專利名稱：有助于農(nóng)作物生長的假單孢菌RRj228及含有該菌株的微生物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由1號序列所代表的假單孢菌RRj228(Pseudomonas sp.RRj228)(該菌株于2003年6月11日被保藏在韓國農(nóng)業(yè)培養(yǎng)物保藏中心(KACC)，保藏編號為KACC 91052；于2005年5月27日被重新保藏于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏編號為KCTC 10812BP)，在農(nóng)作物的種植過程中，該菌株通過定殖于植物根系內(nèi)外而代替化肥來促進(jìn)植物生長。本發(fā)明還涉及含有假單孢菌RRj228或由其產(chǎn)生的次級代謝物的環(huán)境親和性微生物制劑。
根據(jù)本發(fā)明的環(huán)境親和性微生物制劑通過含有假單孢菌RRj228或由其產(chǎn)生的次級代謝物而能夠減少化肥的使用量、穩(wěn)定農(nóng)作物產(chǎn)量、保護(hù)水質(zhì)和土壤環(huán)境并改善土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康。
背景技術(shù)：
肥料是決定農(nóng)作物產(chǎn)量的一種重要的農(nóng)業(yè)物資，但它作為農(nóng)作物生長的劣質(zhì)因子會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物品質(zhì)退化、河流富營養(yǎng)化、地下水污染、土壤營養(yǎng)失衡以及產(chǎn)量降低。因此，為促進(jìn)農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展和農(nóng)業(yè)環(huán)境的保護(hù)，必須合理使用具有促進(jìn)植物生長的功能并有助于農(nóng)作物強(qiáng)勢生長的土壤微生物，來替代化肥。
不與寄主植物形成共生關(guān)系并能促進(jìn)植物生長的植物根際促生細(xì)菌(Plant growth-promoting rhizobacteria)(PGPR)在1980年由Kloepper等人命名，它包括固氮螺菌屬(Azospirrilum sp.)(Okon，1985)、假單孢菌屬(Kloepper等，1980)、芽孢桿菌屬(Backman等，1994)等。被稱為PGPR的植物生長促進(jìn)微生物具有多種功能如固定大氣中的氮、產(chǎn)生植物生長促進(jìn)激素、促進(jìn)養(yǎng)分吸收(Hallmann等，1997)以及避免植物受病害侵襲(Pleban等，1995)，因此幫助植物生長。
Ward等人在1992年報(bào)道指出已經(jīng)分類并鑒定的該微生物種類占生活在土壤中全部種類的不到5％，而Torisvik等人在1990年報(bào)道指出在土壤中存在許多未被人工培養(yǎng)的微生物。因此，在土壤中還存在比以前發(fā)現(xiàn)的數(shù)量更多的具有優(yōu)秀功能的微生物，這由此引起對它們的后續(xù)研究。
另外，已經(jīng)證實(shí)接種不同的植物生長促進(jìn)微生物可以使水稻產(chǎn)量提高19-60％(Baldani，2000)，并可提高西紅柿(Kloepper和Schroth，1981)、豆類(Polonenko等，1987；以及Dashti等，1998)、小麥(Freitas和Germida，1990)和甜菜(Suslow和Schrith，1982)的產(chǎn)量。植物生長促進(jìn)微生物的應(yīng)用已經(jīng)有所研究。
因此，本發(fā)明的發(fā)明者在研究土壤微生物的同時(shí)分離并鑒定了可定殖于水稻植物根系內(nèi)外的假單孢菌RRj228，并發(fā)現(xiàn)該菌株可促進(jìn)農(nóng)作物生長，因此可替代化肥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供由1號序列所代表的假單孢菌RRj228，在農(nóng)作物的種植過程中，該菌株通過定殖于植物根系內(nèi)外而代替化肥來促進(jìn)植物生長。本發(fā)明的目的還在于提供含有假單孢菌RRj228或由其產(chǎn)生的次級代謝物的環(huán)境親和性微生物制劑。
本發(fā)明提供了由1號序列所代表的假單孢菌RRj228，在農(nóng)作物的種植過程中，該菌株通過定殖于植物根系內(nèi)外而代替化肥來促進(jìn)植物生長。
假單孢菌RRj228是由本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的一種土壤細(xì)菌，在自然條件下，該細(xì)菌定殖于植物根系內(nèi)外，分泌植物生長促進(jìn)物質(zhì)，并通過對植物病原真菌和細(xì)菌的拮抗作用來抑制多種病原體的生長。
