專利名稱：銀鯽品種培育和苗種生產(chǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，更具體涉及一種快速進(jìn)行銀鯽品種培育和苗種生產(chǎn)的方法。
背景技術(shù)：
在脊椎動物中行單性生殖方式的物種非常罕見，魚類中有少數(shù)物種以雌核發(fā)育方式繁殖(桂建芳，1989)。分布于我國的銀鯽因其具有雌核發(fā)育單性生殖方式，已在魚類遺傳育種方面取得了重大突破，由此培育的異育銀鯽已在全國推廣養(yǎng)殖，促進(jìn)了水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展(蔣一珪等，1983；桂建芳，1997)。
雌核發(fā)育銀鯽最初發(fā)現(xiàn)于黑龍江方正縣的雙鳳水庫，鑒定為三倍體種群(單仕新、蔣一珪，1988)。該物種的卵子可以通過異源的精子激動雌核發(fā)育(俞豪祥，1982；蔣一珪等，1983)。與其它雌核發(fā)育物種相比，銀鯽更為有趣，在其自然種群中存在少量的雄性個體(5-20％)(蔣一珪等，1983；桂建芳，1997)，而其它雌核發(fā)育物種都是由雌性個體組成(Vrijenhoek 1994)。繁育實驗結(jié)果表明銀鯽的卵子用其同源的銀鯽精子授精能產(chǎn)生正常子代，而且在其子代中存在一定的雄性個體(蔣一珪等，1983；桂建芳，1997)。
雌核發(fā)育銀鯽存在豐富的遺傳多樣性，種群內(nèi)具有多個品系(朱藍(lán)菲，1990)，其中以品系D為母本的人工繁殖的高體型異育銀鯽在全國推廣養(yǎng)殖，促進(jìn)了鯽魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。不同的品系不僅在體型、生長速度、繁殖特性、染色體以及其它生物學(xué)特征上都存在差異(朱藍(lán)菲等，1987；1993；Zhou et al.，2002)，而且在轉(zhuǎn)鐵蛋白、同工酶、線粒體DNA限制性長度多態(tài)性分析、RAPD(隨機擴增多態(tài)性DNA)和SCAR(序列特異擴增區(qū)域)等分子遺傳標(biāo)記上也存在顯著差異(樊連春等，2000；Zhou et al.，2000；2001；Yanget al.，2001)。這些證據(jù)表明銀鯽的不同品系具有不同的遺傳背景，品系間的遺傳差異顯著。近年來，在銀鯽養(yǎng)殖的苗種生產(chǎn)實踐中，常常出現(xiàn)品種混雜和苗種死亡率高的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象可能與銀鯽獨特的生殖方式有關(guān)。
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Zhou L，Gui JF.Karyotypic diversity in polyploid gibel carp，Carassius auratus gibelioBloch.Genetica，2002，115(2)223-232發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種快速進(jìn)行銀鯽品種培育和苗種生產(chǎn)的方法，它利用銀鯽獨特的生殖方式，突破了傳統(tǒng)育種的繁瑣，簡便易行，可防止品種混雜現(xiàn)象，提高苗種的存活率。
本發(fā)明是在運用分子遺傳標(biāo)記證實銀鯽具有兩種生殖方式的基礎(chǔ)上提出的。利用銀鯽品系的多樣性和種群內(nèi)存在的雄性個體，運用已鑒定的RAPD標(biāo)記，結(jié)合用不同精子(如銀鯽不同雌核發(fā)育系的雄魚精子和來源于其它魚類如鯉魚的異源精子)所進(jìn)行的繁育試驗、細(xì)胞學(xué)觀察、RAPD分析、特異DNA片段的克隆和測序等研究，證實銀鯽卵子具有雌核發(fā)育生殖和兩性融合生殖兩種不同的生殖方式。即當(dāng)銀鯽的卵子與異源的精子(如紅鯉)授精后，進(jìn)入卵內(nèi)的精核不解凝，僅起刺激胚胎發(fā)育作用。在這種情況下，父本的基因組對子代沒有貢獻(xiàn)，或僅摻入微量的DNA物質(zhì)。這種生殖方式導(dǎo)致產(chǎn)生了遺傳一致的后代，不產(chǎn)生雄性個體。這是一種典型的雌核生殖。當(dāng)銀鯽的卵子與其同源的精子授精后，進(jìn)入卵內(nèi)的精核解凝，形成雄性原核，并與雌性原核融合。在這種情況下，產(chǎn)生遺傳分化的兩性子代，這是一種兩性生殖方式。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，銀鯽的遺傳多樣性和兩性生殖方式為銀鯽種群提供了豐富的遺傳變異，雄性個體的存在為種群創(chuàng)造了更多的遺傳多樣性。
