專利名稱：具有高δ－維生素E含量的向日葵種子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，涉及具有高δ-維生素E含量的種子。從所述種子中榨制出的油具有高抗氧化性且適用于食品和工業(yè)應(yīng)用(生物燃料和潤(rùn)滑劑)。所述油及其副產(chǎn)品可應(yīng)用于提取在食品、化妝品和藥品工業(yè)上具有廣泛用途的δ-維生素E。
背景技術(shù)：
維生素E是存在于種子油中的具有抗氧化性的主要天然組分。由于其為脂溶性的，它可以在榨制過(guò)程中進(jìn)入油中，并發(fā)揮重要的抗氧化作用，不論是在瓶裝油中還是在含有植物油的食品中(F.B.Padley等.，1994；Occurrence andcharacteristics of oils and fats.In the Lipid Handbook，ed.F.D.Gunstone，J.L.，Harwood and F.B.Padley，London；Chapman & Hall，pp 47-223)。在現(xiàn)有的四種類型的維生素E中(α-，β-，γ-和δ-維生素E)，在體外，換言之在人體之外具有最大的抗氧化活性的維生素是β-，γ-和δ-維生素E，而α-維生素E與其它三種維生素E相比，具有明顯較低的體外活性(G.Pongracz等，Tocopherole，Antioxidanten der Natur.Fat Science and Technology 97；90-104，1995)。
普通向日葵種子中，α-維生素E占維生素E的絕大部分比例，它占維生素E總含量的大約95％，其余為β-維生素E和γ-維生素E，占維生素E總含量的小于5％(F.B.Padley等，1994 cited work)。由于α-維生素E在向日葵種子中的優(yōu)勢(shì)，它的油表現(xiàn)出比其它從具有更高的β-、γ-和/或δ-維生素E比例的種子中榨制的植物油低的抗氧化性，后者具有更好的體外抗氧化作用。表1所示為主要種子油中維生素E的組成。
表1主要種子油中維生素E的平均組成

在向日葵種子中，α-維生素E的優(yōu)勢(shì)實(shí)際上是一致的，且只有向日葵的4個(gè)品系顯示出維生素E改良的水平，其可以分為兩類a)γ-維生素E具有高含量。這涉及兩個(gè)品系γ-維生素E的形式占維生素E的85％以上，剩下的為α-維生素E。其中之一為L(zhǎng)G-17，是在俄羅斯培育的(Y.Demurin，Genetic variability of tocopherol composition in sunflowerseeds，.Helia 1659-62，1993)，另一種是在西班牙培育的，為T2100(L.Velasco等，Registration of T589 and T2100 sunflower germplasms with modified tocopherolprofiles，Crop Science，in press)。
b)β-維生素E具有平均含量。這涉及兩個(gè)品系在種子中β-維生素E的形式占維生素E的30％-50％，剩下的為α-維生素E。其中一種為L(zhǎng)G-15，是在俄羅斯培育的(Y.Demurin，如前引用)，另一種為T589，是在西班牙培育的(L.Velasco等，in press，如前引用)。
通過(guò)LG-15和LG-17兩個(gè)品系的雜交，俄羅斯和南斯拉夫的研究人員獲得了δ-維生素E水平略微增加的重組體，所獲得的δ-維生素E的最高水平為種子中所有維生素E含量的25％(Y.Demurin等.Genetic variability of tocopherolcomposition in sunflower seeds as a basis of breeding for improved oil quality.PlantBreeding 11533-36，1996)。總之，現(xiàn)有向日葵種子中含量最高的各種維生素E為
*95％α-維生素E(天然組成)*50％β-維生素E*95％γ-維生素E*25％δ-維生素E發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一為具有高δ-維生素E含量的向日葵種子，其δ-維生素E的含量占總維生素E的26％-80％，且其它維生素E的含量如下占總維生素E的0.5％-45％的α-維生素E；占總維生素E的0％-60％的β-維生素E；占總維生素E的0％-70％的γ-維生素E。其中一些種子中δ-維生素E的含量總是占超過(guò)種子中維生素E總含量的50％、65％和75％。高δ-維生素E含量的特征是可遺傳的(通過(guò)自花授粉)且是可以穩(wěn)定的、獨(dú)立于環(huán)境條件表達(dá)的。
本發(fā)明的另一目的是通過(guò)任何方法從所述種子中榨取的向日葵油，它是天然的、沒(méi)有任何額外添加劑，表現(xiàn)出高δ-維生素E含量(δ-維生素E含量占總維生素E的26％-80％)。
本發(fā)明還包括的一個(gè)目的是向日葵植物(Helianthus annus L.)，它通過(guò)自花授粉，生產(chǎn)的種子具有高δ-維生素E含量(占總維生素E含量的26％-80％)。
