專利名稱：苦瓜葉片抗蟲提取物及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)用新型抗蟲劑，涉及苦瓜廢棄物葉片抗蟲提取物及其制備與應(yīng)用。特別涉及以去離子水、乙醚或丙酮為提取溶劑的苦瓜葉片水溶性抗蟲提取物及其制備與其在抗蟲、殺蟲方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蟲害使農(nóng)作物大量減產(chǎn)，為此研制開發(fā)新型無公害抗蟲劑意義重大。當(dāng)今化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，雖然能及時控制農(nóng)業(yè)害蟲的發(fā)生發(fā)展，但是帶來諸多弊病，如化學(xué)殺蟲劑的常年使用使害蟲產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)藥的殘留使農(nóng)田和農(nóng)產(chǎn)品的污染日趨嚴(yán)重，給人類帶來了極大潛在性威脅，對人類的健康及環(huán)境產(chǎn)生極大的危害，特別是人們直接食用的蔬菜植物，使用化學(xué)農(nóng)藥更容易直接受害；而抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的培育雖然有望避免藥害、減少蟲害給農(nóng)業(yè)造成的損失，但周期長和費(fèi)用昂貴使這方面的進(jìn)展相對滯后。因此，迫切需要生物農(nóng)藥的開發(fā)、生防制劑的研制、篩選。
苦瓜是一種天然蔬菜作物，不僅可以食用，目前在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及基礎(chǔ)生物學(xué)研究中也具有重要作用；而苦瓜葉片卻作為廢棄物，尚未開發(fā)利用。迄今為止還沒有采用苦瓜葉片為原料開發(fā)生物抗蟲劑的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題本發(fā)明利用廢棄物苦瓜葉片，提供了一種成本低、抗蟲性強(qiáng)、抗蟲譜廣、制作方法簡便、水溶性的新型抗蟲生物農(nóng)藥。它克服了化學(xué)農(nóng)藥毒性的危害，為開發(fā)新型生物殺蟲劑，實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。
技術(shù)方案苦瓜葉片抗蟲提取物，它是利用廢棄物-苦瓜(Momordica charantia L.)葉片為資源，加入提取溶劑、通過磨碎、采用靜置提取、振蕩、過濾和定容提取的含有蛋白質(zhì)的綠色液體；該抗蟲提取物的特性溶解性提取物具有水溶性，并能以任意比與水混合；抗蟲譜具有廣譜的抗蟲作用和殺蟲效果、特別是對咀嚼式口器的害蟲有效。
其中，提取溶劑為去離子水、乙醚(≥99％)或丙酮(≥95％)。當(dāng)提取溶劑采用去離子水時，提取物中含有分子量為22KD、23KD、24KD、25KD、28KD和35KD的蛋白質(zhì)；當(dāng)提取溶劑采用乙醚時，抗蟲提取物中含有分子量為26KD、27KD、29KD、38KD、40KD、65KD和66KD的蛋白質(zhì)；當(dāng)提取溶劑采用丙酮時，提取物中含有分子量為31KD、32KD和33KD的蛋白質(zhì)。該抗蟲提取物在0-40℃時具有很好的穩(wěn)定性。
