專利名稱：應(yīng)用基因沉默技術(shù)提高大豆和花生種子的油酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物育種領(lǐng)域，特別是大豆和花生品質(zhì)改良的生物工程育種領(lǐng)域。應(yīng)用雙鏈RNA基因沉默技術(shù)對(duì)大豆和花生的種子Δ12脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1進(jìn)行改建，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)大豆和花生種子的脂肪酸含量進(jìn)行特異性遺傳改良，進(jìn)而選育油酸含量高的大豆和花生材料。
背景技術(shù)：
雙鏈RNA基因沉默是指在生物體內(nèi)有雙鏈RNA參與指導(dǎo)的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標(biāo)的，致使特定基因不能表達(dá)的遺傳現(xiàn)象。雙鏈RNA基因沉默技術(shù)是目前控制基因表達(dá)最有效和先進(jìn)的技術(shù)，廣泛的應(yīng)用在植物基因工程的研究領(lǐng)域。Δ12脂肪酸脫氫酶是脂肪酸代謝中催化油酸形成亞油酸的關(guān)鍵酶，利用RNA反向重復(fù)序列引發(fā)的基因沉默原理對(duì)大豆和花生種子Δ12脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1進(jìn)行基因改造，導(dǎo)致該基因沉默，使Δ12脂肪酸脫氫酶形成受阻和催化活性降低，從而減少亞油酸的合成，積累大量的油酸。一般的大豆種子油脂中油酸含量約為20％，花生為40-50％。油酸是一種單不飽和脂肪酸(18∶1)，穩(wěn)定性高，能夠降低人體中總膽固醇和血脂，降低有害的低密度脂蛋白膽固醇(LDC)，但保持有益高密度脂蛋白膽固醇(HDL)的水平。由于油酸穩(wěn)定而益于健康的特點(diǎn)，提高大豆和花生種子油酸的含量以改善其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和氧化穩(wěn)定性，已成為目前大豆和花生品質(zhì)改良的重要內(nèi)容。
雙鏈RNA基因沉默是指在生物體內(nèi)有雙鏈RNA參與指導(dǎo)的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標(biāo)的，致使特定基因不能表達(dá)或降低表達(dá)的遺傳現(xiàn)象。自從雙鏈RNA在基因沉默中的重要性被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，世界上許多實(shí)驗(yàn)室將雙鏈RNA基因技術(shù)用于植物基因功能研究和植物品質(zhì)改良研究。這個(gè)技術(shù)是目前最有效的RNA水平上的基因表達(dá)抑制手段，其基因抑制效果遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的反義antisense基因沉默技術(shù)。本發(fā)明所采用的發(fā)卡式雙鏈RNA(帶有部分內(nèi)含子，hpRNA-intron)基因沉默結(jié)構(gòu)是目前所研究的基因沉默類型中效率最高的，可達(dá)100％，而正義sense和反義antisense抑制的沉默效率為10％和15％，不帶有內(nèi)含子的發(fā)卡式雙連RNA結(jié)構(gòu)(hpRNA-loop)的沉默效率為69％，這些結(jié)果已經(jīng)被很多實(shí)驗(yàn)所證實(shí)(Smith et al.2001 Nature 407319)。
高油酸大豆美國(guó)的DUPOND公司的高油酸大豆品種(G94-1，G94-19，and G168)，1996年申請(qǐng)專利，1997年獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)可以通過(guò)商品化進(jìn)入市場(chǎng)。他們所獲得的高油酸大豆材料的目的基因和來(lái)源為編碼Δ-12油酸脫氫酶的gmFad2-1基因的正義抑制(sense)。與我們所采用雙鏈RNA基因沉默的設(shè)計(jì)和構(gòu)建來(lái)抑制大豆油酸脫氫酶(Δ-12油酸脫氫酶)gmFAD2-1的活性，進(jìn)而合成和積累大量油酸的工作原理完全不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于應(yīng)用雙鏈RNA引發(fā)的基因沉默技術(shù)，設(shè)計(jì)和構(gòu)建大豆和花生種子Δ12脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1的特殊轉(zhuǎn)化載體，通過(guò)基因工程手段，導(dǎo)致該基因的沉默，促進(jìn)種子中油酸的積累，獲得高油酸的大豆和花生材料。