的組合文庫來鑒定與PSE激動劑或PSE拮抗劑活性相關(guān)的PSE同系物。在一個實施方案中，通過組合誘變在核酸水平產(chǎn)生PSE變體的多樣化文庫并且該文庫由多樣化基因文庫編碼。可例如通過將合成的寡核苷酸混合物酶連接為基因序列從而產(chǎn)生PSE變體的多樣化文庫，這樣可以單一多肽或另外地以一組較大的融合蛋白質(zhì)(如用于噬菌體展示)表達(dá)一系列簡并的可能的PSE序列，其中所述一組較大的融合蛋白質(zhì)包含該組PSE序列。有多種方法可用于產(chǎn)生來自簡并寡核苷酸序列的潛在PSE同系物的文庫?？捎肈NA合成儀化學(xué)合成簡并的基因序列，然后將合成的基因連接入合適的表達(dá)載體。一系列簡并基因的使用使得在混合物中提供了編碼目標(biāo)系列的潛在PSE序列的所有序列。合成簡并寡核苷酸的方法為本領(lǐng)域公知[參見如Narang，S.A.(1983)四面體(Tetrahedron)393；Itakura等人.(1984)生物化學(xué)年鑒(Annu.Rev.Biochem.)53323；Itakura等人，(1984)科學(xué)1981056；Ike等人(1983)核酸研究11477]。此外，可使用PSE片段的文庫來產(chǎn)生PSE片段的多樣化群體，用于篩選和用于接下來PSE同系物的選擇。在一個實施方案中，編碼序列的片段文庫可通過用核酸酶處理編碼PSE序列的雙鏈PCR片段，其中核酸酶的處理條件為每分子約只發(fā)生一次雙鏈斷裂，然后變性該雙鏈DNA，重新復(fù)性DNA，形成包含多種雙鏈斷裂產(chǎn)物的有義/反義對雙鏈DNA，對新形成的雙鏈通過用S1核酸酶處理去除單鏈部分，并將所得的片段文庫連接入表達(dá)載體。該方法使得可得到編碼PSEs的N-末端、C-末端和多種大小內(nèi)在片段的表達(dá)文庫。一些用于在已通過點突變或截短產(chǎn)生的組合文庫中篩選基因產(chǎn)物的技術(shù)以及一些用于篩選cDNA文庫，以獲得具選擇特性的基因產(chǎn)物的技術(shù)為本領(lǐng)域公知?？刹捎眠@些技術(shù)以快速篩選通過對PSE同系物重組誘變產(chǎn)生的基因文庫。用于篩選大基因庫的、可進(jìn)行高通量分析的最常用技術(shù)通常包含將基因文庫克隆入可復(fù)制表達(dá)載體，用所得的載體文庫轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，以及在一定條件下表達(dá)組合基因，在此期間對目標(biāo)活性的檢測促進(jìn)了對編碼該基因的、已檢測其產(chǎn)物的載體的分離。遞歸整體誘變(REM)為一項在文庫中增加功能突變體頻率的新技術(shù)，可與篩選測試法結(jié)合用于鑒定PSE同系物[Arkin和Yourvan(1992)美國國家科學(xué)院院報897811-7815；Delgrave等人(1993)蛋白質(zhì)工程(ProteinEngineering)6(3)327-331]。也可有利地使用上述方法的結(jié)合。改變酶的催化活性或編碼它們的基因的其它公知技術(shù)為基因改組(參見例如WO97/20078或WO98/13487)，該技術(shù)為基因片段的組合，其中這種新的組合可另外地通過錯誤聚合酶鏈反應(yīng)而變化，從而產(chǎn)生欲測試序列的高多樣性。然而，使用此類方法的先決條件是用于測試所得基因功能上具多樣性的合適篩選系統(tǒng)。確定一種或多種PUFA-依賴的酶活性的篩選方法尤其是篩選延伸酶活性的先決條件。至于具PUFAs特異性的延伸酶活性，可在通過公知的轉(zhuǎn)化技術(shù)用目標(biāo)基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的毛霉菌屬中利用在存在有毒代謝物(此處為水楊酸或水楊酸衍生物)時花生四烯酸的毒性(Eroshin等人，Mikrobiologiya，第65卷，第1章，1996，31-36頁)，以進(jìn)行基于生長的初次篩選。然后通過氣相色譜法和質(zhì)譜法分析所得克隆的脂類組成，以鑒定起始材料和產(chǎn)物的性質(zhì)和數(shù)量。在一個進(jìn)一步的實施方案中，可使用基于細(xì)胞測試法，用本領(lǐng)域公知的其它方法來分析多樣化PSE文庫。在一個進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合至本發(fā)明的多肽或其此類蛋白質(zhì)的一部分(如表位)的抗體。本發(fā)明的抗體可用于鑒定和分離其它延伸酶，尤其是PSEs。這些抗體可為單克隆抗體、多克隆抗體或合成抗體，也可為這些抗體的片段，如Fab、Fv或scFV片段等。如通過Khler和Milstein在自然256(1975)，485，以及Galfr在酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.)73(1981)中最早描述的那些方法可制備單克隆抗體。也可根據(jù)如Harlow&Lane，“抗體，實驗室手冊”(“Antibodies，aLaboratoryManual”)，CSHPress，冷泉港，1988來制備抗體及其片段。這些抗體可用于參與和定位如本發(fā)明的蛋白質(zhì)，或用于如在重組生物體中監(jiān)測這些蛋白質(zhì)的合成，以及用于鑒定與本發(fā)明蛋白質(zhì)相互作用的化合物。在許多情況下，抗體與抗原的結(jié)合等同于與其它配體和抗配體的結(jié)合。本發(fā)明還涉及用于鑒定延伸酶(尤其是PSEs)的激動劑或拮抗劑的方法，具體地說包含a)將表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞與侯選物質(zhì)結(jié)合；b)測試PSE活性；c)將PSE活性與缺少侯選物質(zhì)時的標(biāo)準(zhǔn)活性比較，當(dāng)PSE活性高于標(biāo)準(zhǔn)活性表明侯選物質(zhì)為激動劑，PSE活性低于標(biāo)準(zhǔn)活性表明侯選物質(zhì)為拮抗劑。所提及的侯選物質(zhì)可為化學(xué)合成的物質(zhì)或為微生物學(xué)地產(chǎn)生的物質(zhì)，后者存在于如植物、動物或微生物的細(xì)胞提取物中。所提及的侯選物質(zhì)進(jìn)一步地可為現(xiàn)有技術(shù)所公知的但至今對其增加或抑制PSEs活性還為未知。反應(yīng)混合物可為無細(xì)胞提取物或可包含細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。合適的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知并以綜合的方式進(jìn)行了描述，如Alberts，細(xì)胞的分子生物學(xué)(MolecularBiologyofthecell)，第三版(1994)，第17章?？蓪⑺峒拔镔|(zhì)如加至反應(yīng)混合物或培養(yǎng)介質(zhì)，或注射入細(xì)胞或噴灑在植物上。根據(jù)本發(fā)明的方法，如果已鑒定出包含有活性物質(zhì)的樣本，接下來可直接從最初的樣本中直接分離該物質(zhì)，或當(dāng)樣本由大量不同成分組成時，可將該樣本分成多組，以減少每個樣本中的不同物質(zhì)數(shù)，然后用最初樣本的此類“子樣本”重復(fù)本發(fā)明的方法。根據(jù)樣本的復(fù)雜性，可多次重復(fù)上述步驟，優(yōu)選地直至用本發(fā)明的方法鑒定的樣本只包含少量的物質(zhì)或只包含一種物質(zhì)。用本發(fā)明的方法鑒定的物質(zhì)或其衍生物優(yōu)選地進(jìn)一步制備，以使它們適用于植物繁育或植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)。用本發(fā)明的方法可鑒定和測試的物質(zhì)為表達(dá)文庫(如cDNA表達(dá)文庫)、肽、蛋白質(zhì)、核酸、抗體、小的有機物、激素、PNAs等(Milner，自然醫(yī)藥(NatureMedicin)1(1995)，879-880；Hupp，細(xì)胞(Cell)83(1995)，237-245；Gibbs，細(xì)胞79(1994)，193-198以及其中所應(yīng)用的文獻(xiàn))。這些物質(zhì)也可為公知的抑制劑或活化劑的功能衍生物或類似物。制備化學(xué)衍生物或類似物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知?？捎卯?dāng)前技術(shù)中的方法測試公知的衍生物和類似物。進(jìn)一步可使用計算機輔助設(shè)計或肽模擬物來制備合適的衍生物和類似物。用于本發(fā)明方法的細(xì)胞或組織優(yōu)選地為如上述實施方案中所描述的本發(fā)明的宿主細(xì)胞、植物細(xì)胞或植物組織。對應(yīng)地，本發(fā)明也涉及用上述的本發(fā)明方法所鑒定的物質(zhì)。該物質(zhì)為如本發(fā)明PSE的同系物?？赏ㄟ^誘變?nèi)鏟SE的點突變或刪除產(chǎn)生PSEs的同系物。此處術(shù)語“同系物”用于指PSEs的變體形式，其起PSE活性的激動劑或拮抗劑作用。激動劑可基本上具有相同的或一部分的PSEs生物活性。PSEs的拮抗劑可抑制天然存在的PSEs形式的一種或多種活性，如競爭性與脂肪酸合成(包括PSEs)代謝途徑的下游或上游分子結(jié)合或與PSEs結(jié)合，并減少或抑制該過程中的活性。因此，本發(fā)明也涉及此處描述的抑制本發(fā)明PSEs活性的抗體或其片段。本發(fā)明的一方面涉及特異性識別或結(jié)合至本發(fā)明的上述激動劑或拮抗劑的抗體。另一方面涉及包含用本發(fā)明方法鑒定的抗體、終止分子或反義分子的組合物。E.本發(fā)明的用途和方法此處所述的核酸分子、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)同系物、融合蛋白質(zhì)、抗體、引物、載體和宿主細(xì)胞可用于下列一種或多種方法鑒定展葉劍葉蘚、隱甲藻類、致病疫霉或破囊壺菌及相關(guān)生物；與劍葉蘚、疫霉屬、隱甲藻類或破囊壺菌相關(guān)的生物的基因組圖譜；鑒定和定位劍葉蘚、疫霉屬、隱甲藻類或破囊壺菌的目標(biāo)序列；進(jìn)化研究；確定發(fā)揮功能所需的PSE蛋白質(zhì)區(qū)域；調(diào)節(jié)PSE活性；調(diào)節(jié)一種或多種細(xì)胞膜成分的代謝；調(diào)節(jié)一種或多種化合物的跨膜轉(zhuǎn)運，以及調(diào)節(jié)目標(biāo)化合物如精細(xì)化學(xué)品的細(xì)胞產(chǎn)量。本發(fā)明的PSE核酸分子具有多種用途。首先，它們可用于鑒定生物如劍葉蘚、疫霉屬、隱甲藻類或破囊壺菌或它們的近親。它們也可用于在微生物混合群體中鑒定劍葉蘚、隱甲藻類、疫霉屬或破囊壺菌或它們的親緣生物體的存在。本發(fā)明提供了劍葉蘚、疫霉屬、隱甲藻類或破囊壺菌的一系列基因的核酸序列；通過在嚴(yán)格條件下用探針篩選提取自微生物的均一或混合群體培養(yǎng)物的基因組DNA，可確定這類生物體的存在或缺乏，其中所述探針對這類生物體是獨特的、覆蓋了劍葉蘚、隱甲藻類、疫霉屬或破囊壺菌基因的一個區(qū)域或該基因的部分區(qū)域。劍葉蘚、隱甲藻類、疫霉屬或破囊壺菌本身可用作多不飽和脂肪酸的商業(yè)生產(chǎn)。而且，本發(fā)明的核酸也適用于于其它生物中生產(chǎn)PUFAs，尤其當(dāng)所得到的PUFAs摻入三?；视筒糠謺r。進(jìn)一步地，本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)分子可用作基因組特定區(qū)域的標(biāo)記物。它們不僅適用于繪制基因組圖譜，也適用于劍葉蘚、疫霉屬、隱甲藻類或破囊壺菌蛋白質(zhì)的功能研究。為鑒定劍葉蘚、隱甲藻類、疫霉屬或破囊壺菌的某個DNA-結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的基因組區(qū)域，如可將劍葉蘚、隱甲藻類、疫霉屬或破囊壺菌的基因組片斷化并將片段與DNA-結(jié)合蛋白質(zhì)孵育。那些結(jié)合蛋白質(zhì)的片段可另外用本發(fā)明的核酸分子篩選，優(yōu)選地用易于檢測的標(biāo)記物；此類核酸分子與基因組片斷的結(jié)合使得在劍葉蘚、疫霉屬、隱甲藻類或破囊壺菌的基因組圖譜上定位該片段成為可能，如果該過程是用不同的酶反復(fù)進(jìn)行的話，則使得蛋白質(zhì)結(jié)合的核酸序列易于快速確定。而且，本發(fā)明的核酸分子可與相關(guān)種類的序列具有足夠的同源性，這些核酸分子可作為標(biāo)記物用于在相關(guān)的真菌或藻類構(gòu)建基因組圖譜。本發(fā)明的PSE核酸分子也適用于進(jìn)化研究和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究。大量的原核和真核細(xì)胞利用本發(fā)明分子所參與的代謝和轉(zhuǎn)運過程；可通過將本發(fā)明核酸分子的序列與來自其它生物的編碼相似酶的核酸分子序列比較來確定生物相關(guān)性的進(jìn)化程度。另外，此類比較使得可確定哪些序列區(qū)域保守和哪些序列區(qū)域不保守，這對于確定酶功能必需的蛋白質(zhì)區(qū)域是有用的。