苦瓜葉片抗蟲提取物的制備方法，它是利用廢棄物——苦瓜葉片為資源，加入提取溶劑、通過磨碎、采用靜置提取、振蕩、過濾和定容提取的，具體方法如下用新鮮苦瓜葉片或苦瓜葉片干粉，苦瓜葉片與提取溶劑之比為1g∶1ml，控制pH在6.5-7.0、溫度0-4℃的范圍內(nèi)磨碎，然后采用靜置提取0.5h，并以20r/min，振蕩8-10h后，進(jìn)行過濾，再用自然水定容至2倍的提取溶劑量，即制得苦瓜葉片抗蟲提取物原液。
需要說明的是提取溶劑選自去離子水、乙醚(≥99％)或丙酮(≥95％)。
苦瓜葉片抗蟲提取物的用途是在抗蟲和殺蟲方面的應(yīng)用。該抗蟲提取物可廣泛用于蔬菜害蟲的生物防治，特別適宜用于咀嚼式口器害蟲的生物防治。其使用法是將苦瓜葉片抗蟲提取物原液用水稀釋，使其濃度為30-50％，噴涂于作物上，當(dāng)濃度為45-50％時，噴涂于作物上抗蟲和殺蟲效果更好。
有益效果本發(fā)明采用廢棄物—苦瓜葉片為資源，開發(fā)了新型生物抗蟲劑。其抗蟲性強(qiáng)、抗蟲譜廣、在0-40℃具有很好的穩(wěn)定性。提取后所得的原液，可以直接使用，也可以將其制成濃縮液，還可以加工制成粉劑，便于保存和運(yùn)輸。該抗蟲劑制備方法簡便、快速、成本低。這種新型抗蟲生物制劑可以任意比溶于水，使用方便、抗蟲、殺蟲效果顯著。將苦瓜葉片乙醚抗蟲提取物原液配制成不同濃度(30％、40％、50％)，用它處理小菜蛾(Plutella xylostella L.)幼蟲后，使小菜蛾幼蟲發(fā)育不良，反應(yīng)遲鈍，出現(xiàn)卷曲，其卷曲程度隨處理濃度的增高而上升，其卷曲率分別為47.5％、49.1％、77.5％；死亡率(含卷曲率)分別為79％、79.6％、90-100％。將苦瓜葉片丙酮抗蟲提取物原液分別配制成種濃度(30％、40％、50％)，用它們處理小菜蛾幼蟲后，試蟲卷曲率分別為37.1％、40.0％、42.0％；死亡率(含卷曲率)分別為60.0％、74.0％、78.0％。將苦瓜葉片去離子水抗蟲提取物原液配制成不同濃度(30％、40％、50％)處理小菜蛾幼蟲后，試蟲卷曲率分別為30％、35％、53％；死亡率(含卷曲率)分別為30％、40％、70％。將苦瓜葉片乙醚抗蟲提取物原液配制成50％濃度，用它處理菜青蟲(Artogela(pieris)rapae Linnaeus)后，試蟲卷曲率為42.5％；死亡率(含卷曲率)為72.5％。將丙酮抗蟲提取物原液配制成50％濃度，用它處理菜青蟲后，試蟲卷曲率為35.5％；死亡率(含卷曲率)為70.5％。將苦瓜葉片去離子水抗蟲提取物原液配制成50％濃度，用它處理菜青蟲后，試蟲卷曲率為40％；死亡率(含卷曲率)為68％?？喙先~片乙醚抗蟲提取原液配制成50％濃度，用它處理菜青蟲后，其蛹期的卷曲率為20％；死亡率為40％。配制濃度為50％苦瓜葉片丙酮抗蟲提取液，用它處理菜青蟲后，蛹的卷曲率為20％；死亡率為40％。配制濃度為50％苦瓜葉片去離子水抗蟲提取物，處理菜青蟲后，蛹期卷曲率為20％；死亡率為80％。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該提取物具有抗蟲和殺蟲效果，當(dāng)濃度為45-50％時，噴涂于作物上抗蟲和殺蟲效果更好，可以廣泛用于蔬菜害蟲的治。