通過(guò)對(duì)大豆和花生種子Δ12脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1的克隆與改建，構(gòu)建FAD2-1的反向重復(fù)序列結(jié)構(gòu)，并應(yīng)用FAD2-1種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子和終止子，其特殊的基因載體構(gòu)建會(huì)導(dǎo)致FAD2-1基因沉默，進(jìn)而達(dá)到合成大量油酸的目的。即本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用雙鏈RNA基因沉默技術(shù)提高大豆和花生種子油酸含量的方法。
1.應(yīng)用PCR方法，從大豆和花生基因組中克隆種子特異的Δ12脂肪酸脫氫酶基因片段，并根據(jù)雙鏈RNA基因沉默原理將該基因片段構(gòu)建成反向重復(fù)序列結(jié)構(gòu)；2.將大豆和花生種子特異的Δ12脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1的反向重復(fù)序列基因片段構(gòu)建到含有種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子和終止子的載體中；3.通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，組織培養(yǎng)和篩選工作，在其轉(zhuǎn)基因后代中篩選高油酸含量的株系；采用PCR和Southern blot方法檢測(cè)目的基因，用氣相色譜(GC)檢測(cè)油酸含量，通過(guò)系統(tǒng)選育，確立高油酸含量穩(wěn)定的大豆和花生材料。
本發(fā)明可以縮短周期，提高效率，大幅度提高油酸含量，這將促進(jìn)我國(guó)的大豆和花生品質(zhì)改良育種的研究和發(fā)展。大豆和花生種子Δ12脂肪酸脫氫酶基因反向重復(fù)序列結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建，可以提高目的基因的表達(dá)效率，通過(guò)建立的大豆和花生的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)選育高油酸優(yōu)異材料，為進(jìn)一步選育高油酸大豆和花生品種提供基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
以應(yīng)用基因沉默技術(shù)提高花生種子油酸的含量為例1.所用材料花生材料花生品種為豐花1號(hào)、禾花1號(hào)和8130。
菌株和質(zhì)粒大腸桿菌E.coli-DH5α、農(nóng)桿菌LBA4404；克隆載體pGEM-Teasy，pBI121和pGLe-10。
酶和化學(xué)試劑植物基因組提取試劑盒；質(zhì)粒提取試劑盒，DNA限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，T4DNA聚合酶，CIAP小牛腸堿性磷酸化酶，pfu聚合酶和DNA ladder；抗生素(卡那霉素等)及其他生化試劑。
2.技術(shù)方法FAD2-1基因片斷的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建從花生材料中制備總DNA，以此為模板進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。參照GeneBank中的花生FAD2-1基因(AF272950)設(shè)計(jì)兩組PCR引物，引物由上海生工公司合成。
第1組引物序列為Primer1GAGCTGGAGGGCGTGTCACTAAGAT；Primer2CAAGTACAAGGGCCATCCTAGTGTG第2組引物序列為Primer1AGGGCGTGTCACTAAGATTGAAGCT；Primer2AATGGGTATGGAAGCTTGTGGAAATPCR反應(yīng)體系包括10μl PCR buffer，10μl dNTP(each 2.5nmol/L)，2μl Tag酶，2μl引物(each 20nmol/μl)，2μl模板DNA，加滅菌雙蒸水至100μl?；驍U(kuò)增儀為PerinElmer9600型，PCR時(shí)間程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min，94℃1min，59℃1min，72℃90s，共35個(gè)循環(huán)。