這種確定對蛋白質(zhì)工程研究是有價值的，且可提供多大程度的誘變是蛋白質(zhì)可耐受的且不喪失其功能的線索。對本發(fā)明PSE核酸分子的操作可導(dǎo)致與野生型PSEs功能不同的PSEs產(chǎn)生?？商岣哌@些蛋白質(zhì)的效率或活性；它們可在細(xì)胞內(nèi)以較通常大的量存在；或可降低它們的效率或活性。提高的效率或活性是指如酶具有較高的選擇性和/或活性，優(yōu)選地與原始酶比較活性至少高10％，非常特別地活性至少高20％，非常特別優(yōu)選地活性至少高30％。存在一系列這樣的機制，對本發(fā)明PSE的改變通過這些機制可直接影響包含此類改性蛋白質(zhì)的精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)量、生產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率。當(dāng)纖毛蟲、藻類或真菌的細(xì)胞分泌目標(biāo)化合物時，從它們的培養(yǎng)物中大規(guī)模獲得的精細(xì)化學(xué)品明顯提高，因為這些化合物易于從培養(yǎng)介質(zhì)中分離(與從單位體積的培養(yǎng)細(xì)胞的提取大不相同)。另外，當(dāng)細(xì)胞在體內(nèi)以一種濃縮機制于特異區(qū)貯存化合物時，可提高純化。在表達(dá)PSEs的植物中，提高的轉(zhuǎn)運可導(dǎo)致在植物組織和植物器官中較好的分布。提高將精細(xì)化學(xué)品轉(zhuǎn)運出細(xì)胞的轉(zhuǎn)運蛋白分子的數(shù)量或活性可導(dǎo)致在胞外介質(zhì)中存在的精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)生量提高，從而促進(jìn)收獲和純化，或在為植物的情況下，促進(jìn)更有效的分布。與之相比，合適生物合成途徑的輔因子、前體分子和中間體的量的增加為一種或多種精細(xì)化學(xué)品的有效超量產(chǎn)生所需要。增加參與營養(yǎng)物質(zhì)如碳源(即糖類)、氮源(即氨基酸、銨鹽)磷酸鹽和硫輸入的轉(zhuǎn)運蛋白的數(shù)量和/或活性可提高精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)量，因為它去除了對生物合成過程中可利用的營養(yǎng)物質(zhì)的所有限制。希望脂肪酸如PUFAs和包含PUFAs的脂類為精細(xì)化學(xué)品自身。優(yōu)化參與這些化合物生物合成的本發(fā)明的一種或多種PSEs的活性或增加其量或破壞參與這些化合物分解的一種或多種PSEs的活性可因此增加纖毛蟲、藻類、植物、真菌、酵母或其它微生物中脂肪酸和脂類分子的產(chǎn)量、生產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率。對本發(fā)明的一種或多種PSE基因的操作同樣可導(dǎo)致活性改變的PSEs，其間接影響一種或多種來自藻類、植物、纖毛蟲或真菌的目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)生。正常的生物化學(xué)代謝過程導(dǎo)致如多種廢物的產(chǎn)生(如過氧化氫和其它反應(yīng)性氧類)，它們可活躍地破壞這些代謝過程[如已知過亞硝酸鹽硝化酪氨酸側(cè)鏈，因此滅活一些在活性中心具酪氨酸的酶；Groves，J.T.(1999)化學(xué)與生物學(xué)最新觀點(Curr.Opin.Chem.Biol.)3(2)；226-235]。雖然這些廢物為正常分泌的，但用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞是被優(yōu)化用于使一種或多種精細(xì)化學(xué)品超量產(chǎn)生的，故可產(chǎn)生較野生型細(xì)胞多的廢物。優(yōu)化參與廢物分子輸出的本發(fā)明的一種或多種PSEs的活性使得細(xì)胞的存活力提高，并維持有效的代謝活性。同樣，目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的高胞內(nèi)量的存在實際上對細(xì)胞是毒性的，因此可通過提高細(xì)胞分泌這些化合物的能力來提高細(xì)胞的存活力。進(jìn)一步地，本發(fā)明的PSEs可以某種方式操作，使多種脂類和脂肪酸分子的相對量改變。這對細(xì)胞膜的脂類組成有決定性影響。因為每種脂類的類型具有不同的物理性質(zhì)，膜脂類組成的改變可顯著影響膜的流動性。膜流動性的改變可影響分子跨過這些膜的轉(zhuǎn)運，如上所說明的那樣這可改變所產(chǎn)生的廢物或精細(xì)化學(xué)品的輸出或所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的輸入。膜流動性的這些改變也可對細(xì)胞的完整性具有決定性影響；具有相對較弱的膜的細(xì)胞對可損壞或殺死細(xì)胞的非生物和生物應(yīng)激條件較易感。操作參與用于膜合成的脂肪酸和脂類產(chǎn)生的PSEs，以使所得的膜具有對在培養(yǎng)中占優(yōu)勢的、用于產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的環(huán)境條件較易感的膜組成，使得更多的細(xì)胞存活和增殖。較大量的生產(chǎn)細(xì)胞應(yīng)表觀為在培養(yǎng)物中具有較高的精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)量、較高的生產(chǎn)率或較高的生產(chǎn)效率。意在導(dǎo)致精細(xì)化學(xué)品產(chǎn)量提高的上述PSEs誘變策略不是用于構(gòu)成限制；這些策略的變化對技術(shù)人員是很明顯的。使用這些機制，并在此處公開的機制的輔助下，本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)分子可用于產(chǎn)生表達(dá)突變PSE核酸和蛋白質(zhì)分子的藻類、纖毛蟲、植物、動物、真菌或其它微生物如谷氨酸棒桿菌，以提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)量、生產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率。該目標(biāo)化合物可為藻類、纖毛蟲、植物、動物、真菌或細(xì)菌的任一天然產(chǎn)物，后者包含生物合成途徑的終產(chǎn)物和天然存在的代謝途徑的中間體，或也可為在這些細(xì)胞的代謝中非天然存在的、但由本發(fā)明的細(xì)胞產(chǎn)生的分子。本發(fā)明的進(jìn)一步的實施方案是用于產(chǎn)生PUFAs的方法，其包含培養(yǎng)含有本發(fā)明的核酸、本發(fā)明的基因構(gòu)建體或本發(fā)明的載體的生物，其中所述本發(fā)明的核酸、本發(fā)明的基因構(gòu)建體或本發(fā)明的載體在生物體產(chǎn)生PUFAs的條件下編碼對脂肪酸分子中具有至少兩個雙鍵的C16-、C18-或C20-脂肪酸延伸至少兩個碳原子的多肽。該方法制備的PUFAs可通過從生物體所生長的培養(yǎng)物中或從田間收獲生物體而分離，并用有機溶劑破壞和/或提取收獲的材料?？蓮脑撊軇┲蟹蛛x含有較高PUFA含量的脂類、磷脂、神經(jīng)鞘脂類、糖脂、三?；视秃?或游離脂肪酸的油。可通過堿或酸水解脂類、磷脂、神經(jīng)鞘脂類、糖脂和三?；视蛠矸蛛x具有較高PUFA含量的游離脂肪酸。較高含量的PUFAs是指與原始的不具有其它的編碼本發(fā)明延伸酶的核酸的生物體相比，PUFAs多出至少5％，優(yōu)選地10％，尤其優(yōu)選地20％，非常尤其優(yōu)選地40％。通過該方法產(chǎn)生的PUFAs優(yōu)選地在脂肪酸分子中具有至少兩個雙鍵的C18-、C20-或C22-脂肪酸分子，優(yōu)選地具有三個、四個、五個或六個雙鍵，尤其優(yōu)選地三個或五個雙鍵。這些C18-、C20-或C22-脂肪酸分子可從生物中以油、脂類或游離脂肪酸形式分離。合適生物的實例為上述提及的那些。優(yōu)選的生物為微生物、動物或植物，尤其優(yōu)選植物或藻類，非常尤其優(yōu)選轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的一個實施方案為通過上述方法制備的油類、脂類或脂肪酸或其部分，尤其優(yōu)選包含PUFAs并產(chǎn)生自轉(zhuǎn)基因植物的油、脂類或脂肪酸組合物。本發(fā)明的一個實施方案為通過本發(fā)明的方法制備的油類、脂類或脂肪酸。本發(fā)明的其它實施方案為包含通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的PUFAs并衍生自含有本發(fā)明的核酸、基因構(gòu)建體或載體的轉(zhuǎn)基因植物的油、脂類或脂肪酸組合物。本發(fā)明進(jìn)一步的實施方案是油、脂類或脂肪酸組合物在飼料、食品、化妝品或藥品中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步的實施方案涉及試劑盒，其包含本發(fā)明的核酸、本發(fā)明的基因構(gòu)建體、本發(fā)明的氨基酸序列、本發(fā)明的反義核酸分子、本發(fā)明的抗體和/或組合物、通過本發(fā)明的方法制備的拮抗劑或激動劑和/或本發(fā)明的油類、脂類和/或脂肪酸或其部分。該試劑盒也可包含本發(fā)明的宿主細(xì)胞、生物體或植物或其一部分，本發(fā)明的植物的一部分可收獲或為繁殖材料，或為本發(fā)明的拮抗劑或激動劑?？蓪⒈景l(fā)明之試劑盒的成分例如一起或在緩沖液或其它溶液中包裝在合適的容器中。可將所提及的一種或多種成分包裝入同一個容器中。另外，可將所提及的一種或多種成分例如吸附在固體表面，其中所述固體如硝酸纖維素濾膜、玻璃平板、小片、尼龍膜或微滴定板。該試劑盒可用于此處描述的任一方法和實施方案，如用于產(chǎn)生宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物，用于檢測同源序列，用于鑒定拮抗劑或激動劑等。而且試劑盒可包含如何使用該試劑盒用于所提及的應(yīng)用之一的說明書。本發(fā)明將在下面通過實施例進(jìn)行更詳細(xì)的闡述，其不用于構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在此專利申請中所引用的所有文獻(xiàn)、專利申請、專利和公開的專利申請的內(nèi)容并入此文中作為參考。實施例實施例1一般方法a)一般克隆方法克隆方法例如限制性切割、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段純化、將核酸轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜和尼龍膜、DNA片段的連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌和酵母細(xì)胞、細(xì)菌培養(yǎng)及重組DNA的序列分析如Sambrook等人[(1989)，冷泉港實驗室出版社ISBN0-87969-309-6]或Kaiser、Michaelis和Mitchell[(1994)，“酵母遺傳學(xué)方法”(“MethodsinYeastGenetics”)，冷泉港實驗室出版社ISBN0-87969-451-3]所述進(jìn)行。藻類如小球藻屬(Chlorella)或褐指藻的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)如El-Sheekh[(1999)，植物生物學(xué)(BiologiaPlantarum)42209-216]或Apt等人[(1996)分子和普通遺傳學(xué)(MolecularandGeneralGenetics)252(5)872-9]所述進(jìn)行。b)化學(xué)藥品除非在文中特別指出，所用化學(xué)藥品為從Fluka(Neu-Ulm)、Merck(Darmstadt)、Roth(Karlsruhe)、Serva(Heidelberg)和Sigma(Deisenhofen)獲得的分析級質(zhì)量。用純的無熱原水制備溶液，其中純的無熱原水在下文中用H2O表示，其來自Milli-Q水系統(tǒng)水純化單元(Millipore，Eschborn)。限制性內(nèi)切酶、DNA-修飾酶和分子生物學(xué)試劑盒從AGS(Heidelberg)、Amersham(Brunswick)、Biometra(Gttingen)、Boehringer(Mannheim)、Genomed(BadOeynhausen)、NewEnglandBiolabs(Schwalbach/Taunus)、Novagen(Madison，Wisconsin，USA)、Perkin-Elmer(Weiterstadt)、Pharmacia(Freiburg)、Qiagen(Hilden)和Stratagene(Amsterdam，Netherlands)獲得。除非特別指出，按廠商的說明書使用它們。