針對銀鯽品種混雜和苗種死亡率高等問題，在闡明銀鯽兩種生殖方式的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了多年的人工繁育試驗、對各個繁育組合的胚胎發(fā)育存活率、性比和表型分化進(jìn)行了統(tǒng)計分析，結(jié)果表明銀鯽卵子在用異源或同源的精子授精后，表現(xiàn)出不同的發(fā)育命運。銀鯽卵子無論是與異源的紅鯉精子還是與同源的銀鯽精子授精后，胚胎都能產(chǎn)生正常的后代。但是，在以異精雌核發(fā)育方式繁衍的組合中，其胚胎發(fā)育正常，魚苗的孵化率和存活率都高，畸苗少，下塘養(yǎng)殖后很少死亡。而在用銀鯽不同品系的雌雄個體以兩性生殖方式繁衍的試驗組合中，其胚胎的孵化率及開口攝食時魚苗的存活率明顯低于以異精雌核發(fā)育方式繁衍的結(jié)果。兩性生殖產(chǎn)生的畸苗游動不正常，在水中不斷打轉(zhuǎn)，直至扭曲為彎月形，在下塘前相繼死亡。因此，異精雌核發(fā)育子代的存活率顯著高于兩性生殖子代的存活率。
就體型而言，用異源的紅鯉精子授精所產(chǎn)生的雌核發(fā)育后代具有與其母本一致的表型，而與同源的銀鯽精子授精后所產(chǎn)生的子代性狀發(fā)生分化，除產(chǎn)生與母本或父本一致的表型外，還可產(chǎn)生新的表型。
異精雌核發(fā)育的子代與兩性生殖子代中的性比也有顯著差異。所有異精雌核發(fā)育子代都為可育的雌性個體，而兩性生殖子代中大約有11-14％可育的雄性個體，即在第二年春季時，體表粗糙、鰓蓋和胸鰭上有“追星”，輕擠腹部有精液溢出，解剖觀察發(fā)現(xiàn)具有發(fā)育成熟的精巢；兩性生殖子代中還存在15-23％的不育個體，即腹部非常扁平，輕擠腹部無卵子也無精液溢出，解剖發(fā)現(xiàn)不具成熟的卵巢或精巢，僅有一細(xì)線狀的性腺，周圍包裹著大量的脂肪組織。
將同一兩性生殖繁育組合的后代在同一池中養(yǎng)殖一年的魚按性別分別稱重。結(jié)果表明，各個繁育組合中大多數(shù)較小個體為雄性或為不育個體，雄性的生長速度明顯低于雌性個體的生長速度，從而大大影響每公頃的平均產(chǎn)量，導(dǎo)致產(chǎn)量降低。
依據(jù)上述發(fā)現(xiàn)和觀點，確立了銀鯽品種培育的技術(shù)路線和方法。簡單地說，利用銀鯽種群的品系多樣性和其具備的兩性生殖能力，選擇優(yōu)良的兩個品系，通過一次兩性生殖的方式獲得大量遺傳重組的后代，并從中選擇出有生長潛力的個體；而異精雌核生殖的方式可以突破雜種不育的障礙，也可克服兩性生殖后代分離的缺陷，由此再通過一次異精雌核生殖將包括生長在內(nèi)的優(yōu)良性狀穩(wěn)定遺傳下去。因此，僅需兩代的遺傳育種，就有可能建立穩(wěn)定的優(yōu)良品系。
銀鯽兩性生殖子代的孵化率和出苗率明顯低于異精雌核發(fā)育子代的孵化率和出苗率，而且魚苗下塘后，兩性生殖子代的死亡率也比異精雌核發(fā)育子代要高，這是因為兩個不同的克隆經(jīng)兩性融合生殖后，由于染色體數(shù)不同等遺傳差異引起的不平衡。導(dǎo)致了一些個體死亡，解答出銀鯽養(yǎng)殖中為什么出現(xiàn)品種混雜和苗種死亡率高的原因。因此，在銀鯽優(yōu)良品種的苗種生產(chǎn)中，應(yīng)該嚴(yán)格采取異精雌核發(fā)育的生殖方式，才能保證優(yōu)良性狀的穩(wěn)定遺傳。而銀鯽的兩性生殖方式必須在魚類遺傳育種研究工作者的嚴(yán)格控制下合理地利用，才能有望從中獲得具有優(yōu)良性狀的重組個體，否則會導(dǎo)致品種混雜和退化。
本發(fā)明的優(yōu)點在闡明銀鯽兩種生殖方式的遺傳基礎(chǔ)上，解答出銀鯽養(yǎng)殖中為什么出現(xiàn)品種混雜和苗種死亡率高的原因，確立了銀鯽品種培育和苗種生產(chǎn)的技術(shù)路線和方法，以快速培育銀鯽品種，提高了苗種存活率，防止了品種混雜和退化。
具體實施例方式