將這兩組PCR產(chǎn)物(片段1和片段2)分別連入pGEM-Teasy載體，然后進(jìn)行DNA序列分析。測(cè)序結(jié)果與Genebank中序列進(jìn)行同源性比較。
將片段2用EcoRI從pGEM-Teasy切下，用T4DNA聚合酶補(bǔ)平后反向連接到片段1所在的pGEM-Teasy的SacII位點(diǎn)上(平端連接法)，形成了FAD2-1基因片段的反向重復(fù)序列(片段2的序列與片段1的起始序列完全相同)。
利用種子特異表達(dá)的大豆凝集素基因啟動(dòng)子和終止子進(jìn)行植物表達(dá)載體的構(gòu)建。用載體pBI121和pGle-10重組產(chǎn)生的pLecSma(內(nèi)含Smal酶切位點(diǎn))作為卡那霉素抗性且?guī)в写蠖狗N子特異表達(dá)的凝集素啟動(dòng)子和終止子的雙元載體。將構(gòu)建好的FAD2-1反向重復(fù)序列用Nco1和Pst1從pGEM-Teasy釋放出來(lái)，pfu聚合酶平端化，與用Smal線性化后并CIAP去磷酸化的載體pLecSma相連接，構(gòu)建出表達(dá)載體pPNHO-1(見(jiàn)圖1)。
大豆FAD2-1基因片段的克隆和載體的構(gòu)建方法與花生相同，構(gòu)建的表達(dá)載體為pSBHO-1(見(jiàn)圖2)。
花生的轉(zhuǎn)化和植株再生花生轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)參照Kiran Sharma&Vanamala Anjaiah(Plant Science 159(2000)7-19)方法進(jìn)行。即通過(guò)三親雜交方法將雙元載體pPNHO-1導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，用該農(nóng)桿菌感染花生子葉外植體，光照下共培養(yǎng)三天，然后轉(zhuǎn)至含有250mg/L頭孢霉素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(20uMBA+10uM2，4-D+MS)上誘導(dǎo)叢生芽，兩周后將叢生芽轉(zhuǎn)至含有125mg/L卡那霉素和250mg/L頭孢霉素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(20uMBA+10uM2，4-D+MS)上進(jìn)行篩選，兩周后再轉(zhuǎn)至含有125mg/L卡那霉素和250mg/L頭孢霉素的莖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(2uMBA+MS)上，此過(guò)程約12周，待芽長(zhǎng)至3-4厘米高時(shí)，轉(zhuǎn)入無(wú)任何抗生素的生根培養(yǎng)基(5uMNAA+MS)，經(jīng)過(guò)4周的培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化植株生根并長(zhǎng)成完整小植株，經(jīng)過(guò)煉苗，移栽至土壤長(zhǎng)大并開(kāi)花結(jié)實(shí)。
轉(zhuǎn)基因花生的鑒定和油酸含量的測(cè)定PCR檢測(cè)提取再生植株總DNA，以此為模板，用以NPTII和大豆凝聚素基因5’和3’端部分序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。
NPTII基因部分序列引物Primer15-TGAGAATATCACCGGAATTG-3；Primer25-GGAAGAACAGTATGTCGAGCTA-3；大豆凝聚素啟動(dòng)子基因部分序列引物Primer15-CATGTGACAGATCGAAGGAA-3；Primer25-ATCTAATTATTCTATTCAGAC-3。
Southern雜交再生植株總DNA(10ug)經(jīng)HindIII完全酶解后進(jìn)行Southern雜交。DNA探針為大豆凝聚素啟動(dòng)子基因的全部序列，按TaKaRa公司隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記。
T1和T2代種子油酸含量測(cè)定壓榨法提取種子總油脂，甲酯化后用氣相色譜法檢測(cè)油酸含量。由東北師范大學(xué)測(cè)試中心和澳大利亞CSIRO植物研究所檢測(cè)。
3.結(jié)果利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將ahFAD2-1基因的反向重復(fù)序列導(dǎo)入花生基因組，已在三個(gè)品種豐花1號(hào)、禾花1號(hào)和8130上獲得成功，得到了100多株轉(zhuǎn)化花生苗，具有良好的重復(fù)性，建立了高效的花生轉(zhuǎn)化體系。
