專利名稱：利用大豆總dna導(dǎo)入改良大麥籽粒的營養(yǎng)品質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作物育種領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生蛋白質(zhì)含量提高的大麥種子的方法，以及含有所述大麥種子的飼料。
背景技術(shù)：
大麥?zhǔn)且环N廣泛分布的作物，總面積與總產(chǎn)量在世界各類作物中居第四位。在我國，大麥也是一種重要的農(nóng)作物，約有70％以上用于飼料加工。作為飼料的大麥種子的蛋白質(zhì)含量和氨基酸含量是衡量大麥品質(zhì)的重要指標(biāo)。據(jù)報(bào)道普通大麥種子蛋白質(zhì)含量較低，而且氨基酸組分不均衡，尤其第一限制性氨基酸賴氨酸的平均含量僅為0.47％(孫桂華等，遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996，338-41；桂連起等，糧食與油脂，2001，240-42)。根據(jù)Munch等人(俞志隆等，大麥遺傳與改良，上?？萍汲霭嫔?，1994)的試驗(yàn)顯示，優(yōu)質(zhì)飼料大麥的飼喂報(bào)酬率大大高于一般大麥。因此在目前耕地不斷減少，單產(chǎn)已達(dá)較高水平的情況下，種植優(yōu)質(zhì)高蛋白大麥?zhǔn)翘岣叽篼溕a(chǎn)量的主要途徑。又由于近年來在許多國家先后因使用動(dòng)物飼料不當(dāng)而引起瘋牛病的恐慌事件時(shí)有發(fā)生，在這種情況下培育利用優(yōu)質(zhì)的高蛋白飼料大麥已是當(dāng)務(wù)之急。
在大麥高蛋白育種中，常規(guī)育種是最常用的方法。盡管常規(guī)育種方法在改良作物種子蛋白質(zhì)方面已取得了一些進(jìn)展，如高賴氨酸谷物和大麥突變體的獲得，但眾所周知利用純粹的傳統(tǒng)雜交育種，要獲得穩(wěn)定的后代往往需要花費(fèi)很長的時(shí)間(繁殖9-10代以上)，而且提高蛋白質(zhì)含量的幅度也不高，同時(shí)由常規(guī)育種選育的高蛋白大麥大多同時(shí)存在產(chǎn)量低、抗蟲及抗病性差等不良性狀，這是由于對于常規(guī)育種大麥的產(chǎn)量和品質(zhì)之間常存在著不利的負(fù)相關(guān)關(guān)系，使它們在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中難以被推廣應(yīng)用(NelsonO E，Proc.of a panel meeting organized by FAO/IAEA，Sweden，1968；朱睦元等，大麥育種與生物工程，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999，p127)。
20世紀(jì)90年代，有報(bào)道(吳耀武，西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1994，3(1)9-12)嘗試進(jìn)行豌豆與大麥原生質(zhì)體融合，然而該報(bào)道只描述了關(guān)于如何提高兩種物種原生質(zhì)體融合頻率的條件，至今未有后代植株成功再生的報(bào)道。從資料顯示異源物種原生質(zhì)體融合后代的再生的確是很困難的。
隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，植物功能基因分離技術(shù)也不斷完善。先后有人嘗試?yán)媚硞€(gè)功能基因的導(dǎo)入改良作物種子的蛋白質(zhì)含量及質(zhì)量。目前這方面的報(bào)道主要是水稻等作物，大麥在這方面的研究還未見報(bào)道。如Momma K等試圖提高稻米的蛋白質(zhì)含量，將一個(gè)大豆貯藏蛋白基因?qū)胨?，轉(zhuǎn)基因后代檢測顯示稻米蛋白質(zhì)含量比對照提高20％(Momma K，等，Biosci Biotechnol Biochem，1999，63(2)314-318)。為提高水稻的賴氨酸含量，高越峰等人將源于四棱豆的高賴氨酸蛋白基因?qū)胨?，?jīng)檢測大部分轉(zhuǎn)基因水稻葉片中賴氨酸含量有不同程度提高，最高達(dá)16.04％(高越峰等，植物學(xué)報(bào)，2001，43(5)506-511)。張秀君等將兩個(gè)含高賴氨酸蛋白基因cDNA的表達(dá)載體導(dǎo)入玉米，經(jīng)測定13株T1代種子的賴氨酸含量，其中有3株含量提高10％以上(張秀君等，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1999，7(4)363-367)。孫學(xué)輝等采用同樣的方法也獲得賴氨酸含量最高提高16％的轉(zhuǎn)基因玉米植株(孫學(xué)輝等，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2001，9(2)156-158)。從這些報(bào)道顯示，雖然采用1-2個(gè)已知功能的基因?qū)胱魑锏拇_能夠提高種子的蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量，但提高的幅度最高也僅為20％。