本發(fā)明的假單孢菌RRj228為在28±2℃的PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的革蘭氏陰性桿狀嗜溫細(xì)菌。
使用本發(fā)明的假單孢菌RRj228獲得的效果如下1)當(dāng)使用含有該菌株的微生物制劑作為農(nóng)作物接種物時(shí)，由于本發(fā)明的假單孢菌RRj228可提供優(yōu)秀養(yǎng)分供給并促進(jìn)植物生長，因此盡管使用少量的化肥，也能提高農(nóng)作物產(chǎn)量。
2)本發(fā)明的假單孢菌RRj228是化肥的替代品，對農(nóng)作物有廣泛的使用范圍，如可用于水稻、辣椒和黃瓜。
3)當(dāng)本發(fā)明的假單孢菌RRj228接種到農(nóng)作物中時(shí)，該菌株可以通過抑制土壤中的植物病原微生物來幫助農(nóng)作物生長并免受病原體的危害。
4)本發(fā)明的假單孢菌RRj228通過定殖于農(nóng)作物根系內(nèi)部可在被接種的農(nóng)作物中大量表達(dá)。
5)根據(jù)本發(fā)明，除了可替代化肥的功效之外，通過將來自假單孢菌RRj228培養(yǎng)液的植物生長促進(jìn)或病原生長抑制物質(zhì)分離并純化而獲得的次級代謝物也可產(chǎn)生更多的價(jià)值。
6)由于本發(fā)明的假單孢菌RRj228不可能污染環(huán)境，所以可以保護(hù)水質(zhì)和土壤環(huán)境，并改善土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康。
本發(fā)明還提供了含有假單孢菌RRj228或其產(chǎn)生的次級代謝物的環(huán)境親和性微生物制劑。
可以使用本領(lǐng)域熟知的方法將本發(fā)明的微生物制劑配制成植物生長促進(jìn)劑或植物病原生長抑制劑，但本發(fā)明并不局限于此。為替代化肥，本發(fā)明的微生物制劑優(yōu)選配制成用于促進(jìn)植物生長的有機(jī)肥料。
當(dāng)本發(fā)明的微生物制劑為干粉狀或液態(tài)肥料狀的植物生長促進(jìn)劑時(shí)，每1克干粉或1毫升液體中的假單孢菌RRj228含量為105-107。
當(dāng)本發(fā)明的微生物制劑為干粉狀或液態(tài)肥料狀的病原生長抑制劑時(shí)，每1克干粉或1毫升液體中的假單孢菌RRj228含量應(yīng)超過107。在這種情況下，其特征是該菌株含量比植物生長促進(jìn)劑中的菌株含量高。
根據(jù)本發(fā)明的環(huán)境親和性微生物制劑通過含有假單孢菌RRj228而能夠減少化肥的用量、穩(wěn)定農(nóng)作物產(chǎn)量、保護(hù)水質(zhì)和土壤環(huán)境并改善土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康。
假單孢菌RRj228可生產(chǎn)成為合適的微生物制劑，該制劑可接種到農(nóng)作物如水稻、辣椒和黃瓜中。
生物保藏本發(fā)明的RRj228菌株被命名為假單孢菌RRj228，并于2003年6月11日被保藏在附屬于韓國農(nóng)村振興廳/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家研究所的韓國農(nóng)業(yè)培養(yǎng)物保藏中心(KACC)，保藏編號為KACC 91052。
2005年5月27日，RRj228被重新保藏到韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏編號為KCTC10812BP。


圖1表示假單孢菌RRj228培養(yǎng)物的平板；圖2a和2b是假單孢菌RRj228的電鏡照片；圖3是定殖于植物根內(nèi)部的假單孢菌RRj228的照片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明可通過下列與假單孢菌RRj228的分離、鑒定和植物生長促進(jìn)活性相關(guān)的實(shí)施例體現(xiàn)出來，假單孢菌RRj228是從俄羅斯圣彼得堡(St.Petersburg)的土壤中分離出來的，它也是從韓國和俄羅斯土壤中分離出的172種菌株之一。然而，提供這些實(shí)施例只是用來解釋說明，并不能被認(rèn)為是對本發(fā)明范圍的限制，所附的權(quán)利要求對本發(fā)明的范圍做了恰當(dāng)?shù)拿枋觥?br> 實(shí)施例1土壤微生物RRj228的分離土壤微生物RRj228的分離方法如下。