轉(zhuǎn)基因花生的PCR檢測(cè)采用標(biāo)記基因NPTII，目的基因啟動(dòng)子(大豆凝聚素啟動(dòng)子)基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在88株檢測(cè)植株中有65株為PCR陽(yáng)性，擴(kuò)增出了與標(biāo)記基因和啟動(dòng)子基因序列片段相同分子量的條帶，而對(duì)照植株未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。
轉(zhuǎn)基因花生的Southern雜交分析用目的基因啟動(dòng)子一大豆凝聚素啟動(dòng)子基因序列作為探針與轉(zhuǎn)基因再生植株的DNA雜交，在PCR陽(yáng)性植株當(dāng)中，大部分植株的轉(zhuǎn)基因真實(shí)性用Southern雜交分析所證實(shí)，含有一至多條雜交帶。
T1代種子油酸含量測(cè)定壓榨法提取種子總油脂，甲酯化后用氣相色譜、Megabore層析柱檢測(cè)油酸含量。2004年和2005年經(jīng)東北師范大學(xué)分析測(cè)試中心和澳大利亞CSIRO植物研究所測(cè)定，轉(zhuǎn)基因花生T1代單株種子在總油脂含量不變的條件下，對(duì)照植株油酸含量平均為40％，轉(zhuǎn)基因花生東花4061(暫定名)平均為77％，其油酸含量平均比對(duì)照提高了37個(gè)百分點(diǎn)。


附圖1為用于轉(zhuǎn)化花生的載體模式圖附圖2為用于轉(zhuǎn)化大豆的載體模式圖附圖3為基因沉默類型效率示意圖
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用基因沉默技術(shù)提高大豆和花生種子的油酸含量的方法，其特征是(1).應(yīng)用PCR方法，從大豆和花生基因組中克隆種子特異的Δ12脂肪酸脫氫酶基因片段，并根據(jù)雙鏈RNA基因沉默原理將該基因片段構(gòu)建成反向重復(fù)序列結(jié)構(gòu)；(2).將大豆和花生種子特異的Δ12脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1的反向重復(fù)序列基因片段構(gòu)建到含有種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子和終止子的載體中；(3).通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，組織培養(yǎng)和篩選工作，在其轉(zhuǎn)基因后代中篩選高油酸含量的株系；(4).采用PCR和Southern blot方法檢測(cè)目的基因，檢測(cè)油酸含量，通過(guò)系統(tǒng)選育，確立高油酸含量穩(wěn)定的大豆和花生材料。
2.按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用基因沉默技術(shù)提高大豆和花生種子的油酸含量的方法，其特征是FAD2-1基因片斷的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建從花生材料中制備總DNA，以此為模板進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，參照GeneBank中的花生FAD2-1基因(AF272950)設(shè)計(jì)兩組PCR引物第1組引物序列為Primer1GAGCTGGAGGGCGTGTCACTAAGAT；Primer2CAAGTACAAGGGCCATCCTAGTGTG第2組引物序列為Primer1AGGGCGTGTCACTAAGATTGAAGCT；Primer2AATGGGTATGGAAGCTTGTGGAAATPCR反應(yīng)體系包括10μl PCR buffer，10μl dNTP(each 2.5nmol/L)，2μl Tag酶，2μl引物(each 20nmol/μl)，2μl模板DNA，加滅菌雙蒸水至100μl?