c)細(xì)胞材料用破囊壺菌菌株進(jìn)行本研究時，所述菌株可由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，其菌株編號為ATCC26185(破囊壺菌)，或當(dāng)用隱甲藻類進(jìn)行本研究時，所述菌株可由Provasoli-GuillardNationalCenterforCultureofMarinePhytoplankton((CCMP)WestBoothbayHarbour，ME，USA)獲得，其菌株培養(yǎng)物編號為No.CCMP316。藻類在攝氏25度下、暗處培養(yǎng)于從底部通入空氣的玻璃管中。另外，破囊壺菌可在Singh&Ward(1997，微生物學(xué)進(jìn)展(AdvancesinMicrobiology)，45，271-311)中詳述的條件下培養(yǎng)。用于隱甲藻類的培養(yǎng)基為Guillard，R.R.L.的補充有10％有機介質(zhì)的f/2培養(yǎng)基[1975；在Smith，W.L.和Chanley，M.H.(編輯)海中無脊椎動物的培養(yǎng)(CultureofmarineInvertebrateanimals)，NYPlenumPress一書中的培養(yǎng)浮游植物用于喂養(yǎng)海中無脊椎動物(Cultureofphytoplanktonforfeedingmarineinvertebrates)，29-60頁]。它含有995.5ml(人工)鹽水、1mlNaNO3(75g/l)、1mlNaH2PO4(5g/l)、1ml痕量金屬溶液、1mlTris/ClpH8.0、0.5mlf/2維生素溶液。痕量金屬溶液Na2EDTA(4.36g/l)、FeCl3(3.15g/l)，主要痕量金屬CuSO4(10g/l)、ZnSO4(22g/l)、CoCl2(10g/l)、MnCl2(18g/l)、NaMoO4(6.3g/l)f/2維生素溶液生物素10mg/l、硫胺素200mg/l、維生素B120.1mg/l有機培養(yǎng)基醋酸鈉(1g/l)、葡萄糖(6g/l)、琥珀酸鈉(3g/l)、細(xì)菌用胰蛋白胨(4g/l)、酵母提取物(2g/l)d)蘚類植物材料(＝植物材料)本研究使用了展葉劍葉蘚劍葉蘚屬(Physcomitrellapatens(Hedw.)B.S.G.)植物，其來自漢堡大學(xué)(UniversityofHamburg)的遺傳研究室的收藏物。它們衍生自16/14株，后者已由H.L.K.Whitehouse收藏在GransdenWood，Huntingdonshire(英國)并由Engel(1968，AmJBot55，438-446)進(jìn)行了始于孢子的傳代培養(yǎng)。植物借助于孢子和配子體的再生繁殖。原絲體從單倍體孢子發(fā)育為富含葉綠體的綠絲體和耗竭葉綠體的莖絲體，它們在約12天后發(fā)芽。這些芽長成具有造精器和造卵器的配子托。受精產(chǎn)生具有短剛毛和孢子囊的二倍體孢子體，減數(shù)分裂后的孢子在其中成熟。e)植物培養(yǎng)在人工氣候箱中于空氣溫度為25℃，光強度為55μmol.s-1.m-2(白光；PhilipsTL65W/25熒光管)以及16/8小時的光照/黑暗時段下培養(yǎng)植物。蘚類植物用Reski和Abel改良克諾普培養(yǎng)基于液體培養(yǎng)物中培養(yǎng)(1985，Planta165，354-358)或用1％Oxoid瓊脂(Unipath，Basingstoke，英國)在固體克諾普培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在充滿空氣的液體培養(yǎng)物中培養(yǎng)用于RNA和DNA分離的原絲體。每隔9天將原絲體搗碎并轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中。f)致病疫霉的培養(yǎng)首先，制備致病疫霉cDNA文庫。為此可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，美國)得到ATCC48886株。作為已描述的ATCC48886株培養(yǎng)方法的變更，其為用冷的雙蒸水洗滌疫霉屬的孢子，并于冰箱放置6小時以誘導(dǎo)孢子形成。然后將材料轉(zhuǎn)移至豌豆培養(yǎng)基。為此將150g深度冷凍豌豆(Iglu，從本地超市得到)和1升水在滅菌條件下高壓滅菌20分鐘。在定軌搖床(200轉(zhuǎn)/分鐘)上將材料室溫下于100-ml-燒瓶中培養(yǎng)。兩天后，過濾2個燒瓶并將過濾殘余物于液氮中用研缽和研杵搗碎，在接下來的4天，重復(fù)該操作，每次2個燒瓶實施例2從植物和微生物如破囊壺菌和隱甲藻類分離總DNA用于雜交實驗分離總DNA的詳情參見對1克鮮重的植物材料的處理。CTAB緩沖液2％(w/v)N-乙酰-N，N，N-三甲基溴化銨(CTAB)；100mMTris-HCl，pH8.0；1.4MNaCl；20mMEDTA。N-十二烷基肌氨酸緩沖液10％(w/v)N-十二烷基肌氨酸；100mMTris-HCl，pH8.0；20mMEDTA。于液氮下，在研缽內(nèi)將植物材料或隱甲藻類或破囊壺菌細(xì)胞材料搗碎，以給出細(xì)粉，并轉(zhuǎn)移入2ml微量離心管。然后用一層1ml分解緩沖液(1mlCTAB緩沖液、100mlN-十二烷基肌氨酸緩沖液、20mlβ-巰基乙醇和10ml蛋白酶K溶液，10mg/ml)覆于凍結(jié)的植物材料上并在不斷振搖下于60℃溫育1小時。將所獲得的勻漿分配至兩個微量離心管2ml)并用等體積的氯仿/異戊醇(241)通過振搖提取兩次。每管于8000xg及RT(＝室溫＝～23℃)下離心15分鐘，以進(jìn)行相的分離。然后用冰冷的異丙醇于-70℃沉淀DNA30分鐘。于4℃10,000g離心沉淀已沉淀的DNA并重懸于180mlTE緩沖液(Sambrook等人，1989，冷泉港實驗室出版社ISBN0-87969-309-6)。用NaCl(終濃度為1.2M)處理該DNA并用兩倍體積的無水乙醇于-70℃再次沉淀30分鐘，以進(jìn)一步純化。在用70％乙醇洗滌一次后，干燥該DNA并接下來置于50mlH2O+RNase(終濃度為50mg/ml)。于4℃過夜溶解該DNA，接下來于37℃進(jìn)行1小時的RNase切割。將該DNA保存在4℃。實施例3從植物和微生物(隱甲藻類和破囊壺菌)分離總RNA和poly(A)+-RNA用Logemann等人(1987，生物化學(xué)紀(jì)事Anal.Biochem.163，21)描述的方法從植物如亞麻籽和油料種子油菜分離總RNA。用GTC法可從原絲體組織獲得來自蘚類植物的總RNA(Reski等人，1994，分子普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)，244352-359)。從隱甲藻類和破囊壺菌分離RNA用冰冷的研缽于液氮中研碎藻類凍結(jié)樣本(-70℃)，以得到細(xì)的粉末。于40-50℃向該凍結(jié)的細(xì)胞粉末中加入2體積均化介質(zhì)(12.024g山梨醇、40.0ml1MTris-HCl，pH9(0.2M)；12.0ml5MNaCl(0.3M)，8.0ml250mMEDTA、761.0mgEGTA、40.0ml10％SDS，加水至200ml，并將pH調(diào)節(jié)至8.5)和4體積含有0.2％巰基乙醇的酚，同時充分混合。然后，加入2體積氯仿并劇烈攪拌該混合物15分鐘。于10,000g離心該混合物10分鐘，并用酚/氯仿(2體積/2體積)、然后用氯仿提取水相。所得的水相體積用1/20體積的4M醋酸鈉(pH6)和1體積的(冰冷)異丙醇處理，并于-20℃沉淀核酸。于10,000g離心該混合物30分鐘，并抽吸取出上清。然后是用70％EtOH的洗滌步驟和又一次的離心步驟。將沉淀置于Tris硼酸鹽緩沖液(80mMTris硼酸鹽緩沖液，10mMEDTA，pH7.0)。然后將上清用1/3體積的8MLiCl處理，混合并于4℃孵育30分鐘。再次離心后，用70％乙醇洗沉淀、離心，并將沉淀溶于不含RNase的水中。用DynaBeads(Dynal，Oslo，芬蘭)按照廠商方法中的說明書分離Poly(A)+-RNA。在測定完RNA或poly(A)+-RNA濃度后，加入1/10體積的3M醋酸鈉，pH4.6和2體積的乙醇沉淀RNA并貯存于-70℃。用甲醛-1.5％強度的瓊脂糖凝膠分離20μgRNA并轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Hybond，Amersham)以進(jìn)行分析。如Amasino((1986)生物化學(xué)紀(jì)事(Anal.Biochem.)152，304))所述檢測特異的轉(zhuǎn)錄本。從致病疫霉分離總RNA和poly-(A)+RNA用RNeasyPlantTotalRNA試劑盒(Quiagen，Milden)和其中含有的緩沖液，按照廠商的說明書獲得總RNA。用來自Promega(Heidelberg)的RNAIsolationSystemIII中的PolyAttract，按照廠商的說明書從這樣獲得的總RNA分離poly-(A)+RNA。實施例4構(gòu)建cDNA文庫分別構(gòu)建來自劍葉蘚、隱甲藻類和破囊壺菌的cDNA文庫，用鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Roche，Mannheim，德國)和oligo-d(T)引物進(jìn)行第一鏈合成，而通過與DNA聚合酶I克列諾酶孵育并用RNAseH于12℃(2小時)、16℃(1小時)和22℃(1小時)切割進(jìn)行第二鏈合成。通過于65℃(10分鐘)孵育然后轉(zhuǎn)移至冰中終止反應(yīng)。用T4DNA聚合酶(Roche，Mannheim)于37℃(30分鐘)使雙鏈DNA分子成為平端。用酚/氯仿提取并用SephadexG50離心柱去除核苷酸。用T4DNA連接酶(Roche，12℃，過夜)將EcoRI/XhoI接頭(Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)連接至cDNA末端，再用XhoI切割，并與多核苷酸激酶(Roche，37℃，30分鐘)孵育磷酸化。于低熔點瓊脂糖凝膠分離該混合物。從凝膠上洗脫超過300個堿基對的DNA分子，用酚提取，在ElutipD柱(Schleicher和Schiill，Dassel，德國)上濃縮，用GigapackGold試劑盒(Stratagene，Amsterdam，荷蘭)使用廠商的材料并按照他們的說明書連接至載體臂上并包裝入λ-ZAPII噬菌體或λ-ZAP-表達(dá)噬菌體。如上所述進(jìn)行致病疫霉cDNA文庫的構(gòu)建。實施例5DNA測序和計算機分析實施例4中所述cDNA文庫用于通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行DNA測序，尤其是使用ABIPRISMBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit(Perkin-Elmer，Weiterstadt，德國)的鏈終止法。在從cDNA文庫制備質(zhì)粒后，對瓊脂平板上的單個隨機克隆通過DH10B體內(nèi)大量切除和再轉(zhuǎn)化測序(詳見材料和方法Stratagene，Amsterdam，荷蘭)。于補充有氨芐青霉素的Luria肉湯(參見Sambrook等人(1989)(冷泉港實驗室出版社ISBN0-87969-309-6))中過夜生長的大腸桿菌培養(yǎng)物中，用QiagenDNA制備試劑盒(Qiagen，Hilden)按照廠商的方法制備質(zhì)粒DNA。使用具有以下核苷酸序列的測序引物5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’5’-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3’5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’使用可從Bio-Max(Munich，德國)購得的EST-MAX標(biāo)準(zhǔn)軟件包處理并記錄序列。利用比較算法和使用搜索序列，用BLAST程序(Altschul等人(1997)“間隔BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索程序”(“GappedBLASTandPSI-BLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprograms”)，核酸研究253389-3402)搜尋同源基因。對與展葉劍葉蘚蘚類植物延伸酶的搜索序列具有同源性的來自隱甲藻類和破囊壺菌的一個序列進(jìn)行了較詳細(xì)的鑒定。實施例6a通過與展葉劍葉蘚Pp_PSE1基因比較，鑒定Tc_PSE1和Tc_PSE2基因(Tc＝破囊壺菌)以及鑒定Cc_PSE1和Cc_PSE2基因(Cc＝寇氏隱甲藻)。本發(fā)明的Pp_PSE1蘚類植物延伸酶的全長序列(名稱又見表2)用于TBLASTN搜尋算法的序列比較MEVVERFYGELDGKVSQGVNALLGSFGVELTDTPTTKGLPLVDSPTPIVLGVSVYLTIVIGGLLWIKARDLKPRASEPFLLQALVLVHNLFCFALSLYMCVGIAYQAITWRYSLWGNAYNPKHKEMAILVYLFYMSKYVEFMDTVIMILKRSTRQISFLHVYHHSSISLIWWAIAHHAPGGEAYWSAALNSGVHVLMYAYYFLAACLRSSPKLKNKYLFWGRYLTQFQMFQFMLNLVQAYYDMKTNAPYPQWLIKILFYYMISLLFLFGNFYVQKYIKPSDGKQKGAKTE.