該產(chǎn)品不僅克服了化學(xué)農(nóng)藥毒性的危害，而且所采用的資源為苦瓜廢棄物，其成本非常低、制備簡便，因而為生物防治害蟲開發(fā)新型殺蟲劑奠定了基礎(chǔ)。該提取物在生物防治害蟲、生產(chǎn)無污染農(nóng)作物蔬菜等方面具有廣闊的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景，在今后的開發(fā)應(yīng)用上占有很大的優(yōu)勢。本發(fā)明將對植物害蟲的生物防治以及生物農(nóng)藥的研制開發(fā)、實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值，既有經(jīng)濟(jì)效益又有社會效益。


圖1以乙醚為提取溶劑的苦瓜葉片抗蟲提取物含蛋白質(zhì)的雙向電泳圖；圖2以丙酮為提取溶劑的苦瓜葉片抗蟲提取物含蛋白質(zhì)的雙向電泳圖；圖3以去離子水為提取溶劑的苦瓜葉片抗蟲提取物含蛋白質(zhì)的雙向電泳圖；圖4提取溶劑為乙醚的苦瓜葉片抗蟲提取物處理菜青蟲的效果圖；圖5提取溶劑為丙酮的苦瓜葉片抗蟲提取物處理菜青蟲的效果圖；圖6提取溶劑為去離子水的苦瓜葉片抗蟲提取物處理菜青蟲的效果圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)及可實(shí)施性通過以下實(shí)施例具體體現(xiàn)，但不應(yīng)以此限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例1利用廢棄物——苦瓜葉片為資源，制備苦瓜葉片抗蟲提取物的方法，包括以下步驟·采用乙醚為提取溶劑，取新鮮的苦瓜葉片50g，50ml乙醚(≥99％)按1g∶1ml的比例，在pH 7、溫度0℃的條件下磨碎，采用靜置提取0.5h，用回旋振蕩器20r/min振蕩8-10h過濾，然后用自然水定容至100ml作為原液備用。
·性能檢測取上述制備的抗蟲提取物進(jìn)行檢測。以乙醚為提取溶劑的苦瓜葉片抗蟲提取物所含蛋白質(zhì)的雙向電泳圖如圖1所示?？喙先~片經(jīng)乙醚提取后，采用2D-SDS-PAGE蛋白質(zhì)檢測，在PI 5.0-7.0之間，檢測出分子量為26KD、27KD、29KD、38KD、40KD、65KD和66KD七個蛋白質(zhì)點(diǎn)譜，如圖1中箭頭所示。以上表明本實(shí)施例所獲得的提取物中含有分子量為26KD、27KD、29KD、38KD、40KD、65KD和66KD的蛋白質(zhì)。該提取物為深綠色水溶性液體，可以濃縮，可以稀釋，并能以任意比與水混合，在0-40℃儲存1年，其抗蟲作用仍舊穩(wěn)定。
應(yīng)用實(shí)驗(yàn)1-2將實(shí)施例1制備的苦瓜葉片乙醚抗蟲提取物原液用水稀釋，使其濃度為50％(配制方法取50ml苦瓜葉片乙醚抗蟲提取物原液，加入50ml水)，涂抹于白菜葉片正面，晾干后飼養(yǎng)試蟲。用小菜蛾(Plutella xylostella L.)二齡幼蟲作為共試蟲源，設(shè)三次重復(fù)。當(dāng)天試蟲取食量降低，第二天蟲體反應(yīng)遲鈍，第三天蟲體出現(xiàn)卷曲，第四天出現(xiàn)死亡，第五天卷曲率為77.5％，死亡率為100％。用同樣方法涂抹于甘藍(lán)葉片正面，晾干后飼養(yǎng)一齡菜青蟲，第二天試蟲取食量降低、反應(yīng)遲鈍，第三天出現(xiàn)卷曲，第四天出現(xiàn)死亡，第六天卷曲率為42.5％，死亡率為72.5％，到蛹期其卷曲率為20％、死亡率為40％。