；驍U(kuò)增儀為PerinElmer9600型，PCR時(shí)間程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min，94℃1min，59℃1min，72℃90s，共35個(gè)循環(huán)；將這兩組PCR產(chǎn)物片段1和片段2，分別連入pGEM-Teasy載體，然后進(jìn)行DNA序列分析，測(cè)序結(jié)果與Genebank中序列進(jìn)行同源性比較；將片段2用EcoRI從pGEM-Teasy切下，用T4DNA聚合酶補(bǔ)平后反向連接到片段1所在的pGEM-Teasy的SacII位點(diǎn)上，形成了FAD2-1基因片段的反向重復(fù)序列；利用種子特異表達(dá)的大豆凝集素基因啟動(dòng)子和終止子進(jìn)行植物表達(dá)載體的構(gòu)建用載體pBI121和pGle-10重組產(chǎn)生的pLecSma作為卡那霉素抗性且?guī)в写蠖狗N子特異表達(dá)的凝集素啟動(dòng)子和終止子的雙元載體，將構(gòu)建好的FAD2-1反向重復(fù)序列用Nco1和Pst1從pGEM-Teasy釋放出來(lái)，pfu聚合酶平端化，與用Sma1線性化后并CIAP去磷酸化的載體pLecSma相連接，構(gòu)建出表達(dá)載體pPNHO-1；大豆FAD2-1基因片段的克隆和載體的構(gòu)建方法與花生相同，構(gòu)建的表達(dá)載體為pSBHO-1；花生的轉(zhuǎn)化和植株再生通過(guò)三親雜交方法將雙元載體pPNHO-1導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌，用該農(nóng)桿菌感染花生子葉外植體，光照下共培養(yǎng)約三天，然后轉(zhuǎn)至含有250mg/L頭孢霉素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽，兩周后將叢生芽轉(zhuǎn)至含有125mg/L卡那霉素和250mg/L頭孢霉素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，兩周后再轉(zhuǎn)至含有125mg/L卡那霉素和250mg/L頭孢霉素的莖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上，此過(guò)程約12周，待芽長(zhǎng)至3-4厘米高時(shí)，轉(zhuǎn)入無(wú)任何抗生素的生根培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)約4周的培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化植株生根并長(zhǎng)成完整小植株，經(jīng)過(guò)煉苗然后移栽至土壤。
3.按照權(quán)利要求2的應(yīng)用基因沉默技術(shù)提高大豆和花生種子的油酸含量的方法，其特征是所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為20uMBA+10uM2，4-D+MS，莖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為2uMBA+MS，生根培養(yǎng)基為5uMNAA+MS。
4 按照權(quán)利要求2的應(yīng)用基因沉默技術(shù)提高大豆和花生種子的油酸含量的方法，其特征是所述的花生品種為豐花1號(hào)、禾花1號(hào)和8130。
5 按照權(quán)利要求2的應(yīng)用基因沉默技術(shù)提高大豆和花生種子的油酸含量的方法，其特征是所述的根癌農(nóng)桿菌菌種為L(zhǎng)BA4404。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物育種領(lǐng)域，特別是大豆和花生品質(zhì)改良的生物工程育種領(lǐng)域。本發(fā)明應(yīng)用PCR方法，從大豆和花生基因組中克隆種子特異的基因片段，并根據(jù)基因沉默原理將該基因片段構(gòu)建成反向重復(fù)序列結(jié)構(gòu)；將大豆和花生種子特異基因的反向重復(fù)序列基因片段構(gòu)建到含有種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子和終止子的載體中；通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，組織培養(yǎng)和篩選；采用PCR和Southern blot方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)，檢測(cè)油酸含量，通過(guò)系統(tǒng)選育，從而確立高油酸含量穩(wěn)定的大豆和花生材料，改良大豆和花生品質(zhì)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1724669SQ20051001663
公開(kāi)日2006年1月25日 申請(qǐng)日期2005年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月17日
發(fā)明者許守民, 柳青, 劉立俠, 李桂民, 宋凱, 蔡一榮, 馮凱, 李望豐 申請(qǐng)人:東北師范大學(xué)