蘚類植物延伸酶Pp_PSE1cDNA的全部核苷酸序列含有約1200bp。它含有873bp的開放讀碼框，其編碼290個氨基酸，計算的分子量為33.4kDa。該蛋白質(zhì)序列與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的一種基因產(chǎn)物(如釀酒酵母PSE1基因產(chǎn)物)只有38.5％的同一性和48.3％的相似性，其中所述釀酒酵母PSE1基因產(chǎn)物為酵母延伸中等鏈長的脂肪酸所需要(Toke&Martin，1996，分離和鑒定釀酒酵母中影響脂肪酸延伸的基因(IsolationandcharacterizationofageneaffectingfattyacidelongationinSaccharomycescerevisiae)，生物化學(xué)雜志(JournalofBiologicalChemistry)271，18413-18422)。在其它侯選基因中，首次將EST序列CC001042041R、TC002034029R和TC002014093R作為靶基因考慮，最初因為它們與展葉劍葉蘚延伸酶(參見表2)PSE1基因的弱同源性而未考慮。圖5給出了Pp_PSE1肽序列與所發(fā)現(xiàn)序列的比較結(jié)果。所比較序列是本發(fā)明SeqIDNO3的核酸的一部分(基因名稱TcPSE1，創(chuàng)建者的數(shù)據(jù)庫號為TC002034029R)。字母表示相同的氨基酸，而加號代表化學(xué)上相似的氨基酸。從表3的總結(jié)中可看出本發(fā)明中所有序列的同一性和同源性。對克隆TC002034029R的全長cDNA片段的測序得到了693個堿基對的序列，其第一個起始堿基位于開放讀碼框中。該序列編碼SeqIDNO4所示的195個氨基酸的多肽，其終止密碼子在堿基對中的位置為SeqIDNO3堿基對位置586-588的翻譯。克隆TC002014093R包含真正的全部延伸酶多肽，這一點可從圖7的序列排列看出。線條代表相同的氨基酸，而冒號和點代表化學(xué)可互換的，即化學(xué)等同的氨基酸。用Henikoff&Henikoff的BLOSUM62氨基酸替換矩陣(aminoacidsubstitutionmatrix)((1992)蛋白質(zhì)模塊中的氨基酸替換矩陣美國國家科學(xué)院院報8910915-10919)進(jìn)行排列，所用參數(shù)為間隔權(quán)重8；平均匹配2.912，長度權(quán)重2，平均失配-2.003。而且，通過序列排列鑒定了第二個EST。Pp_PSE1肽序列與已發(fā)現(xiàn)的序列排列如圖6所示。盡管在所選擇的參數(shù)中同源性限制在幾個氨基酸，這表示了PUFA特異性延伸酶的高度保守區(qū)。因此確定了全長克隆片段的序列?？寺C002014093R的全長cDNA片段的測序得到了955個堿基對的序列，其第一個起始堿基位于開放讀碼框中。參照本發(fā)明的SEQIDNO5。該序列編碼297個氨基酸的多肽，其終止密碼子在堿基對中的位置為對應(yīng)于本發(fā)明SeqIDNO6堿基對位置892-894。在序列PpPSE1的協(xié)助下鑒定了編碼Cc_PSE1基因的寇氏隱甲藻ESTCC001042041R。分離的ESTCC001042041R(顯示與本發(fā)明的SEQIDNO7一致)為708個堿基對長，且具有從第一個堿基開始的642個堿基對的開放讀碼框，編碼214個氨基酸，其終止密碼子的位置為643-645。直至終止子的該氨基酸序列顯示為與本發(fā)明的SEQIDNO8一致。除了與PSE1基因產(chǎn)物的相似性外，也可求助于與釀酒酵母延伸酶(sceelo1P)的相似性，其中所述釀酒酵母延伸酶為酵母延伸中等鏈長的脂肪酸所需要(Toke&Martin，1996，分離和鑒定影響釀酒酵母中脂肪酸延伸的基因，生物化學(xué)雜志271，18413-18422)。表3顯示本發(fā)明的延伸酶相互間及與展葉劍葉蘚和酵母延伸酶的同一性和同源性。數(shù)據(jù)是在GAP程序的協(xié)助下獲得的，其中所述GAP程序是作為下列軟件的子程序WisconsinPackageVersion10.0(GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，Wisc.，美國).表3具體地說，圖5至10可用于得到作為高同源性區(qū)的下列序列基序且通過將氨基酸反向翻譯為三堿基對密碼子可從其推導(dǎo)出對應(yīng)的共有序列，從而產(chǎn)生了可用于通過聚合酶鏈反應(yīng)分離新延伸酶的寡核苷酸。它們具體地為圖10中所示的序列基序。這些基序可用于推導(dǎo)寡核苷酸，其與兩個寡核苷酸組合可用在PCR實驗中，用于分離另外的延伸酶片段。為做到這一點，構(gòu)建和合成一條與通常定義的5’-3’鏈匹配的寡核苷酸并構(gòu)建和合成第二條具有與3’-5’鏈下游匹配的寡核苷酸是有利的。這導(dǎo)致可確定數(shù)量的引物組合，其由可能的變體排列所限制。在此上下文中，也可使用oligo-dT引物及其變體，例如最后一個堿基的變體如oligodT(12-20)X，其中X可為G、C或T使得轉(zhuǎn)錄庫具特異性。也可使用另一堿基oligodT(12-20)XY，其中X可為G、C或A，Y可為A、G、C或T。上述定義的序列使得可衍生出17-至20mer的寡核苷酸，其可用于通過改變引物的組合和實驗參數(shù)如溫度程序、鎂離子濃度等來分離基因片段。所得片段可克隆入合適的載體并通過當(dāng)前方法測定所得克隆的序列，以鑒定新延伸酶。實施例6b從致病疫霉分離cDNA克隆利用與來自蘚類植物展葉劍葉蘚(ATCCC48886)之PUFA延伸酶的同源性，從隨機測序的cDNAs鑒定了來自致病疫霉的名為PI001002014R的cDNA克隆，該克隆包含圖8中所示的共有基序MyxYYF，其中不同于至今已鑒定的PUFA延伸酶，發(fā)現(xiàn)可變氨基酸x為蘇氨酸基團(tuán)。該進(jìn)一步的變異可用于推導(dǎo)PCR引物。實施例7通過雜交鑒定基因(TC002034029R-11iGenTc-PCE1)可用于鑒定同源或異源基因的基因序列來自cDNA文庫或基因組文庫?？捎萌鏲DNA文庫通過核酸雜交分離同源基因(即同源的全長cDNA克隆或同系物)尤其可用該方法來分離具功能活性的SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11全長基因。依賴于目的基因的出現(xiàn)率，將100,000至1,000,000個重組細(xì)菌噬菌體鋪板并轉(zhuǎn)移至尼龍膜。用堿變性后，將DNA例如通過紫外交聯(lián)固定在膜上。在高度嚴(yán)格的條件下雜交。在溫度為68℃、離子強度為1MNaCl的水溶液中進(jìn)行雜交和洗滌步驟。例如通過標(biāo)記放射活性(32P-)的切口轉(zhuǎn)錄(HighPrime，Roche，Mannheim，德國)產(chǎn)生雜交探針。通過放射自顯影檢測信號。使用低嚴(yán)格的雜交和洗滌條件用類似于上述的方法可鑒定相關(guān)但不相同的部分同源或異源基因。對于含水雜交，離子強度通常保持在1MNaCl，并將溫度慢慢從68℃降至42℃?？捎煤铣傻幕蚍派湫詷?biāo)記的寡核苷酸探針分離只顯示與如具10至20個氨基酸的單個結(jié)構(gòu)域有同源性的基因序列。通常用T4多核苷酸激酶在兩條互補寡核苷酸的5’末端磷酸化產(chǎn)生放射性標(biāo)記的寡核苷酸探針。將互補的寡核苷酸雜交并相互連接，以產(chǎn)生串聯(lián)體。如通過切口轉(zhuǎn)錄放射性標(biāo)記雙鏈串聯(lián)體。雜交通常在低嚴(yán)格條件下使用高濃度的寡核苷酸進(jìn)行。寡核苷酸雜交液6×SSC0.01M磷酸鈉1mMEDTA(pH8)0.5％SDS100μg/ml變性鮭魚精DNA0.1％無水低脂奶在雜交過程中，溫度逐步降低至低于所計算的寡核苷酸溫度5至10℃或至室溫(除非特別指出，在所有實驗中RT＝～23℃)，然后是洗滌步驟和放射自顯影。在極低嚴(yán)格條件下進(jìn)行洗滌步驟，如用4×SSC洗滌3次。進(jìn)一步的詳述見Sambrook，J.等人(1989)，“分子克隆實驗室手冊”，冷泉港實驗室出版社，或Ausubel，F(xiàn).M.等人(1994)“分子生物學(xué)最新方法”，JohnWiley&Sons。具有基因名為Tc_PCE1_1的克隆TC002034029R-11為來自破囊壺菌的延伸酶之全長序列，因此較來自Seq.IDNo.3和Seq.IDNo.4的克隆TC002034029R要長。用如上所述的雜交方法分離該克隆(實施例7)。它的DNA序列長為1050堿基對，編碼271個氨基酸，其中起始密碼子位于堿基對位置的43-45位，終止密碼子位于堿基對位置的856-858位。實施例8通過用抗體篩選表達(dá)文庫鑒定靶基因使用cDNA序列以在如大腸桿菌中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)(如QiagenQIAexpresspQE系統(tǒng))。然后通常通過Ni-NTA親和層析以親和純化該重組蛋白質(zhì)(Qiagen)。然后該重組蛋白質(zhì)如用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)免疫兔子，用于產(chǎn)生特異性抗體。然后如Gu等人，(1994)生物技術(shù)(BioTechniques)17257-262中所述，用重組抗原預(yù)置飽和的Ni-NTA柱親和純化該抗體。然后使用抗體通過免疫篩選法篩選表達(dá)cDNA文庫(Sambrook，J.等人(1989)，“分子克隆實驗室手冊”，冷泉港實驗室出版社，或Ausubel，F(xiàn).M.等人(1994)“分子生物學(xué)最新方法”，JohnWiley&Sons)。實施例9用于植物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒雙元載體如pBinAR可用于植物轉(zhuǎn)化(Hfgen和Willmitzer，植物科學(xué)(PlantScience)66(1990)221-230)。該雙元載體可通過將cDNA以有義或反義方向連接入T-DNA而構(gòu)建。該cDNA的5’(植物啟動子)激活cDNA轉(zhuǎn)錄。聚腺苷酸化序列位于該cDNA的3’?？墒褂媒M織特異性啟動子進(jìn)行組織特異性表達(dá)。如種子特異性表達(dá)可通過克隆入該cDNA5’的napin或LeB4或USP啟動子而完成。也可使用任一其它的種子特異性啟動子元件。CaMV-35S啟動子可用于所有植物中的組成型表達(dá)。表達(dá)的蛋白質(zhì)可用信號肽靶向細(xì)胞區(qū)室，如靶向質(zhì)體、線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Kermode，植物科學(xué)評論15，4(1996)285-423)。信號肽以正確的讀碼框克隆在cDNA的5’，以獲得融合蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。實施例10土壤桿菌的轉(zhuǎn)化可用如根癌土壤桿菌菌株GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，分子普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)204(1986)383-396)或LBA4404(Clontech)進(jìn)行土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化?？捎脴?biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化(Deblaere等人，Nucl.Acids.Tes.13(1984)，4777-4788)。實施例11植物轉(zhuǎn)化可用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化和再生技術(shù)進(jìn)行土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化(Gelvin，StiltonB.，Schilperoort，RobertA.，植物分子生物學(xué)手冊(PlantMolecularBiologyManual)，第二版，DordrechtKluwerAcademicPubl.，1995，所在部分為RingbucZentraleSignaturBT11-PISBN0-7923-2731-4；Glick，BernardR.，Thompson，JohnE.，植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法(MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology)，BocaRatonCRCPress，1993，360頁ISBN0-8493-5164-2)。例如，可通過轉(zhuǎn)化子葉或下胚軸而轉(zhuǎn)化油料種子油菜(Moloney等人，植物細(xì)胞報告8(1989)238-242；DeBlock等人，植物生理學(xué)(PlantPhysiol.)91(1989)694-701)。用于土壤桿菌和植物選擇的抗生素取決于用于轉(zhuǎn)化的雙元載體和土壤桿菌菌株。通常用卡那霉素作為可選擇標(biāo)記物來選擇油料種子油菜。