應(yīng)用實(shí)驗(yàn)3將實(shí)施例1制備的苦瓜葉片乙醚抗蟲提取物原液用水稀釋，使其濃度為40％(配制方法取40ml苦瓜葉片乙醚抗蟲提取物原液，加入60ml水)，涂抹于白菜葉片正面，晾干后飼養(yǎng)試蟲。用小菜蛾二齡幼蟲作為共試蟲源，設(shè)三次重復(fù)。當(dāng)天試蟲取食量降低，第二天蟲體反應(yīng)遲鈍，第三天出現(xiàn)卷曲，第四天出現(xiàn)死亡，第五天卷曲率49.1％，死亡率79.6％。
應(yīng)用實(shí)驗(yàn)4將實(shí)施例1制備的苦瓜葉片乙醚抗蟲提取物原液用水稀釋，使其濃度為30％(配制方法取30ml苦瓜葉片乙醚抗蟲提取物原液，加入70ml水)，涂抹于白菜葉片正面，晾干后飼養(yǎng)試蟲。用小菜蛾二齡幼蟲作為共試蟲源，設(shè)三次重復(fù)。第二天試蟲取食量降低，第三天蟲體反應(yīng)遲鈍，第四天出現(xiàn)卷曲，第五天出現(xiàn)死亡，第六天卷曲率為47.5％，死亡率為79％。
實(shí)施例2采用丙酮(≥99％)為提取溶劑，振蕩10h，其它同實(shí)施例1?？喙先~片用丙酮提取后，采用2D-SDS-PAGE蛋白質(zhì)檢測，在PI 6.5-7.5之間，檢測出分子量為31KD、32KD、33KD三個蛋白質(zhì)點(diǎn)譜，如圖2中箭頭所示。以上表明本實(shí)施例所獲得的提取物中含有分子量為31KD、32KD、33KD的蛋白質(zhì)，該提取物為淺綠色水溶性液體。其它同實(shí)施例1。
應(yīng)用實(shí)驗(yàn)5-6將實(shí)施例2制備的苦瓜葉片丙酮抗蟲提取物原液用水稀釋，使其濃度為50％(即取50ml苦瓜葉片丙酮抗蟲提取物原液，加入50ml水)，涂抹于白菜葉片正面，晾干后飼養(yǎng)試蟲。用小菜蛾二齡幼蟲作為共試蟲源，設(shè)三次重復(fù)。當(dāng)天試蟲取食量降低，第二天蟲體反應(yīng)遲鈍，第三天蟲體出現(xiàn)卷曲，第四天出現(xiàn)死亡，第五天卷曲率為42.0％，死亡率為78.0％。用上述同樣方法涂抹于甘藍(lán)葉片正面，晾干后飼養(yǎng)一齡菜青蟲。第二天試蟲取食量降低、反應(yīng)遲鈍，第三天出現(xiàn)卷曲，第四天出現(xiàn)死亡，第六天卷曲率為35.5％、死亡率為70.5％。
應(yīng)用實(shí)驗(yàn)7將實(shí)施例2制備的苦瓜葉片丙酮抗蟲提取物原液用水稀釋，使其濃度為40％(即取40ml苦瓜葉片丙酮抗蟲提取物原液，加入60ml水)，涂抹于白菜葉片正面，晾干后飼養(yǎng)試蟲。用小菜蛾二齡幼蟲作為共試蟲源，設(shè)三次重復(fù)。當(dāng)天試蟲取食量降低，第二天蟲體反應(yīng)遲鈍，第三天出現(xiàn)卷曲，第四天出現(xiàn)死亡，第五天卷曲率40.0％，死亡率74.0％。