發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明涉及向日葵(Helianthus annus L.)的種質(zhì)，特征在于種子中具有高δ-維生素E含量。所述維生素E占種子中總維生素E含量的26％-80％。所述高δ-維生素E水平不是通過(guò)自然界的向日葵生產(chǎn)出來(lái)的，是通過(guò)包括兩輪人工誘導(dǎo)突變?nèi)缓箬b定突變植株，和固定突變特征的復(fù)雜方法產(chǎn)生的。所述高δ-維生素E含量是本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題，其為可遺傳的且總是獨(dú)立于栽培條件產(chǎn)生的。
為了獲得種子具有高濃度δ-維生素E的遺傳學(xué)上修飾過(guò)的植物，進(jìn)行了針對(duì)遺傳學(xué)改變維生素E的生物合成途徑的超長(zhǎng)的遺傳學(xué)改良過(guò)程。該過(guò)程包括4個(gè)階段(1)在普通向日葵品種的種子中誘導(dǎo)人工突變；(2)鑒定因?yàn)檎T導(dǎo)的突變而導(dǎo)致維生素E的生物合成途徑改變的個(gè)體，并且固定突變特征；(3)對(duì)于已經(jīng)表現(xiàn)出在維生素E的生物合成途徑上的第一級(jí)水平的改變的個(gè)體進(jìn)行新的誘導(dǎo)人工突變的處理；(4)鑒定在維生素E的生物合成途徑上的改變與開(kāi)始的個(gè)體表現(xiàn)出的改變不同的個(gè)體，接著固定新的突變特征。
第一個(gè)誘變或?qū)е峦蛔兊娜斯ふT導(dǎo)過(guò)程包括用具有誘變特性的產(chǎn)品，換言之，一種能誘導(dǎo)植物DNA突變的產(chǎn)品處理普通向日葵品種的種子。由于在誘變處理之后，決定維生素E的生物合成途徑的基因的預(yù)期的突變頻率低，隨后要對(duì)幾千個(gè)種子的維生素E組成進(jìn)行無(wú)損分析。
如果檢測(cè)的突變具有任何的商業(yè)效用，它們必須是可遺傳并可獨(dú)立于栽培植物的環(huán)境條件表達(dá)的。為此，進(jìn)行選擇步驟，目的是固定突變特征，并且檢驗(yàn)它們?cè)诓煌h(huán)境條件下的穩(wěn)定性。上述步驟之后，排除了若干起初被檢測(cè)到的突變，同時(shí)，固定了具有高γ-維生素E含量(占種子中維生素E總含量的95％)的突變體。該突變體為IAST-1，其表現(xiàn)出的遺傳基礎(chǔ)不同于其它具有高γ-維生素E含量的品系。因此，盡管LG-17和T2100品系與具有普通維生素E組成的品系雜交得到的F2代不發(fā)生對(duì)中間水平的γ-維生素E的分離(Demurin等，如前引用；L.Velasco and J.M.Femandez-Martinez，Identification andgenetic characterisation of new sources of beta-and gamma-tocopherol in sunflowergermplasm，Helia，in press)，突變的IAST-1與具有普通維生素E組成的品系雜交得到的F2代對(duì)γ-維生素E的中間水平發(fā)生大范圍的分離。
在IAST-1突變體發(fā)生遺傳分離后，對(duì)該突變體的種子實(shí)施第二個(gè)誘變步驟，其目的是產(chǎn)生具有高水平的其它維生素E的另外的變異。第二輪誘變之后同樣是為了鑒定突變體所作的大規(guī)模分析步驟，以及突變體的固定和確認(rèn)其能夠獨(dú)立于培育條件的表達(dá)的步驟。在第二輪誘變中，鑒定并且固定了構(gòu)成本發(fā)明目的的突變體，且特征為其種子具有高濃度δ-維生素E，占種子中總維生素E含量的26％-80％。種子中這種高δ-維生素E比例是可遺傳的特征，且是可以獨(dú)立于植株栽培條件穩(wěn)定表達(dá)的。
具體實(shí)施例方式
第一輪誘變Peredovik品種種群的向日葵種子，種子中的維生素E組分包括96％的α-維生素E，3％的β-維生素E和1％的γ-維生素E，于20℃條件下在蒸餾水中浸泡4小時(shí)。之后，將種子放入濃度為70mM的誘變劑甲磺酸乙酯(EMS)的溶液中，該溶液是用pH7.0的0.1M的磷酸緩沖液配制的，以恒定的60rpm的速度攪拌2小時(shí)。在誘變處理之后，用流水清洗種子(M1代)16小時(shí)，然后播種到大田中。