種子蛋白質(zhì)是由多基因編碼的性狀(張憲銀，浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2000，12(2)108-111)，因此只采用導(dǎo)入個(gè)別基因的方式，可能很難實(shí)現(xiàn)大幅度地提高作物種子蛋白質(zhì)含量的目的。
利用總DNA導(dǎo)入是基因工程研究中另一種無需載體的導(dǎo)入法。利用此方法改良作物種子的營養(yǎng)品質(zhì)雖然目前也有報(bào)道，如朱新產(chǎn)等將豌豆DNA導(dǎo)入小麥，使小麥的蛋白質(zhì)、總氨基酸、賴氨酸含量分別提高16.22％，15.45％和31.42％(朱新產(chǎn)等，萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，19(2)79-82)，但由于小麥與大麥?zhǔn)遣煌奈锓N，遺傳背景有極大的差異性，大麥與小麥在試驗(yàn)中不存在可比性。
在20世紀(jì)70年代周光宇提出了DNA片段雜交假說，并在80年代建立了利用花粉管通道法直接導(dǎo)入外源DNA的技術(shù)。目前總DNA直接導(dǎo)入技術(shù)的操作已逐漸擴(kuò)展到浸種法、莖注射法等。利用基因槍法導(dǎo)入總DNA改良作物品質(zhì)的操作不論是在大麥方面從未有人嘗試過，在其他所有作物改良研究中也從未有人做過。
因此，本領(lǐng)域中仍然需要一種新的大幅度提高大麥蛋白質(zhì)含量的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蛋白質(zhì)含量提高的大麥種子的產(chǎn)生方法。
本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)含量提高的大麥種子的產(chǎn)生方法，該方法包括a)提供大豆總DNA和大麥種子；b)用基因槍法將大豆總DNA導(dǎo)入大麥種子中；
c)使步驟b)獲得的種子生長并收獲其后代種子；d)鑒定出蛋白質(zhì)含量提高的后代大麥種子。
本發(fā)明另一方面還提供了一種飼料，該飼料含有用上述方法獲得的蛋白質(zhì)含量有所提高的大麥種子。
本發(fā)明還有一方面提供了上述方法獲得的蛋白質(zhì)含量有所提高的大麥種子用于飼料的用途。
本發(fā)明建立了一種快速且操作簡便的改良大麥種子營養(yǎng)品質(zhì)的方法，利用該方法獲得的大麥第一代種子在蛋白質(zhì)、總氨基酸和賴氨酸含量上最高可分別比對照提高47.40％、46.52％和64.44％。而且，經(jīng)過對其后代進(jìn)行表型分析，沒有發(fā)現(xiàn)其它明顯的表型變異現(xiàn)象，其高產(chǎn)、抗病性等性狀并沒有因?yàn)榉N子蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的提高而發(fā)生變化，并且在數(shù)代后可獲得能夠穩(wěn)定遺傳的高蛋白品系。因此，從該大麥種子可制得優(yōu)質(zhì)的飼料，使飼喂報(bào)酬率提高。
具體實(shí)施例方式
具體地說，本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)含量提高的大麥種子的產(chǎn)生方法，該方法包括a)提供大豆總DNA和大麥種子；b)用基因槍法將大豆總DNA導(dǎo)入大麥種子中；c)使步驟b)獲得的種子生長并收獲其后代種子；d)鑒定出蛋白質(zhì)含量提高的后代種子。
在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，所述大豆總DNA可從大豆組織如花、葉、莖、苗、種子等獲得。更佳的是，從大豆種子的胚根和胚芽中獲得大豆總DNA。
從大豆組織中獲得大豆總DNA的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，例如可采用陳永強(qiáng)等報(bào)道(遺傳，1979，1(1)39-40；Bendich A.J等，Plant Physiology，1967，42(7)959-967)的快速提取植物組織DNA的方法來制備獲得大豆總DNA。
本發(fā)明方法中所用的大豆和大麥并不局限于任何特定的品種(系)，但是為了使大麥種子蛋白質(zhì)含量有較大的提高，宜選用蛋白質(zhì)含量較高的品系。另外，在選擇大麥品系，宜根據(jù)大麥抗病性、產(chǎn)量等性狀來選擇較佳的大麥品種(系)作為受體。