可使用Mlynarova等人(1994)植物細(xì)胞報告13282-285描述的技術(shù)于亞麻籽(亞麻(Linumusitatissimum))中進(jìn)行土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。大豆的轉(zhuǎn)化例如可用在EP-A-00424047(PioneerHi-BredInternational)或EP-A-00397687，US5,376,543，US5,169,770(UniversityofToledo)描述的技術(shù)進(jìn)行。如Freeling和Walbot“玉米手冊”(“Themaizehandbook”)(1993)ISBN3-540-97826-7，SpringerVerlagNewYork)描述了使用粒子轟擊、聚乙二醇介導(dǎo)的DNA攝入或通過硅碳酸鹽纖維技術(shù)進(jìn)行的植物轉(zhuǎn)化。實施例12用于植物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒雙元載體如pBinAR可用于植物轉(zhuǎn)化(Hfgen和Willmitzer，植物科學(xué)(PlantScience)66(1990)221-230)?？赏ㄟ^將cDNA以有義或反義方向連接入T-DNA而構(gòu)建雙元載體。cDNA的5’為植物啟動子，其活化cDNA轉(zhuǎn)錄。聚腺苷酸化序列位于cDNA的3’?？墒褂媒M織特異性啟動子達(dá)到組織特異性表達(dá)的目的。如可通過將cDNA的5’克隆入napin或LeB4或USP啟動子而達(dá)到種子特異性表達(dá)的目的。也可使用任一其它種子特異性啟動子元件。CaMV-35S啟動子可用于所有植物的組成型表達(dá)。具體地說，可通過構(gòu)建連續(xù)的多表達(dá)盒將編碼延伸酶和去飽和酶的基因克隆入雙元載體，以模擬在植物中的代謝途徑。在一個表達(dá)盒內(nèi)，可用信號肽將表達(dá)的蛋白質(zhì)靶向進(jìn)入細(xì)胞區(qū)室，如質(zhì)體、線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Kermode，植物科學(xué)評論15，4(1996)285-423)。信號肽以正確的讀碼框克隆于cDNA的5’，以達(dá)到對融合蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。實施例13體內(nèi)誘變可將質(zhì)粒DNA(或任一其它載體DNA)在大腸桿菌(E.coli)或其它微生物(如芽孢桿菌屬或酵母如釀酒酵母)中傳代而進(jìn)行微生物的體內(nèi)誘變，其中所述大腸桿菌或其它微生物保留它們遺傳信息完整性的能力被破壞。常規(guī)的突變株在用于DNA修復(fù)系統(tǒng)的基因中具有突變(如mutHLS、mutD、mutT等；作為參考，參見Rupp，W.D.(1996)大腸桿菌和沙門氏菌(EscherichiacoliandSalmonella)一書中的DNA修復(fù)機制(DNArepairmechanisms)，2277-2294頁，ASM華盛頓)。這些菌株為技術(shù)人員公知。這些菌株的用途例如于Greener，A.和Callahan，M.(1994)策略(Strategies)732-34中進(jìn)行了闡述。突變的DNA分子優(yōu)選地在微生物經(jīng)選擇和測試后轉(zhuǎn)移入植物。根據(jù)在本文實施例部分的多種實施例產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。實施例14研究重組基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化生物體中的表達(dá)于轉(zhuǎn)化的宿主生物體中，在轉(zhuǎn)錄和/或翻譯水平測定重組基因產(chǎn)物的活性。用于測定基因轉(zhuǎn)錄量的合適方法(其代表可用于翻譯基因產(chǎn)物的的RNA量)為用以下說明的northern印跡法(至于參考文獻(xiàn)，參見Ausubel等人(1988)分子生物學(xué)最新方法，Wiley紐約，或上述實施例部分)，其中將所設(shè)計的與目標(biāo)基因結(jié)合的引物用可檢測標(biāo)記物(通常為放射活性或化學(xué)發(fā)光)標(biāo)記，這樣，在提取了生物體培養(yǎng)物的總RNA、在凝膠上分離、轉(zhuǎn)移至穩(wěn)定的基質(zhì)并與該探針孵育后，探針的結(jié)合和結(jié)合程度表示基因mRNA的存在及量。該信息表示轉(zhuǎn)化基因的轉(zhuǎn)錄程度?？赏ㄟ^多種方法從細(xì)胞、組織或器官制備細(xì)胞總RNA，其中所述多種方法均為本領(lǐng)域公知，如Bormann，E.R.等人(1992)分子微生物學(xué)(Mol.Microbiol.)6317-326中的方法。Northern雜交為進(jìn)行RNA雜交，如Amasino(1986，生物化學(xué)紀(jì)事152，304)所述，將20μg總RNA或1μgpoly(A)+-RNA用甲醛于1.25％強度的瓊脂糖凝膠上通過凝膠電泳分離，用10×SSC通過毛細(xì)管引力轉(zhuǎn)移至帶正電荷的尼龍膜(HybondN+，Amersham，Brunswick)，紫外線固定并用雜交緩沖液(10％葡聚糖硫酸酯w/v，1MNaCl，1％SDS，100mg鯡精DNA)于68℃預(yù)雜交3小時。在預(yù)雜交期間，使用α-32P-dCTP(Amersham，Brunswick，德國)通過HighprimeDNA標(biāo)記試劑盒(Roche，Mannheim，德國)標(biāo)記DNA探針。加入標(biāo)記的DNA探針后，于同樣的緩沖液中68℃過夜雜交。于68℃用2×SSC洗滌兩次，每次15分鐘，并用1×SSC、1％SDS洗滌兩次，每次30分鐘。密封的濾器于-70℃曝光1至14天。可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如Western印跡(參見如Ausubel等人(1988)分子生物學(xué)最新方法，Wiley紐約)用于研究由該mRNA翻譯的蛋白質(zhì)的存在或相對數(shù)量。在該方法中，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，通過凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至基質(zhì)如硝酸纖維素膜，并與探針如特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體溫育。該探針通常用易于檢測的化學(xué)發(fā)光或比色標(biāo)記。所觀察到的標(biāo)記的存在和數(shù)量表示在細(xì)胞中的目標(biāo)突變蛋白質(zhì)的存在和數(shù)量。實施例15重組蛋白質(zhì)對產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物的作用分析植物、真菌、藻類或纖毛蟲的遺傳修飾對產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物(如脂肪酸)的影響可通過在合適條件下(如上所述)培養(yǎng)改性微生物或改性植物而測定，并分析培養(yǎng)基和/或細(xì)胞成分，以分析目標(biāo)產(chǎn)物(即脂類或脂肪酸)增加的產(chǎn)量。這些分析技術(shù)為技術(shù)人員公知并包括光譜學(xué)、薄層層析、多種染色技術(shù)、酶學(xué)和微生物學(xué)方法以及分析色譜如高效液相色譜(參見如Ullman，工業(yè)化學(xué)百科全書(EncyclopediaofIndustrialChemistry)，A2卷，89-90頁和443-613頁，VCHWeinheim(1985)；Fallon，A.等人，(1987)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實驗室技術(shù)(LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology)一書中的“HPLC在生物化學(xué)中的應(yīng)用”(“ApplicationsofHPLCinBiochemistry”)，第17卷；Rehm等人(1993)生物技術(shù)(Biotechnology)，第3卷，第III章“產(chǎn)物回收和純化”(“Productrecoveryandpurification”)，469-714頁，VCHWeinheim；Belter，P.A.等人(1988)生物分離用于生物技術(shù)的下游加工方法(BioseparationsdownstreamprocessingforBiotechnology)，JohnWiley和Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)生物材料的回收方法(RecoveryprocessesforbiologicalMaterials)，JohnWiley和Sons；Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.(1988)生物化學(xué)分離(BiochemicalSeparations)，在Ullmann’s工業(yè)化學(xué)百科全書(Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry)，Bd.B3中；第11章，1-27卷，VCHWeinheim；以及Dechow，F(xiàn).J.(1989)生物技術(shù)中的分離和純化技術(shù)(Separationandpurificationtechniquesinbiotechnology)，Noyes出版社)。除了上述方法外，Cahoon等人(1999)美國國家科學(xué)院院報96(22)12935-12940，以及Browse等人(1986)分析生物化學(xué)(AnalyticBiochemistry)152141-145描述了從植物材料提取植物脂類。Christie，WilliamW.，脂類方法學(xué)進(jìn)展(AdvancesinLipidMethodology)，Ayr/ScotlandOilyPress(OilyPressLipidLibrary；2)；Christie，WilliamW.，氣相色譜和脂類.實踐指南(GasChromatographyandLipids.APracticalGuide)-Ayr，ScotlandOilyPress，1989，1992年再版，IX，307頁(OilyPressLipidLibrary；1)；脂類研究進(jìn)展(ProgressinLipidResearch)，OxfordPergamonPress，1(1952)-16(1977)中ProgressintheChemistryofFatsandOtherLipidsCODEN標(biāo)題下描述了定性和定量脂類或脂肪酸分析。除了測定發(fā)酵終產(chǎn)物，也可分析用于產(chǎn)生目標(biāo)化合物的代謝途徑中的其它成分，如中間體和副產(chǎn)品，以測定該化合物的總體生產(chǎn)效率。分析方法包括測定培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物的量(如糖類、碳水化合物、氮源、磷酸鹽和其它離子)、生物量組成和生長測定，分析生物合成途徑的常規(guī)代謝產(chǎn)物，以及測定發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氣體。應(yīng)用微生物生理學(xué)；實踐方法(AppliedMicrobialPhysiology；APracticalApproach)，P.M.Rhodes和P.F.Stanbury編輯，IRLPress，131-163頁和165-192頁(ISBN0199635773)以及其中陳述的參考文獻(xiàn)中描述了這些測定的標(biāo)準(zhǔn)方法。一個實例是分析脂肪酸(縮略語FAME，脂肪酸甲酯；GC-MS，氣-液色譜/質(zhì)譜；TAG，三酰基甘油；TLC，薄層色譜)?？赏ㄟ^用標(biāo)準(zhǔn)方法GC、GC-MS或TLC分析重組生物得到對脂肪酸產(chǎn)物存在的明確檢測，如一些情況下Christie及其中的參考文獻(xiàn)中所描述的(1997，在脂類方法學(xué)進(jìn)展(AdvancesonLipidMethodology)，第四版Christie，OilyPress，Dundee，119-169；1998，氣相色譜/質(zhì)譜法，Lipide33343-353)?？赏ㄟ^超聲法、在玻璃磨機及液氮中碾磨的碾磨法，或通過其它可實施的方法破碎欲分析材料。破碎后，必須離心該材料。將沉淀重懸在蒸餾水中，于100℃加熱10分鐘，冰上冷卻并離心，然后于90℃用0.5M硫酸在具2％二甲氧丙烷的甲醇中的溶液萃取1小時，導(dǎo)致水解的油和脂類化合物，得到甲基轉(zhuǎn)移的脂類。在石油醚中萃取這些脂肪酸甲基酯，并最后用毛細(xì)管柱進(jìn)行GC分析(Chrompack，WCOTFusedSilica，CP-Wax-52CB，25μm，0.32mm)，在170℃和240℃之間的溫度梯度進(jìn)行20分鐘以及在240℃5分鐘。