單獨(dú)收獲M1代植株，且它們的種子(M2代)用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)其維生素E組成單獨(dú)進(jìn)行分析，按照F.Goffman等所開(kāi)發(fā)的方法進(jìn)行分析(Quantitative determination of tocopherols in single seeds of rapeseed[Brassicanapus L.].Fest/Lipid 101142-145，1999)。對(duì)總數(shù)為1080的M1代植株進(jìn)行分析，其中之一表現(xiàn)出高水平的γ-維生素E分離，γ-維生素E的最高含量占總維生素E的95％。具有這種γ-維生素E水平的種子產(chǎn)生的植株均一表達(dá)該特征。通過(guò)由含有95％γ-維生素E的種子產(chǎn)生的植株與向日葵的普通品種的植株雜交，在其F2代種子中γ-維生素E的含量發(fā)生廣泛分離，包括介于父母本之間的γ-維生素E的水平。這種廣泛分離是完全不可預(yù)料的，因?yàn)榫哂信c以前培育的品種類似的γ-維生素E水平的這些材料(Demurin等，如前引用；L.Velascoand J.M.Femandez-Martinez，如前引用)在與向日葵的普通品種雜交后不產(chǎn)生中間水平的γ-維生素E的任何分離。獲得的突變體被命名為IAST-1。
第二輪誘變突變體IAST-1的向日葵種子(種子中的維生素E組成包括5％α-維生素E和95％γ-維生素E)于20℃條件下在蒸餾水中浸泡4小時(shí)。之后，將種子放入濃度為4mM的誘變劑疊氮化鈉的溶液中，該溶液是用pH3.0的0.1M的檸檬酸鈉緩沖液配制的，以恒定的60rpm的速度攪拌2小時(shí)。在誘導(dǎo)突變后，用流水清洗種子(M1代)16小時(shí)，然后播種到大田中。
單獨(dú)收獲M1代植株，且它們的種子(M2代)用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)其維生素E組成單獨(dú)進(jìn)行分析，按照F.Goffman等所開(kāi)發(fā)的方法進(jìn)行分析(如前引用)。對(duì)總數(shù)為1240的M1代植株進(jìn)行分析，其中之一表現(xiàn)出高水平的δ-維生素E分離，δ-維生素E的最高含量占總維生素E含量的55％。具有這種δ-維生素E水平的種子產(chǎn)生的植株均一表達(dá)該特征，種子中δ-維生素E的濃度占維生素E總含量的26％-80％之間。上述水平在連續(xù)世代中得到保持。新的向日葵突變品系被命名為IAST-3，該品系種子的δ-維生素E水平占總維生素E的26％-80％。
權(quán)利要求
1.具有高δ-維生素E含量的向日葵種子，其特征在于，種子具有占維生素E總含量26％-80％的δ-維生素E。
2.如權(quán)利要求1所述的具有高δ-維生素E含量的向日葵種子，其特征在于，種子中其它維生素E含量為占維生素E總含量0.5％-45％的α-維生素E；占維生素E總含量0％-60％的β-維生素E；占維生素E總含量0％-70％的γ-維生素E。
3.如權(quán)利要求1和2所述的具有高δ-維生素E含量的向日葵種子，其特征在于，種子中δ-維生素E的含量總是超過(guò)維生素E總含量的50％。
4.如權(quán)利要求3所述的具有高δ-維生素E含量的向日葵種子，其特征在于，種子中δ-維生素E的含量總是超過(guò)維生素E總含量的65％。
5.如權(quán)利要求4所述的具有高δ-維生素E含量的向日葵種子，其特征在于，種子中δ-維生素E的含量總是超過(guò)維生素E總含量的75％。
6.如權(quán)利要求1-5所述的具有高δ-維生素E含量的向日葵種子，其特征在于，按照任何榨油方法進(jìn)行處理，所述種子生產(chǎn)出的油均含26％-80％的δ-維生素E。
7.如權(quán)利要求1-6所述的具有高δ-維生素E含量的向日葵種子，其特征在于，通過(guò)自花授粉，所述種子能夠獨(dú)立于環(huán)境條件地穩(wěn)定表達(dá)高δ-維生素E含量的特征。
8.通過(guò)任何方法從如權(quán)利要求1-7所述的具有高δ-維生素E含量的向日葵種子中榨制的向日葵油，其特征在于，在無(wú)任何外部添加的情況下，它天然具有占總維生素E含量26％-80％的高δ-維生素E含量
9.向日葵植物(Helianthus annus L.)，通過(guò)自花授粉生產(chǎn)如權(quán)利要求1-7所述的表現(xiàn)出高δ-維生素E含量的種子。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)兩輪人工誘導(dǎo)突變而遺傳修飾的向日葵種子，在每一輪突變之后，是鑒定具有理想特征的突變個(gè)體的步驟。所述種子表現(xiàn)的特征為δ－維生素E占維生素E的26％－80％。所述高δ－維生素E產(chǎn)量是由業(yè)已修飾成這種效果的種子的基因型決定的，且總是獨(dú)立于栽培條件獲得的，因此得到了可遺傳的特征。現(xiàn)有技術(shù)中，不存在能產(chǎn)出如此高水平δ－維生素E的向日葵種子。本發(fā)明的目的還包括能通過(guò)自花授粉生產(chǎn)出具有高δ－維生素E水平的種子的遺傳學(xué)修飾的向日葵植物，以及從所述種子中榨制的具有高的天然δ－維生素E濃度的油。
文檔編號(hào)A01H5/10GK1780552SQ200480009560
公開(kāi)日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月10日
發(fā)明者L·貝拉斯科巴羅, J·M·費(fèi)爾南德斯馬丁內(nèi)斯 申請(qǐng)人:康斯喬最高科學(xué)研究公司