銀鯽品種培育和苗種生產(chǎn)的方法，其具體步驟是1、利用銀鯽的兩性生殖方式獲得遺傳重組的后代。即首先采用已鑒定的轉(zhuǎn)鐵蛋白、RAPD和SCAR等分子遺傳標(biāo)記來鑒定銀鯽的不同品系，選擇分別來自于兩個不同銀鯽品系(具有生長快或其它優(yōu)良性狀)的雌雄個體作為品種培育的親本。親魚的選擇、培育、人工催情、人工受精、受精卵孵化和苗種培育參照桂建芳所述進(jìn)行(桂建芳，1999)。通常，催情產(chǎn)卵通過人工注射鯉魚丙酮干燥的腦垂體(PG)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)和促排卵素(LRH)的混合液(桂建芳，1999)。母本的有效劑量為1mg/kg的PG，300～500國際單位的HCG，1.0～2.0ug/kg的LRH。父本劑量一般為母本劑量的二分之一。將成熟排卵的銀鯽雌親魚和成熟的銀鯽雄魚捕起，將雌魚卵子擠入擦干的器皿中，同時擠入雄魚的精液，用干羽毛輕輕均勻攪拌1～2分鐘，加入少量生理鹽水后再輕輕攪拌，然后倒入泥漿水脫粘或用羽毛撒在瓷盤或紗網(wǎng)上，放入孵化設(shè)施中孵化。將孵化的魚苗進(jìn)行發(fā)塘養(yǎng)殖至當(dāng)年年底并將每個個體稱重。通過這樣一次兩性生殖的方式可以獲得大量遺傳重組的后代，并有望從中選擇出有生長潛力等優(yōu)良性狀的個體。年底稱重后選擇生長快的雌性個體作為第二次繁育的親魚進(jìn)行培育。
2、利用銀鯽的雌核發(fā)育生殖方式，進(jìn)行銀鯽優(yōu)良品種的篩選和苗種生產(chǎn)。即將上述選擇出的生長快和品質(zhì)優(yōu)的銀鯽雌性個體和紅鯉的雄性個體進(jìn)行催情，將雌性個體產(chǎn)下的成熟卵子與紅鯉產(chǎn)下的精子授精，所獲得的子代進(jìn)行發(fā)塘養(yǎng)殖并進(jìn)行生長對比試驗。由于異精雌核生殖方式可以突破雜種不育的障礙，也可克服兩性生殖后代分離的缺陷，因此通過這樣一次異精雌核生殖可將包括生長在內(nèi)的優(yōu)良性狀穩(wěn)定遺傳下去。經(jīng)過生長對比試驗后，就能選擇出具有生產(chǎn)潛力的優(yōu)良新品種。選出的優(yōu)良品種必須嚴(yán)格按異精雌核發(fā)育生殖方式進(jìn)行規(guī)?；拿绶N生產(chǎn)，以避免品種混雜和退化，保證優(yōu)良性狀穩(wěn)定遺傳。
權(quán)利要求
1.一種銀鯽品種培育和苗種生產(chǎn)的方法，它包括下列步驟A、利用銀鯽的兩性生殖方式獲得遺傳重組的后代，首先采用已鑒定的轉(zhuǎn)鐵蛋白、RAPD和SCAR分子遺傳標(biāo)記來鑒定銀鯽的不同品系，選擇分別來自于兩個不同銀鯽品系的雌雄個體作為品種培育的親本；其次是親魚的選擇、培育、人工催情、人工受精、受精卵孵化和苗種培育，催情產(chǎn)卵通過人工注射鯉魚丙酮干燥的腦垂體、人絨毛膜促性腺激素和促排卵素的混合液；第三是母本的有效劑量為1mg/kg的PG，300～500國際單位的HCG，1.0～2.0ug/kg的LRH；第四是父本劑量為母本劑量的二分之一；第五是將成熟排卵的銀鯽雌親魚和成熟的銀鯽雄魚捕起，將雌魚卵子擠入擦干的器皿中，同時擠入雄魚的精液，用干羽毛均勻攪拌1～2分鐘，加入生理鹽水后再攪拌，然后倒入泥漿水脫粘或用羽毛撒在瓷盤或紗網(wǎng)上，放入孵化設(shè)施中孵化；第六是將孵化的魚苗進(jìn)行發(fā)塘養(yǎng)殖至當(dāng)年年底，獲得遺傳重組的后代；B、利用銀鯽的雌核發(fā)育生殖方式，進(jìn)行銀鯽品種的篩選和苗種生產(chǎn)，將A步驟中擇出的銀鯽雌性個體和紅鯉的雄性個體進(jìn)行催情，將雌性個體產(chǎn)下的成熟卵子與紅鯉產(chǎn)下的精子授精，所獲得的子代進(jìn)行發(fā)塘養(yǎng)殖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種銀鯽品種培育和和苗種生產(chǎn)的方法，其特征是分別利用銀鯽的兩性生殖方式獲得遺傳重組的后代，選擇不同銀鯽品系的雌雄作為品種培育的親本，催情產(chǎn)卵，將雌魚卵子接入器皿中，加入鹽水?dāng)嚢?，發(fā)塘培育，然后進(jìn)行銀鯽品種的篩選和苗種生產(chǎn)，擇出銀鯽雌性個體和紅鯉的雌性個體進(jìn)行催情，將成熟卵子與紅鯉產(chǎn)下的精子授精，發(fā)塘培育。本發(fā)明簡便易行，防止了品種混雜和退化，提高了苗種存活率。
文檔編號A01K61/00GK1454467SQ03128109
公開日2003年11月12日 申請日期2003年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月6日
發(fā)明者桂建芳, 周莉 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所