對所得脂肪酸甲基酯的鑒定必須用市售的標(biāo)準(zhǔn)品(即Sigma)確定。對于沒有可得到標(biāo)準(zhǔn)品的脂肪酸，鑒定必須通過衍生作用后再進(jìn)行GC/MS分析顯示。例如，具三鍵的脂肪酸的定位必須用4，4-二甲氧噁唑啉衍生物衍生后通過GC/MS顯示(Christie，1998，見上)。實施例16在異源微生物系統(tǒng)中表達(dá)構(gòu)建體菌株、培養(yǎng)條件和質(zhì)粒用大腸桿菌菌株XL1BlueMRF’kan(Stratagene)亞克隆該新的展葉劍葉蘚延伸酶，如PpPSE1。為功能性表達(dá)該基因，我們使用了釀酒酵母株INVSc1(InvitrogenCo.)。在Luria-Bertini肉湯(LB，Duchefa，Haarlem，theNetherlands)中37℃培養(yǎng)大腸桿菌。如果需要的話，加入氨芐青霉素(100mg/升)，以及加入1.5％的瓊脂(w/v)用于固體LB培養(yǎng)基。在含2％(w/v)棉子糖或葡萄糖的YPG培養(yǎng)基或無尿嘧啶的完全最小培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)釀酒酵母(CMdum；參見Ausubel，F(xiàn).M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.，Albright，L.B.，Coen，D.M.和Varki，A.(1995)分子生物學(xué)最新方法，JohnWiley&Sons，紐約)。對于固體培養(yǎng)基，加入2％(w/v)的BactoTM瓊脂(Difco)。用于克隆和表達(dá)的質(zhì)粒為pUC18(Pharmacia)和pYES2(InvitrogenCo.)。實施例17PUFA-特異的劍葉蘚、隱甲藻類和破囊壺菌延伸酶的克隆與表達(dá)可如實施例7所述分離本發(fā)明序列的全長基因，并如以下所示加工。顯示了與用途有關(guān)的具體表達(dá)實施例。A)用蘚類延伸酶Pp_PSE1延伸脂肪酸為在酵母中表達(dá)，首先對展葉劍葉蘚cDNA克隆PpPSE1(較早的數(shù)據(jù)庫序列名稱為08_ck19_b07，新名稱為pp001019019f)(其編碼PUFA-特異的延伸酶(PSE1)基因)加以改變，使得在起始密碼子附近得到BamHI限制性位點和酵母用于高效翻譯的共有序列(Kozak，M.(1986)用點突變確定AUG起始密碼子側(cè)翼調(diào)節(jié)真核核糖體翻譯的序列，細(xì)胞44，283-292)并在終止密碼子的側(cè)翼得到BamHI限制性位點。為了擴增該開放讀碼框，合成了互補于其5’和3’末端的引物對。通過聚合酶鏈反應(yīng)，將SEQIDNO1所示的、根據(jù)本發(fā)明序列的基因克隆入pYES，產(chǎn)生質(zhì)粒PYPp_PSE1將下列寡核苷酸用于PCR實驗Ppex6ggatccacataatggaggtcgtggagagattcPpex6rggatcctcactcagttttagctccttttgc用克隆PP001019019F的質(zhì)粒DNA作為模板于熱循環(huán)儀(Biometra)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)使用了PfuDNA(Stratagene)聚合酶和下列溫度程序96℃3分鐘，然后96℃30秒、55℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行25個循環(huán)，72℃10分鐘進(jìn)行一個循環(huán)。通過瓊脂糖TBE凝膠電泳鑒定所擴增DNA片段的正確大小。用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)從凝膠中提取擴增的DNA，并用SureCloneLigationKit(Pharmacia)首先克隆入pUC18。所克隆的片段用BamHI酶切并連接入pYES，得到pYPp_PSE1。通過HindIII檢查片段的方向。轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1BlueMRF’kan后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的DNA小型制備(Riggs，M.G.和McLachlan，A.(1986)用于大量質(zhì)粒小型制備的簡化篩選步驟，生物技術(shù)(BioTechniques)4，310-313)，并通過BamHI限制性分析來鑒定陽性克隆。用ABIPRISMBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit(Perkin-Elmer，Weiterstadt)反復(fù)測序證實克隆的PCR產(chǎn)物序列。培養(yǎng)一個克隆，用NucleobondAX500質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Macherey-Nagel，Düringen)進(jìn)行DNA的大量制備。通過改良的PEG/醋酸鋰法(Ausubel等人，1995)，用pYPp_PSE1或用pYES2作為對照轉(zhuǎn)化酵母屬INVSc1。在具2％葡萄糖的CMdum-瓊脂平板上選擇后，如已陳述的并在培養(yǎng)基中提供多種脂肪酸，選擇多個轉(zhuǎn)化子和一個pYES2轉(zhuǎn)化子以進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)和功能表達(dá)。i)在提供250微克十六碳三烯酸(163Δ7c，10c，13c)后，用無插入片段的pYES質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母或表達(dá)Pp-PSE1基因的酵母(數(shù)據(jù)用mol％表示)的脂類模式表4ii)在提供500微克十八碳三烯酸(183Δ6c，9c，12c)后，用無插入片段的pYES質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母或表達(dá)Pp-PSE1基因的酵母(數(shù)據(jù)用mol％表示)的脂類模式。表5iii)在提供500微克stearidonicacid(184Δ6c，9c，12c，15c)后，用無插入片段的pYES質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母或表達(dá)Pp-PSE1基因的酵母(數(shù)據(jù)用mol％表示)的脂類模式。表6iv)在提供500微克亞油酸(182Δ9c，12c)后，用無插入片段的pYES質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母或表達(dá)Pp-PSE1基因的酵母(數(shù)據(jù)用mol％表示)的脂類模式。表7B)用破囊壺菌延伸酶延伸脂肪酸為了在酵母中表達(dá)，首先改變SEQIDNO3的破囊壺菌cDNA克隆(Tc_PSE2)(其編碼PUFA-特異的延伸酶(PSE)基因)，以使其組成功能活性多肽。為此，該蛋白質(zhì)的N-末端在DNA水平以幾乎沒有與展葉劍葉蘚延伸酶錯配的堿基延伸42個堿基對。但是，也可對序列只添加對序列而言讀碼框正確的起始密碼子。下列寡核苷酸用于PCR實驗pTCPSE2-5’aaaggatccacataatggaggtcgtggagagattctacggtgagttggatgggaagGTCATTTCGGGCCTCGACCpTCPSE2-3’aaggatccctgagttttagctcccttttgctttcc此外，兩個寡核苷酸含有BamHI限制性位點和酵母用于高效翻譯的共有序列(Kozak，M.(1986)用點突變確定AUG起始密碼子側(cè)翼調(diào)節(jié)真核核糖體翻譯的序列，細(xì)胞44，283-292)。用質(zhì)粒DNA作為模板于熱循環(huán)儀(Biometra)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)使用了PfuDNA(Stratagene)聚合酶和下列溫度程序96℃3分鐘，然后96℃30秒、55℃30秒和72℃3分鐘進(jìn)行25個循環(huán)，72℃10分鐘進(jìn)行一個循環(huán)，并于4℃停止反應(yīng)。通過瓊脂糖TBE凝膠電泳鑒定所擴增DNA片段的正確大小。用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)從凝膠中提取擴增的DNA，并用SureCloneLigationKit(Pharmacia)連接入去磷酸化載體pUC18的SmaI限制性位點，得到pUC-雜合-TcPSE2。轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1BlueMRF’kan后，對24個氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA小型制備(Riggs，M.G.和McLachlan，A.(1986)用于大量質(zhì)粒小型制備的簡化篩選步驟，生物技術(shù)4，310-313)，并通過BamHI限制性分析鑒定陽性克隆。用ABIPRISMBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit(Perkin-Elmer，Weiterstadt)反復(fù)測序證實克隆的PCR產(chǎn)物序列。pUC-PSE1和pUC-雜合-Tc_PSE2的質(zhì)粒DNA首先用BamHI酶切，并將所得到的片段連接入去磷酸化的酵母/大腸桿菌穿梭載體pYES2的BamHI限制性位點，得到pY2雜合-Tc_PSE2。轉(zhuǎn)化大腸桿菌并從轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA小型制備后，通過HindIII酶切檢查DNA片段在載體中的方向。培養(yǎng)一個克隆，用NucleobondòAX500質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Macherey-Nagel，Diiringen)進(jìn)行DNA的大量制備。用改良的PEG/醋酸鋰法(Ausubel等人，1995)，將pY2PSE1、pYES2、pY2-雜合-Tc_PSE2和pYES2轉(zhuǎn)化酵母屬INVSc1。在含2％葡萄糖的CMdum-瓊脂平板上選擇后，對每種轉(zhuǎn)化而言，選擇四個pY2PSE1轉(zhuǎn)化子(pY2PSE1a-d)、四個pY2-雜合-Tc_PSE2轉(zhuǎn)化子(pY2-雜合-Tc_PSE21a-d)和一個pYES2轉(zhuǎn)化子以進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)和功能表達(dá)。延伸酶活性在酵母中的功能表達(dá)預(yù)培養(yǎng)20ml含2％(w/v)棉子糖的CMdum液體培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)基因酵母克隆(pY2-雜合-Tc_SE21a-d，pYES2)培養(yǎng)，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)3天，直至在600nm處的光密度(OD600)達(dá)到1.5-2。主培養(yǎng)為了表達(dá)，向20ml含2％(w/v)棉糖和1％(v/v)表面活性劑NP-40的CMdum液體培養(yǎng)基補充終濃度為0.003％(w/v)的脂肪酸底物。將該培養(yǎng)基與預(yù)培養(yǎng)物培養(yǎng)至OD600為0.05。在OD600為0.2時，用2％(w/v)半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)16小時，然后在OD600為0.8-1.2時收獲培養(yǎng)物。脂肪酸分析從酵母培養(yǎng)物中提取總脂肪酸，并用氣相色譜分析。為此，離心(1000×g，10分鐘，4℃)收獲5ml培養(yǎng)物中的細(xì)胞并用100mMNaHCO3，pH8.0洗滌一次，以去除殘余的培養(yǎng)基和脂肪酸。為制備脂肪酸甲酯(FAMEs)，于80℃用1MmethanolicH2SO4和2％(v/v)二甲氧基丙烷處理細(xì)胞沉淀1小時。用2ml石油醚提取FAMEs兩次，100mMNaHCO3，pH8.0洗滌一次，并用蒸餾水洗滌一次，Na2SO4干燥。在氬流下蒸發(fā)有機溶劑，并將FAMEs溶于50μl石油醚。用裝備有火焰電離檢測器的HewlettPackard6850氣相色譜儀中的ZEBRONZBWax毛細(xì)管柱(30m，0.32mm，0.25μm；Phenomenex)上分離樣本。烘箱溫度程序為以20℃/分鐘的速率從70℃(維持1分鐘)升高到200℃，然后以5℃/分鐘的速率升高到250℃(維持5分鐘)并最終以5℃/分鐘的速率升高到260℃。用氮氣作為載體氣體(于70℃以4.5ml/分鐘)。通過與FAME標(biāo)準(zhǔn)品(SIGMA)的滯留時間比較鑒定脂肪酸。五株轉(zhuǎn)基因酵母菌株的脂肪酸模式如表1所示，以mol％表示。