應(yīng)用實(shí)驗(yàn)8將實(shí)施例2制備的苦瓜葉片丙酮抗蟲提取物原液用水稀釋，使其濃度為30％(即取30ml苦瓜葉片丙酮抗蟲提取物原液，加入70ml水)，涂抹于白菜葉片正面，晾干后飼養(yǎng)試蟲。用小菜蛾二齡幼蟲作為共試蟲源，各設(shè)三次重復(fù)。第二天試蟲取食量降低，第三天蟲體反應(yīng)遲鈍，第四天出現(xiàn)卷曲，第五天出現(xiàn)死亡，第六天卷曲率為42.0％，死亡率為78％。
實(shí)施例3采用去離子水為提取溶劑，于pH 6.8、4℃下磨碎，其它同實(shí)施例1?？喙先~片用去離子水提取后，采用2D-SDS-PAGE蛋白質(zhì)檢測，在PI 6.5-7.5之間，檢測出分子量為22KD、23KD、24KD、25KD、28KD和35KD六個蛋白質(zhì)點(diǎn)譜，如圖3中箭頭所示。以上表明本實(shí)施例所獲得的提取物中含有分子量為22KD、23KD、24KD、25KD、28KD和35KD的蛋白質(zhì)。該提取物為淺綠色水溶性液體。
應(yīng)用實(shí)驗(yàn)9-10將實(shí)施例3制備的苦瓜葉片去離子水抗蟲提取物原液用水稀釋，使其濃度為50％(即取50ml苦瓜葉片去離子水抗蟲提取物原液，加入50ml水)，涂抹于白菜葉片正面，晾干后飼養(yǎng)試蟲。用小菜蛾二齡幼蟲作為共試蟲源，設(shè)三次重復(fù)。當(dāng)天試蟲取食量降低，第二天蟲體反應(yīng)遲鈍，第三天蟲體出現(xiàn)卷曲，第四天出現(xiàn)死亡，第五天卷曲率為53％，死亡率為70％。用上述同樣方法涂抹于甘藍(lán)葉片正面，晾干后飼養(yǎng)一齡菜青蟲，第二天取食量降低、反應(yīng)遲鈍，第三天出現(xiàn)卷曲，第四天出現(xiàn)死亡，第六天卷曲率為40％、死亡率為68％。
應(yīng)用實(shí)驗(yàn)11將實(shí)施例3制備的苦瓜葉片去離子水抗蟲提取物原液用水稀釋，使其濃度為40％(即取40ml苦瓜葉片去離子水抗蟲提取物原液，加入60ml水)，涂抹于白菜葉片正面，晾干后飼養(yǎng)試蟲。用小菜蛾二齡幼蟲作為共試蟲源，設(shè)三次重復(fù)。當(dāng)天試蟲取食量降低，第二天蟲體反應(yīng)遲鈍，第三天出現(xiàn)卷曲，第四天出現(xiàn)死亡，第五天卷曲率35％，死亡率40％。
應(yīng)用實(shí)驗(yàn)12將實(shí)施例3制備的苦瓜葉片去離子水抗蟲提取物原液用水稀釋，使其濃度為30％(即取30ml苦瓜葉片去離子水抗蟲提取物原液，加入70ml水)，涂抹于白菜葉片正面，晾干后飼養(yǎng)試蟲。用小菜蛾二齡幼蟲作為共試蟲源，設(shè)三次重復(fù)。第二天試蟲取食量降低，第三天蟲體反應(yīng)遲鈍，第四天出現(xiàn)卷曲，第五天出現(xiàn)死亡，第六天卷曲率為30％，死亡率為30％。
以上實(shí)驗(yàn)表明，三種溶劑制備的苦瓜抗蟲提取物，皆具有抗蟲、殺蟲效果；而且無論是用乙醚、丙酮還是去離子水作為提取溶劑，在所采用的30％、40％、50％三種濃度中，皆以50％濃度時抗蟲效果好?？傊?，苦瓜葉片提取物對害蟲具有較強(qiáng)的抗性作用，是較好的農(nóng)用新型生物抗蟲劑。
權(quán)利要求
1.苦瓜葉片抗蟲提取物，其特征在于它是利用廢棄物——苦瓜(Momordicacharantia L.)葉片為資源，加入提取溶劑、通過磨碎、采用靜置提取、振蕩、過濾和定容提取的含有蛋白質(zhì)的綠色液體；該抗蟲提取物的特性溶解性提取物具有水溶性，并能以任意比與水混合；抗蟲譜具有廣譜的抗蟲作用和殺蟲效果、特別是對咀嚼式口器的害蟲有效。