如圖1所示，把在無菌培養(yǎng)基中萌發(fā)的一粒水稻種子轉(zhuǎn)移到0.6％瓊脂糖培養(yǎng)基中。將0.5克土壤樣品(來自俄羅斯圣彼得堡)接種在距水稻根部1-2厘米處，然后將培養(yǎng)基在28℃培養(yǎng)48小時(shí)。將根碾碎使之形成懸浮液后，將該懸浮液涂在LC培養(yǎng)基上(該培養(yǎng)基含有細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、MgSO4·7H2O 8克、1M Tris 1毫升和蒸餾水1升)，以分離菌株。
實(shí)施例2土壤微生物RRj228的鑒定A.生理生化特性RRj228菌株的生理生化特性顯示在下表1中。
所述RRj228菌株呈桿狀，大小為2.0-3.0×0.5-0.7微米，如圖2a和2b所示它具有鞭毛。當(dāng)該菌株在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，會(huì)形成黃色略帶紅色的菌落。所述RRj228菌株是革蘭氏陰性菌，進(jìn)行需氧代謝并具有過氧化氫酶和氧化酶活性。當(dāng)加入培養(yǎng)基的碳源為阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露醇、蔗糖、甘油或木糖時(shí)，該菌株會(huì)產(chǎn)生酸，而當(dāng)加入培養(yǎng)基的碳源為乳糖、糊精、ramnose、山梨糖醇、麥芽糖或半乳糖醇時(shí)，該菌株會(huì)產(chǎn)生堿。另外，如圖3所示，本發(fā)明的RRj228菌株的特征是存在于植物根系外部并定殖于根系內(nèi)部。


B.序列分析為了分析RRj228DNA序列，采用16S rDNA序列分析方法。首先，用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增16S rDNA部分，將產(chǎn)物插入pGEMT-T載體中，然后用DNA自動(dòng)測序儀ABI3100(Applied Biosystem，美國)進(jìn)行DNA序列分析。PCR反應(yīng)使用2號序列的fD1(5′-agagtttgatggctcag-3′)和4號序列的rP2(5′-acggctaccttgttacgactt-3′)。另外，使用pUC/M13的正向引物(5′-gttttcccagtcacgac-3′4號序列)和反向引物(5′-gcggataacaatttcacacagg-3′5號序列)進(jìn)行反應(yīng)來分析上述引物的兩端區(qū)域，并使用4個(gè)引物進(jìn)行反應(yīng)來分析內(nèi)部的DNA序列。
根據(jù)大腸桿菌(Escherichia coli)16S rDNA序列(GenBank J01695號)，每個(gè)DNA序列使用16SP-1的311-330區(qū)域(5′-gccacactggaactgagacac-3′)，16SP-2的684-703區(qū)域(5′-tgtagcg gtgaaatgcgtg-3′)，16SP-3的944-963區(qū)域(5′-ggagcatgtgt tattcg-3′)以及16SP-4的1228-1247區(qū)域(5′-ctacacacgtgctacaatgg-3′)。
1號序列代表RRj228菌株的16S rDNA序列。對該菌株和GenBank數(shù)據(jù)庫中DNA序列之間的同源性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該菌株與許多假單孢菌屬成員如綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、皺褶假單胞菌(P.Corrugata)和P.tolaasii的同源性達(dá)99％，由此將該菌株歸類為假單孢菌屬。
因此，本發(fā)明的RRj228菌株被命名為假單孢菌RRj228。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1假單孢菌RRj228的植物生長促進(jìn)效果為了檢測假單孢菌RRj228的植物生長促進(jìn)效果，對玉米幼苗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將玉米根部末端3毫米浸入該菌株培養(yǎng)物懸浮液中1.5小時(shí)，其它玉米根部浸入無菌培養(yǎng)液中作為對照。將玉米幼苗放置在塑料箱中的濕濾紙上，然后用濾紙將起始線處的根部末端蓋好，28℃培養(yǎng)24小時(shí)。測量新伸長的根的長度，重復(fù)10次，所述RRj228菌株的玉米生長促進(jìn)效果顯示在下表2中。
RRj228菌株的玉米生長促進(jìn)效果