添加和攝入的γ-亞麻酸之比用粗體的印刷數(shù)值強調(diào)，那些延伸產(chǎn)物用紅色數(shù)值強調(diào)，且那些延伸的γ-亞麻酸用粗體的印刷數(shù)值(最后一行)強調(diào)。圖2a-e顯示了來自pYES2(i/對照)和pY2PSE1(ii-ivc+d/用pY2PSE1A、pY2PSE1B、pY2PSE1C、pY2PSE1D轉(zhuǎn)化的情況下)轉(zhuǎn)化的酵母總脂類的FAMEs的GC分析。為了進(jìn)行分析，在存在γ-183時培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因酵母。表1以mol％顯示了它們的脂肪酸模式。γ-183的攝入用粗體印刷的數(shù)值強調(diào)，延伸產(chǎn)物dihomo-γ-亞麻酸(203Δ8，11，14)用下劃線且γ-183-延伸產(chǎn)物之比(也以mol％表示)用粗體印刷的數(shù)值強調(diào)(最后一行)。順-Δ6，9，12C183的DMOX衍生物的結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜見圖3a+b。Δ8，11，14C203的DMOX衍生物的結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜見圖4a+b。結(jié)果表明γ-183大量摻入至所有的轉(zhuǎn)基因酵母中。在氣相色譜中所有四個用pY2PSE1轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因酵母克隆顯示了一個額外的峰，通過滯留時間的比較其被鑒定為203Δ8，11，14。氣相色譜/質(zhì)譜可提供其它證據(jù)證實其身份。如表1所示延伸的γ-183的百分率為23.7至40.5％。而且，未觀察到棕櫚酸(160)、棕櫚油酸(161)、硬脂酸(180)或油酸(181Δ9)顯著的延伸作用。所鑒定的產(chǎn)物表明來自蘚類展葉劍葉蘚之PpPSE1的核苷酸序列編碼Δ6-選擇性脂肪酸延伸酶，其導(dǎo)致在轉(zhuǎn)基因酵母中新脂肪酸的形成?？扇缟洗_定添加和攝入脂肪酸底物之比，從而可檢測延伸酶反應(yīng)的量和質(zhì)。DMOX衍生物的結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜也揭示了雙鍵分別的位置?？蛇M(jìn)行進(jìn)一步提供大范圍的其它脂肪酸(如花生四烯酸、二十碳五烯酸等)的加料實驗，以更詳細(xì)地證實該延伸酶的底物選擇性。實施例18從常用的轉(zhuǎn)化生物體中分離目標(biāo)產(chǎn)物可用本領(lǐng)域公知的多種方法從植物或真菌、藻類、纖毛蟲、動物細(xì)胞，或從上述的培養(yǎng)物上清中獲得目標(biāo)產(chǎn)物。如果目標(biāo)產(chǎn)物不從細(xì)胞中分泌，可通過低速離心從培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞，并將細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如機械力或超聲法裂解。可從其它組織或其它器官機械分離植物器官。勻漿化后，離心去除細(xì)胞碎片，并保留包含可溶性蛋白質(zhì)的上清部分，用于進(jìn)一步分離目標(biāo)化合物。如果產(chǎn)物從目標(biāo)細(xì)胞中分泌，可通過低速離心從培養(yǎng)物中去除細(xì)胞，并保留上清部分用于進(jìn)一步的分離。對來自每一分離步驟的上清部分用合適的樹脂進(jìn)行層析，使目標(biāo)分子保留在層析樹脂上而樣本中的許多污染物則不保留在層析樹脂上，或污染物保留在層析樹脂上而樣本則不保留在層析樹脂上。如果需要的話，可用相同或其它層析樹脂重復(fù)這些層析步驟。技術(shù)人員熟知選擇合適的層析樹脂并熟知它們用于待分離的具體分子的最有效用途。分離產(chǎn)物可通過過濾或超過濾濃縮，并保存在產(chǎn)物穩(wěn)定性最高的溫度下。大量的分離方法為本領(lǐng)域公知，且上述分離方法不用于限制的目的。這些分離方法如在Bailey，J.E.和Ollis，D.F.，生物化學(xué)工程基礎(chǔ)(BiochemicalEngineeringFundamentals)，McGraw-Hill紐約(1986)中進(jìn)行了描述。可用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定所分離化合物的性質(zhì)和純度。它們包括高效液相色譜(HPLC)、分光鏡分析法、染色法、薄層層析、NIRS、酶測定法或微生物學(xué)方法。對這些分析方法的綜述參見Patek等人(1994)應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)60133-140；Malakhova等人(1996)生物技術(shù)(Biotekhnologiya)1127-32；以及Schmidt等人(1998)生物加工工程(BioprocessEngineer.)1967-70.Ulmann’s工業(yè)化學(xué)百科全書(1996)第A27卷，VCHWeinheim，89-90頁、521-540頁、540-547頁、559-566頁、575-581頁和581-587頁；Michal，G(1999)生物化學(xué)途徑生物化學(xué)和分子生物學(xué)圖集(BiochemicalPathwaysAnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology)，JohnWiley和Sons；Fallon，A.等人(1987)在生物化學(xué)和分子生物學(xué)實驗室技術(shù)(LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology)一書中第17卷HPLC在生物化學(xué)中應(yīng)用(ApplicationsofHPLCinBiochemistry)。等同物技術(shù)人員公知或只需借助常規(guī)的實驗可鑒定于此處描述的本發(fā)明特定實施方案的大量等同物。本專利的權(quán)利要求包括這些等同物。序列表序列表<110>巴斯福股份有限公司<120>新延伸酶基因以及制備多不飽和脂肪酸的方法<130>0050/51159<140>20000081<141>2000-02-09<160>12<170>PatentInVers.2.0<210>1<211>1192<212>DNA<213>展葉劍葉蘚<220><221>CDS<222>(58)..(930)<400>1ctgcttcgtctcatcttgggggtgtgattcgggagtgggttgagttggtggagcgca57atggaggtcgtggagagattctacggtgagttggatgggaaggtctcg105MetGluValValGluArgPheTyrGlyGluLeuAspGlyLysValSer151015cagggcgtgaatgcattgctgggtagttttggggtggagttgacggat153GlnGlyValAsnAlaLeuLeuGlySerPheGlyValGluLeuThrAsp202530acgcccactaccaaaggcttgcccctcgttgacagtcccacacccatc201ThrProThrThrLysGlyLeuProLeuValAspSerProThrProIle354045gtcctcggtgtttctgtatacttgactattgtcattggagggcttttg249ValLeuGlyValSerValTyrLeuThrIleValIleGlyGlyLeuLeu505560tggataaaggccagggatctgaaaccgcgcgcctcggagccatttttg297TrpIleLysAlaArgAspLeuLysProArgAlaSerGluProPheLeu65707580ctccaagctttggtgcttgtgcacaacctgttctgttttgcgctcagt345LeuGlnAlaLeuValLeuValHisAsnLeuPheCysPheAlaLeuSer859095ctgtatatgtgcgtgggcatcgcttatcaggctattacctggcggtac393LeuTyrMetCysValGlyIleAlaTyrGlnAlaIleThrTrpArgTyr100105110tctctctggggcaatgca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202530tgggtccccttcctgatgtgcttcatctacctggtcgtcatcttcggc144TrpValProPheLeuMetCysPheIleTyrLeuValValIlePheGly354045atccagtactacatggaggaccgcaaggagttcgatctgcgcaagccg192IleGlnTyrTyrMetGluAspArgLysGluPheAspLeuArgLysPro505560ctggccgcctggagcgccttcttggccattttcagcatcggcgcctcc240LeuAlaAlaTrpSerAlaPheLeuAlaIlePheSerIleGlyAlaSer65707580atccgcaccgtgcccgtcctgctcaagatgctctacgaaaagggcacg288IleArgThrValProValLeuLeuLysMetLeuTyrGluLysGlyThr859095caccacgtgctctgcggcgacacgcgcaacgactgggtcattgacaac336HisHisValLeuCysGlyAspThrArgAsnAspTrpValIleAspAsn100105110ccggccggcgtctggaccatggcctttatcttttccaagattcccgag384ProAlaGlyValTrpThrMetAlaPheIlePheSerLysIleProGlu115120125ctcatcgacaccctctttatcgtgctccgcaagcgcaagctcatcacc432LeuIleAspThrLeuPheIleValLeuArgLysArgLysLeuIleThr130135140ctccactggtaccaccacgtgaccgtgctcctgttctgctggcacgcc480LeuHisTrpTyrHisHisValThrValLeuLeuPheCysTrpHisAla145150155160tgggccacctttgcgctcaccggcatcgtctttgccgccatcaacgcc528TrpAlaThrPheAlaLeuThrGlyIleValPheAlaAlaIleAsnAla165170175tcggtgcacgccatcatgtacgcctattacgccttcacggccctcggc576SerValHisAlaIleMetTyrAlaTyrTyrAlaPheThrAlaLeuGly180185190taccgaccaacctcgtacgccatctacattacgctcattcagatcatg624TyrArgProThrSerTyrAlaIleTyrIleThrLeuIleGlnIleMet195200205cagatggtcgtcggcaccgccgtcaccttttacattggctacgacatg672GlnMetValValGlyThrAlaValThrPheTyrIleGlyTyrAspMet210215220gcctttgtcacgccgcagcccttccgccttgacatgaaactcaactgg720AlaPheValThrProGlnProPheArgLeuAspMetLysLeuAsnTrp225230235240gacccgctcagcaagggcgagaacaccgagcccacctgcaagggcgcc768AspProLeuSerLysGlyGluAsnThrGluProThrCysLysGlyAla245250255aactcctccaacgccatcttcggcgtcatcatgtacgcctcgtacctc816AsnSerSerAsnAlaIlePheGlyValIleMetTyrAlaSerTyrLeu260265270tacctcttctgcctcttcttctacatggcctacctgcgcccgaagaag864TyrLeuPheCysLeuPhePheTyrMetAlaTyrLeuArgProLysLys275280285tcgacgcccgcggccaagaagacaaactaatcgcacactaccaaacaatc914SerThrProAlaAlaLysLysThrAsn290295ttccactcgacctagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcgag955<210>6<211>297<212>PRT<213>破囊壺菌<400>6ValIleSerGlyLeuAspLeuLeuProValLeuSerTrpGluThrMet151015LysPheAspThrAlaGluValValSerValTrpLeuArgThrHisMet202530TrpValProPheLeuMetCysPheIleTyrLeuValValIlePheGly354045IleGlnTyrTyrMetGluAspArgLysGluPheAspLeuArgLysPro505560LeuAlaAlaTrpSerAlaPheLeuAlaIlePheSerIleGlyAlaSer65707580IleArgThrValProValLeuLeuLysMetLeuTyrGluLysGlyThr859095HisHisValLeuCysGlyAspThrArgAsnAspTrpValIleAspAsn100105110ProAlaGlyValTrpThrMetAlaPheIlePheSerLysIleProGlu115120125LeuIleAspThrLeuPheIleValLeuArgLysArgLysLeuIleThr130135140LeuHisTrpTyrHisHisValThrValLeuLeuPheCysTrpHisAla145150155160TrpAlaThrPheAlaLeuThrGlyIleValPheAlaAlaIleAsnAla165170175SerValHisAlaIleMetTyrAlaTyrTyrAlaPheThrAlaLeuGly180185190TyrArgProThrSerTyrAlaIleTyrIleThrLeuIleGlnIleMet195200205GlnMetValValGlyThrAlaValThrPheTyrIleGlyTyrAspMet210215220AlaPheValThrProGlnProPheArgLeuAspMetLysLeuAsnTrp225230235240AspProLeuSerLysGlyGluAsnThrGluProThrCysLysGlyAla245250255AsnSerSerAsnAlaIlePheGlyValIleMetTyrAlaSerTyrLeu260265270TyrLeuPheCysLeuPhePheTyrMetAlaTyrLeuArgProLysLys275280285SerThrProAlaAlaLysLysThrAsn290295<210>7<211>708<212>DNA<213>隱甲藻<220><221>CDS<222>(1)..