2.按照權(quán)利要求1所述苦瓜葉片抗蟲提取物，其特征在于提取溶劑為去離子水、乙醚(≥99％)或丙酮(≥95％)；當(dāng)提取溶劑采用去離子水時，提取物中含有分子量為22KD、23KD、24KD、25KD、28KD和35KD的蛋白質(zhì)；當(dāng)提取溶劑采用乙醚時，抗蟲提取物中含有分子量為26KD、27KD、29KD、38KD、40KD、65KD和66KD的蛋白質(zhì)；當(dāng)提取溶劑采用丙酮時，提取物中含有分子量為31KD、32KD和33KD的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1所述的苦瓜葉片抗蟲提取物的制備方法，其特征在于它是利用廢棄物——苦瓜(Momordica charantia L.)葉片為資源，加入提取溶劑、通過磨碎、采用靜置提取、振蕩、過濾和定容提取的，具體方法如下用新鮮苦瓜葉片或苦瓜葉片干粉，苦瓜葉片與提取溶劑之比為1g∶1ml，控制pH在6.5-7.0、溫度0-4℃的范圍內(nèi)磨碎，采用靜置提取0.5h，并以20r/min振蕩8-10h后，進(jìn)行過濾，再用自然水定容至2倍的提取溶劑量，即制得苦瓜葉片抗蟲提取物原液。
4.按照權(quán)利要求3所述苦瓜葉片抗蟲提取物的制備方法，其特征在于提取溶劑選自去離子水、乙醚(≥99％)或丙酮(≥95％)。
5.權(quán)利要求1所述的苦瓜葉片抗蟲提取物在抗蟲和殺蟲方面的應(yīng)用，其特征在于該抗蟲提取物用于蔬菜害蟲的生物防治，其使用法是將苦瓜葉片抗蟲提取物原液用水稀釋，使其濃度為30％-50％，噴涂于作物上。
6.按照權(quán)利要求5所述苦瓜葉片抗蟲提取物在抗蟲和殺蟲方面的應(yīng)用，其特征在于用于咀嚼式口器害蟲的生物防治。
7.按照權(quán)利要求5所述苦瓜葉片抗蟲提取物在抗蟲和殺蟲方面的應(yīng)用，其特征在于將苦瓜葉片抗蟲提取物原液用水稀釋，使其濃度為45％-50％，噴涂于作物上。
全文摘要
苦瓜葉片抗蟲提取物及其制備與應(yīng)用，屬于農(nóng)用新型無公害抗蟲劑，涉及苦瓜廢棄物葉片抗蟲提取物及制備、應(yīng)用技術(shù)。本發(fā)明目的是利用苦瓜廢棄物提供一種成本低、抗蟲性強(qiáng)、制作簡便、水溶性的新型抗蟲、殺蟲生物農(nóng)藥。其技術(shù)方案是利用苦瓜葉片，以去離子水、乙醚或丙酮為提取溶劑、通過磨碎、采用靜置、振蕩、過濾、定容提取的含蛋白質(zhì)的綠色液體。其中苦瓜葉片與溶劑比為1g∶1ml，于0－4℃、pH 6.5－7.0磨碎，經(jīng)靜置、振蕩(20r/min)、過濾后，再用水定容至溶劑的2倍即得。該產(chǎn)品具有較強(qiáng)的抗蟲和殺蟲效果，可用于蔬菜害蟲、特別是對咀嚼式口器害蟲的生物防治。本發(fā)明將對生物農(nóng)藥的產(chǎn)業(yè)化具有重要的理論和應(yīng)用價值。
文檔編號A01P7/00GK1709065SQ20051001430
公開日2005年12月21日 申請日期2005年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月1日
發(fā)明者陳宏 , 李鵬飛, 徐秋曼, 王修魯, 王振英 申請人:天津師范大學(xué)