在本發(fā)明的方法中，采用基因槍(基因顆粒轟擊)轟擊方法將大豆總DNA轉(zhuǎn)化到大麥種子?；驑屴Z擊方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，它利用小顆粒進(jìn)行高速彈道貫穿，在這些小珠或顆粒的基質(zhì)中帶有核酸，從而將目標(biāo)基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)。該方法例如可參見Klein等，Nature，1987，32770-73和Weeks等，Plant Physiology，1993，1021077-1084)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)公知技術(shù)來確定待導(dǎo)入總DNA的濃度以及壓力等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行基因槍的條件。在本發(fā)明的一個(gè)較佳的方案中，基因槍處理宜采用1300psi和1500psi的壓力，更佳的宜采用1300psi的壓力。
在導(dǎo)入大豆總DNA后，可用常規(guī)方法使大麥種子生長并栽培獲得后代種子，然后選出蛋白質(zhì)有所提高的單株進(jìn)行播種，連續(xù)數(shù)代后得到遺傳性狀穩(wěn)定的種子。大麥種子的蛋白質(zhì)含量和氨基酸含量的測定可用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。
在用本發(fā)明方法獲得了高產(chǎn)、抗病且蛋白質(zhì)含量大幅度提高的大麥種子后，就可對其進(jìn)行飼料加工，獲得優(yōu)質(zhì)的大麥飼料。
下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實(shí)施例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發(fā)明。
實(shí)施例1.供試材料的準(zhǔn)備外源大豆DNA供體為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供的南農(nóng)87-C38大青豆(Glycine max)；受體大麥為上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所大麥?zhǔn)姨峁┑母弋a(chǎn)、抗病性好大麥品系980662。
2.總DNA制備大青豆干種子經(jīng)蒸餾水浸泡24小時(shí)后，剝?nèi)∨吒团哐?。采用陳永祥和Bendich等人的方法(陳永強(qiáng)，遺傳，1979，1(1)39-40；Bendich A.J等，Plant Physiology，1967，42(7)959-967)為基礎(chǔ)的快速提取植物組織DNA的方法制備供體DNA。提純后的DNA經(jīng)紫外光譜測定A260/230＝2.31，A260/280＝2.03，符合作為外源DNA導(dǎo)入的要求。
3.外源DNA的導(dǎo)入980662大麥種子經(jīng)20％次氯酸鈉滅菌后，無菌水浸種24小時(shí)。將萌動(dòng)種子鋪于1/2MS鹽分培養(yǎng)基(Murashige T.等，Physiol Plant，15473-479)的中央，芽點(diǎn)朝上，24小時(shí)后進(jìn)行基因槍轟擊(Klein等人，Nature，1987，32770-73)。大豆總DNA濃度為3400ug/ul，基因槍處理分別采用兩種壓力1300psi和1500psi，每皿打兩槍。30小時(shí)后將種子移入相同培養(yǎng)基培養(yǎng)。出苗后與未經(jīng)DNA處理的對照一起種植于試驗(yàn)田中，經(jīng)常規(guī)栽培獲得后代種子。
4.后代材料的獲得從第一代材料中，選出蛋白質(zhì)含量較高的單株于當(dāng)年秋按穗行播種，獲得第二代種子。再選出蛋白質(zhì)含量較高的單株繼續(xù)種植獲得第三代種子，同樣操作收獲第四代種子。
5.大麥種子處理在大麥穗子基部選擇五粒飽滿種子，去種皮，于研缽內(nèi)研磨成粉，60℃烘4小時(shí)，放置干燥瓶中備用。
6.大麥種子蛋白質(zhì)含量和氨基酸含量分析種子蛋白質(zhì)含量測定采用微量凱氏定氮法(朱展才，稻麥質(zhì)量分析，中國食品出版社，1988)。氨基酸含量采用HITACHI(日立)835-50型氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測定。
利用基因槍法將大豆總DNA導(dǎo)入大麥品系980662，兩種壓力處理共獲得144個(gè)單株后代(1300psi74個(gè)單株，1500psi70單株)(見表1)。如表1所示，在兩種壓力處理中各獲得6個(gè)單株種子蛋白質(zhì)含量比當(dāng)年對照(13.29％)有明顯提高的后代。它們的蛋白質(zhì)含量分別是1300psi16.70％、16.52％、17.91％、19.59％、17.44％和18.56％；1500psi18.46％、17.31％、16.51％、18.81％、18.81和19.02％。方差分析顯示，與對照組都有極顯著的差異(P＜0.01)。第一代種子蛋白質(zhì)含量最高可比對照提高47.40％。