(645)<400>7cggcacgaggtacacatgaccgagaagaggggactgcagttcacgatc48ArgHisGluValHisMetThrGluLysArgGlyLeuGlnPheThrIle151015tgcggctctactggtgagttggtgcagaatctccaggatggtcccact96CysGlySerThrGlyGluLeuValGlnAsnLeuGlnAspGlyProThr202530gccttggcgttgtgcctcttttgcttcagcaaaattcccgagttgatg144AlaLeuAlaLeuCysLeuPheCysPheSerLysIleProGluLeuMet354045gacacggtctttctcatcttgaagggcaagaaggttcgctttttgcag192AspThrValPheLeuIleLeuLysGlyLysLysValArgPheLeuGln505560tggtaccaccacgctaccgtgatgctcttctgctggttggcactggct240TrpTyrHisHisAlaThrValMetLeuPheCysTrpLeuAlaLeuAla65707580acggagtacaccccgggcctctggttcgcggccactaactacttcgtg288ThrGluTyrThrProGlyLeuTrpPheAlaAlaThrAsnTyrPheVal859095cactccatcatgtacatgtacttcttcttgatgaccttcaagacggcc336HisSerIleMetTyrMetTyrPhePheLeuMetThrPheLysThrAla100105110gcaaaggtcgtgaagcccattgcccctctcatcaccatcatccagatc384AlaLysValValLysProIleAlaProLeuIleThrIleIleGlnIle115120125gcccagatggtctggggtctcatcgtcaacggcatcgcgatcaccact432AlaGlnMetValTrpGlyLeuIleValAsnGlyIleAlaIleThrThr130135140ttcttcaccacgggcgcctgccagatccagtccgtgacggtctactcg480PhePheThrThrGlyAlaCysGlnIleGlnSerValThrValTyrSer145150155160gccattgtgatgtacgcttcgtacttctacctcttctcccagctcttc528AlaIleValMetTyrAlaSerTyrPheTyrLeuPheSerGlnLeuPhe165170175ctggaggcatacggatccgctggcaagaacaagaagaagctcgcccgc576LeuGluAlaTyrGlySerAlaGlyLysAsnLysLysLysLeuAlaArg180185190gagctctcccgaaagatctccgaggctctcctgaatagtggcgacgag624GluLeuSerArgLysIleSerGluAlaLeuLeuAsnSerGlyAspGlu195200205gtagccaagcacctcaagtgaactgagcgacctcatcttggtctggtccgc675ValAlaLysHisLeuLys210215caaattgccgcgtgcatgtgcatgagatgctgt708<210>8<211>214<212>PRT<213>隱甲藻<400>8ArgHisGluValHisMetThrGluLysArgGlyLeuGlnPheThrIle151015CysGlySerThrGlyGluLeuValGlnAsnLeuGlnAspGlyProThr202530AlaLeuAlaLeuCysLeuPheCysPheSerLysIleProGluLeuMet354045AspThrValPheLeuIleLeuLysGlyLysLysValArgPheLeuGln505560TrpTyrHisHisAlaThrValMetLeuPheCysTrpLeuAlaLeuAla65707580ThrGluTyrThrProGlyLeuTrpPheAlaAlaThrAsnTyrPheVal859095HisSerIleMetTyrMetTyrPhePheLeuMetThrPheLysThrAla100105110AlaLysValValLysProIleAlaProLeuIleThrIleIleGlnIle115120125AlaGlnMetVa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(quán)利要求2所述的分離核酸序列，其中序列衍生于植物、藻類或真菌。4.如權(quán)利要求2或3所述的分離核酸序列，其中序列衍生于劍葉蘚、破囊壺菌或隱甲藻類。5.包含如權(quán)利要求1至4中任意一項所述的分離核酸的基因構(gòu)建體，其中核酸功能性連接至一個或多個調(diào)節(jié)信號。6.如權(quán)利要求5中所述的基因構(gòu)建體，其基因表達(dá)通過調(diào)節(jié)信號增強。7.基因構(gòu)建體，其包含如權(quán)利要求1至4中任意一項所述的核酸序列和至少另一種編碼脂肪酸生物合成基因的核酸，或其包含如權(quán)利要求5或6中所述的基因構(gòu)建體和至少另一種編碼脂肪酸生物合成基因的核酸。8.如權(quán)利要求7所述的基因構(gòu)建體，其中核酸編碼的脂肪酸生物合成酶選自Δ19-、Δ17-、Δ15-、Δ12-、Δ9-、Δ8-、Δ6-、Δ5-、Δ4-去飽和酶、多種羥化酶、Δ12-乙炔酶、?；?ACP硫酯酶、β-酮脂?；?ACP合成酶或β-酮脂酰基-ACP還原酶。9.氨基酸序列，其由權(quán)利要求1至4中任意一項所述的分離核酸序列編碼，或其由權(quán)利要求5至8中任意一項所述的基因構(gòu)建體編碼。10.載體，其包含如權(quán)利要求1至4中任意一項所述的核酸或包含如權(quán)利要求5至8中任意一項所述的基因構(gòu)建體。11.生物體，其包含至少一種如權(quán)利要求1至4中任意一項所述的核酸、如權(quán)利要求5至8中任意一項所述的基因構(gòu)建體或如權(quán)利要求10所述的載體。12.如權(quán)利要求11所述的生物體，其中該生物體為微生物、動物或植物。13.如權(quán)利要求11或12中所述的生物體，其中該生物體為轉(zhuǎn)基因植物。14.特異性結(jié)合多肽的抗體，其中多肽由權(quán)利要求1至4中任意一項所述的核酸之一編碼。15.反義核酸分子，其包含權(quán)利要求1至4中任意一項所述的核酸的互補序列。16.制備PUFAs的方法，其包括培養(yǎng)包含如權(quán)利要求1中所述的核酸、如權(quán)利要求6中所述的基因構(gòu)建體或如權(quán)利要求10中所述的載體的生物體，其中上述核酸、基因構(gòu)建體或載體在該生物體中形成PUFAs的條件下編碼對脂肪酸分子中具有至少兩個雙鍵的C16-、C18-或C20-脂肪酸延伸至少兩個碳原子的多肽。17.如權(quán)利要求16中所述的方法，其中由該方法制備的PUFAs為在脂肪酸分子中具有至少兩個雙鍵的C18-、C20-或C22-脂肪酸分子。18.如權(quán)利要求16或17中所述的方法，其中C18-、C20-或C22-脂肪酸分子以油、脂類或游離脂肪酸形式分離自生物體。19.如權(quán)利要求16至18中任意一項所述的方法，其中生物體為微生物、動物或植物。20.如權(quán)利要求16至19中任意一項所述的方法，其中生物體為轉(zhuǎn)基因植物。21.如權(quán)利要求16至20中任意一項所述的方法，其中C16-、C18-或C20-脂肪酸為分子中具有三個雙鍵的脂肪酸。22.油、脂類或脂肪酸或其一部分，其由權(quán)利要求16至21中任意一項所述的方法制備。23.油、脂類或脂肪酸組合物，其包含PUFAs且其來自轉(zhuǎn)基因植物。24.如權(quán)利要求23中所述的油、脂類或脂肪酸組合物，其中PUFAs來自轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物包含如權(quán)利要求1至4中任意一項所述的核苷酸序列、如權(quán)利要求5至8中任意一項中所述的基因構(gòu)建體、如權(quán)利要求15中所述的反義核酸分子或如權(quán)利要求10中所述的載體。25.權(quán)利要求22至24中任意一項所述的油、脂類或脂肪酸組合物的用途，其用于飼料、食品、化妝品或藥品。26.一種組合物，其包含權(quán)利要求14中所述的抗體、權(quán)利要求15中所述的反義核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求28中所鑒定的拮抗劑或激動劑。27.試劑盒，其包含如權(quán)利要求1至4中任意一項所述的核酸、如權(quán)利要求5至8中任意一項中所述的基因構(gòu)建體、如權(quán)利要求15中所述的反義核酸分子、如權(quán)利要求14中所述的抗體、如權(quán)利要求28中所鑒定的拮抗劑或激動劑、如權(quán)利要求26中所述的組合物、權(quán)利要求9中所述的氨基酸序列和/或如權(quán)利要求22至25中任意一項所述的油、脂類和/或脂肪酸或其一部分。28.鑒定延伸酶的拮抗劑或激動劑的方法，其包括a)將表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞與侯選物質(zhì)接觸；b)測試PSE活性；c)將PSE活性與缺少侯選物質(zhì)時的標(biāo)準(zhǔn)活性比較，當(dāng)PSE活性高于標(biāo)準(zhǔn)活性表明侯選物質(zhì)為激動劑，當(dāng)PSE活性低于標(biāo)準(zhǔn)活性表明侯選物質(zhì)為拮抗劑。全文摘要本發(fā)明涉及具有序列SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5和SEQIDNO7中所述序列的新延伸酶基因或它們的同系物、衍生物或類似物，涉及包含該基因或其同系物、衍生物或類似物的基因構(gòu)建體，并涉及其用途。本發(fā)明也涉及包含具有序列SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5和SEQIDNO7的延伸酶基因或其同系物、衍生物或類似物的載體或轉(zhuǎn)基因生物體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及延伸酶基因單獨或與其它的延伸酶和/或其它的脂肪酸生物合成基因聯(lián)合的用途。本發(fā)明涉及具有序列SEQIDNO1的新延伸酶基因或其同系物、衍生物和類似物。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及制備多不飽和脂肪酸的方法，并涉及將DNA導(dǎo)入產(chǎn)生大量油類且尤其是產(chǎn)生大量高含量不飽和脂肪酸的生物體的方法。而且，本發(fā)明涉及具較高含量的有至少兩個雙鍵的不飽和脂肪酸的油類和/或脂肪酸制品，和/或具較高含量的有至少兩個雙鍵的不飽和脂肪酸的三酰基甘油制品。文檔編號A23K1/16GK1398300SQ0180469公開日2003年2月19日申請日期2001年2月8日優(yōu)先權(quán)日2000年2月9日發(fā)明者E·海因茨,T·燦克,U·策林格,J·萊爾希爾,A·倫次申請人:巴斯福股份公司