專利名稱：利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)培育花椰菜再生植株的方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于一種蔬菜育種材料的培養(yǎng)方法，特別涉及一種利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)培育花椰菜再生植株的方法
背景技術(shù)：
目前蕓薹屬蔬菜育種中游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟，如大白菜、甘藍型油菜、莖椰萊(綠菜花)等蔬菜采用游離小孢子培養(yǎng)均獲得了成功，并應(yīng)用于育種工作中?；ㄒ藢儆谑|苔屬蔬萊，但是應(yīng)用其他蕓苔屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)方法根難獲得成功。特別是花椰菜小孢子胚的植株再生一直是世界上尚未解決的技術(shù)難點，花椰萊小孢子培養(yǎng)可以得一定數(shù)量的球形期胚和心形期胚，但此時的胚一般不再繼續(xù)發(fā)育停滯于這個時期，即使繼代也不會成苗而逐漸褐化死亡。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于提供一種利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得花椰菜再生植株的方法，這種方法解決了小孢子胚停滯發(fā)育的問題，使得到的小孢子胚經(jīng)過繼代培養(yǎng)繼續(xù)發(fā)育成為再生植株。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)培育花椰菜再生植株的方法，是待小孢子胚長產(chǎn)生時，轉(zhuǎn)到溫度25℃、光照4000LX、光周期12-16hr/d的光照條件下培養(yǎng)，將轉(zhuǎn)綠后的胚轉(zhuǎn)移到含蔗糖3％的MS無激素固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，直至幼苗長成；其特征在于在含蔗糖3％的MS無激素固體培養(yǎng)基中添加激動素、6芐基嘌呤和萘乙酸三種生長素。
上述激動素的濃度范圍為0.01-3ppm、6芐基嘌呤濃度范圍為0.01-3ppm、萘乙酸濃度范圍在0.01-3ppm。
本發(fā)明的優(yōu)點是1、可有效地解決小孢子胚發(fā)育停滯不前的問題，使獲得的小孢子胚70 80％能發(fā)育成為再生植株。由于一個胚代表著一種遺傳基因型，所以此方法的成功為花椰萊育種提供了大量的新基因型純系，極大地豐富了花椰菜育種資源。2、可加快育種步伐，大大的縮短育種時間，為應(yīng)用生物技術(shù)開展花椰菜育種奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
具體實施例方式一種利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)花椰菜的方法，依下列步驟進行①取材取花蕾長3-6mm的花序，其花粉發(fā)育時期為單核晚期。②材料滅菌用7％(w/v)飽和次氯酸鈣溶液，表面消毒15分鐘，用無菌水沖洗3次。③小孢子的收集與培養(yǎng)將無菌的花蕾放入研缽中，加入少量B5洗滌培養(yǎng)基(配方見附表)，用研缽輕壓材料，使小孢子從花藥中游離出來，用45μm孔徑的尼龍網(wǎng)過濾，收集濾液1000轉(zhuǎn)/分，離心3次，每次3分鐘，最后一次離心后，將小孢子懸浮于經(jīng)過抽濾滅菌的NLN培養(yǎng)基(配方見附表)中，將小孢子濃度調(diào)整為1×10/ml，采用液體培養(yǎng)的方法，每個60×15mm培養(yǎng)皿中放入2-3ml，石蠟?zāi)し饪?；?jīng)33℃、24hr高溫處理后，置于25℃下繼續(xù)暗培養(yǎng)，一般經(jīng)2-3周便可獲得小孢子胚；④小孢子胚培養(yǎng)及再生植株的獲得待小孢子胚產(chǎn)生時，轉(zhuǎn)到溫度25℃、光照4000LX、光周期12hr/d的光照條件下培養(yǎng)，將轉(zhuǎn)綠后的胚轉(zhuǎn)移到含蔗糖3％的MS無激素固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，3-4周便可成果獲得再生植株。在MS培養(yǎng)基中根據(jù)生長情況添加濃度為0.01-3ppm的激動素、濃度為0.01-3ppm的6芐基嘌呤、濃度為0.01-3ppm的萘乙酸。⑤再生植株的馴化；移栽前揭開培養(yǎng)瓶蓋練苗3天，練苗后將帶根幼苗洗去根部殘留的培養(yǎng)基，移栽于裝有育苗營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中，移栽前期用塑料小棚保濕，待幼苗健壯后定植于溫室。
培養(yǎng)基組成(mh/l)化學(xué)名稱 B5NLNMSKNO3300.0 125.0 1900.0MgSO4·7H2O500.0 125.0 370.0Ca(NO3)2·4H2O/ 500.0 /CaCl2·2H2O750.0 / 440.0KH2PO4/ 125.0 170.0NaH2PO4·H2O 150.0 / /(NH4)2·SO4134.0 / /NH4NO3/ / 1650.0Fe-EDTA 40.0 40.0 40.0MnSO4·4H2O10.0 22.3 22.3H3BO33.06.26.2ZnSO4·7H2O2.08.68.6Na2MoO4·2H2O 0.25 0.25 0.25CuSO4·5H2O0.025 0.025 0.025CoCl·6H2O 0.025 0.025 0.025KI 0.75 0.83 0.83甘氨酸 / 2.02.0肌醇 100.0 100.0 100.0煙酸 1.00.50.5B61.00.50.5B11.00.50.4生物素 / 0.05 /葉酸 / 0.5/谷胺酰氨 / 800.0 /絲氨酸 / 100.0 /谷胱甘肽 / 30.0 /蔗糖 130000.0 130000.0 30000.0瓊脂 / / 10000.0
權(quán)利要求
1.一種利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)培育花椰菜再生植株的方法，是待小孢子胚長產(chǎn)生時，轉(zhuǎn)到溫度25℃、光照4000LX、光周期12-16hr/d的光照條件下培養(yǎng)，將轉(zhuǎn)綠后的胚轉(zhuǎn)移到含蔗糖3％的MS無激素固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，直至幼苗長成；其特征在于在含蔗糖3％的MS無激素固體培養(yǎng)基中添加激動素、6芐基嘌呤和萘乙酸三種生長素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)培育花椰菜再生植株的方法，其特征在于上述激動素的濃度范圍為0.01-3ppm、6芐基嘌呤濃度范圍為0.01-3ppm、萘乙酸濃度范圍在0.01-3ppm。
全文摘要
一種利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)培育花椰菜再生植株的方法，是待小孢子胚長產(chǎn)生時，轉(zhuǎn)到溫度25℃、光照4000LX、光周期12－16hr/d的光照條件下培養(yǎng)，將轉(zhuǎn)綠后的胚轉(zhuǎn)移到含蔗糖3％的MS無激素固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，直至幼苗長成；其特征在于在含蔗糖3％的MS無激素固體培養(yǎng)基中添加激動素、6芐基嘌呤和萘乙酸三種生長素。本發(fā)明的優(yōu)點是1.可有效地解決小孢子胚發(fā)育停滯不前的問題。由于一個胚代表著一種遺傳基因型，所以此方法的成功為花椰萊育種提供了大量的新基因型純系，極大地豐富了花椰菜育種資源。2.可加快育種步伐，大大的縮短育種時間。
文檔編號A01H4/00GK1552198SQ0312998
公開日2004年12月8日 申請日期2003年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月5日
發(fā)明者孫德嶺, 蔡榮期, 趙前程 申請人:天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司