在檢測第一代大麥種子蛋白質(zhì)含量的基礎(chǔ)上，對這12個(gè)高蛋白單株的種子進(jìn)行氨基酸含量分析(結(jié)果見表1)。測定結(jié)果顯示，兩種處理獲得的高蛋白變異后代隨著種子蛋白質(zhì)含量增加的同時(shí)，種子總氨基酸和各種氨基酸含量也有明顯提高。經(jīng)直線相關(guān)分析顯示，導(dǎo)入大豆總DNA的后代種子總氨基酸含量與蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)關(guān)系，賴氨酸等7種測定的必需氨基酸含量與總氨基酸含量也都呈正相關(guān)關(guān)系。對照種子賴氨酸含量為0.45％，經(jīng)基因槍導(dǎo)入大豆總DNA后獲得的高蛋白大麥種子賴氨酸含量最高值達(dá)到0.74％，比對照提高了64.44％。第一代高蛋白材料又經(jīng)過三代繼續(xù)種植篩選，在第四代獲得了蛋白質(zhì)含量能夠穩(wěn)定遺傳的高蛋白株系。
表1導(dǎo)入大豆總DNA的第一代大麥后代種子各氨基酸、總氨基酸和蛋白質(zhì)含量(mg/100mg)

綜合四代的分析結(jié)果可以得知，利用基因槍法能夠提高大麥種子的蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量，而且效果很好，在第四代即可獲得能夠穩(wěn)定遺傳的高蛋白品系。
雖然導(dǎo)入大麥中的DNA不是一個(gè)目的性非常明確的高蛋白基因，而且由于沒有抗性標(biāo)記基因協(xié)助篩選，從而增加了后期篩選的工作量。但從食品的安全性角度考慮，目前許多可能存留抗生素等抗性選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因作物的推廣已受到限制，而本發(fā)明中利用總DNA導(dǎo)入法培育的高蛋白大麥中不存在任何可能影響動(dòng)物或人類的不利基因，因此其推廣不會(huì)受到限制。
在本發(fā)明實(shí)施過程中，還對經(jīng)大豆DNA導(dǎo)入的后代進(jìn)行表型分析，除了在第一代基因槍法處理后代中曾出現(xiàn)兩棵植株明顯高于對照的情況外，沒有發(fā)現(xiàn)其它明顯的表型變異現(xiàn)象，其高產(chǎn)、抗病性等性狀因?yàn)榉N子蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的提高而發(fā)生變化。在本發(fā)明中成功培育高蛋白大麥品系表明，利用基因槍法導(dǎo)入大豆總DNA的方法不僅可以快速有效地提高大麥種子的蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量，而且還能克服大麥高產(chǎn)與高蛋白之間的負(fù)相關(guān)性。
盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)含量提高的大麥種子的產(chǎn)生方法，其特征在于，該方法包括a)提供大豆總DNA和大麥種子；b)用基因槍法將大豆總DNA導(dǎo)入大麥種子中；c)使步驟b)獲得的種子生長并收獲其后代種子；d)鑒定出蛋白質(zhì)含量提高的后代種子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述大豆總DNA從大豆的花、葉、莖、苗、種子獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述大豆總DNA從大豆種子的胚根和胚芽中獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述大豆為南農(nóng)87-C38大青豆。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述大麥種子來自大麥980662品系。
6.一種飼料，其特征在于，所述飼料含有用權(quán)利要求1所述的方法獲得的大麥種子。
7.權(quán)利要求1所述方法得到的大麥種子用于飼料的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)含量提高的大麥種子的產(chǎn)生方法，該方法包括a)提供大豆總DNA和大麥種子；b)用基因槍法將大豆總DNA導(dǎo)入大麥種子中；c)使步驟b)獲得的種子生長并收獲其后代種子；d)鑒定出蛋白質(zhì)含量提高的后代種子。本發(fā)明還提供了含該大麥種子的飼料。本發(fā)明方法獲得的大麥第一代種子蛋白質(zhì)含量與對照相比有大幅度提高，且其他性狀并沒有因?yàn)榉N子蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的提高而變化。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1548538SQ0311685
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月12日
發(fā)明者李建粵, 張國榮, 許燕, 毛萬霞, 呂英海 申請人:上海師范大學(xué)