如表2所示，將原液(4.5×109c.f.u/毫升)以1∶50稀釋并進(jìn)行接種時(shí)，本發(fā)明的假單孢菌RRj228的生長促進(jìn)水平降低了26％，而在將原液以1∶100稀釋并進(jìn)行接種時(shí)，其生長促進(jìn)水平提高了13％。因此，本發(fā)明的菌株在用較低濃度接種時(shí)更加有效。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2假單孢菌RRj228的土壤病害拮抗作用使用下列方法檢測假單孢菌RRj228的土壤病害拮抗作用。首先，在PDA中分別接種病原真菌和細(xì)菌，然后將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到皮氏培養(yǎng)皿中并使之凝固。在每個(gè)平板中做一個(gè)半徑為4毫米的加樣孔，將100微升的假單孢菌RRj228在PDA液體培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)5天，然后接種到該加樣孔中。將平板在28℃下放置5天，然后檢測PGPR的生長抑制范圍，該結(jié)果顯示在下表3中。將5毫升(1×106個(gè)孢子/毫升)真菌和5毫升(1×108cfu/毫升)細(xì)菌分別與250毫升PDA培養(yǎng)基混合并于45℃振蕩，每個(gè)皮氏培養(yǎng)皿各取溶液25毫升涂板，重復(fù)三次。
RRj228菌株抑制植物病原真菌和細(xì)菌的生長范圍*(抑制生長范圍Φmm)

*接種該菌株5天后的病原體生長抑制范圍結(jié)果顯示，本發(fā)明的RRj228菌株對辣椒疫霉、腐霉菌、胡蘿卜軟腐歐氏菌和丁香假單孢菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的生長抑制效果。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3假單孢菌RRj228競爭進(jìn)入植物根部的相對能力為研究假單孢菌RRj228和熒光假單孢菌(Pseudomonasfluorescens)WCS365競爭進(jìn)入植物根部的相對能力，將兩種菌株同時(shí)接種到水稻(Kumo水稻)和蘿卜(Saxa nova)的根部之后，檢測假單孢菌RRj228占定殖于根內(nèi)的所有菌株的百分比，結(jié)果在下表4中顯示。
假單孢菌RRj228和熒光假單孢菌WCS365競爭進(jìn)入植物根部的相對能力

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4在農(nóng)作物中接種假單孢菌RRj228的效果將常規(guī)培養(yǎng)的本發(fā)明假單孢菌RRj228的培養(yǎng)液接種到水稻、辣椒、黃瓜和番茄上，結(jié)果顯示在下表5中。


如表5所示，證實(shí)假單孢菌RRj228使水稻生長增加了33.2％、辣椒生長增加了8.5％、黃瓜生長增加了21.4％、番茄生長增加了17.5％，并且本發(fā)明的假單孢菌RRj228可用做微生物肥料來替代化肥。
由于本發(fā)明的假單孢菌RRj228是直接從植物(水稻)根中分離出來的，而不是象之前的菌株是從土壤中分離的，所以該菌株可適當(dāng)?shù)囟ㄖ秤谵r(nóng)作物如水稻和黃瓜的根系內(nèi)，因此當(dāng)將該菌株接種到農(nóng)作物上時(shí)，它能夠通過穩(wěn)定地定殖于農(nóng)作物根系內(nèi)而在根系內(nèi)外自我增殖，在農(nóng)作物存活期間，由于雨水或干旱很難使其密度減少，所以其接種效果可以長時(shí)間保持。
工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明的環(huán)境親和性微生物制劑通過使用假單孢菌RRj228，能減少化肥的使用、穩(wěn)定農(nóng)作物產(chǎn)量、保護(hù)水質(zhì)和土壤環(huán)境并改善土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康。
序列表<110>韓國農(nóng)村振興廳(Republic of Korea represented by Rural Development Administration)<120>有助于農(nóng)作物生長的假單孢菌及含有該菌株的微生物制劑<130>I5042YOL<150>KR10-2004-0041457<151>2004-06-07<160>5<170>Patentln 3.1<210>1<211>1501<212>DNA<213>假單孢菌RRj228(Pseudomonas sp.RRj228)<400>1gagtttgatc ctggctcaga ttgaacgctg gcggcaggcc taacacatgc aagtcgagcg60gtagagagaa gcttgcttct cttgagagcg gcggacgggt gagtaatgcc taggaatctg120cctggtagtg ggggataacg tccggaaacg gacgctaata ccgcatacgt cctacgggag180aaagcagggg accttcgggc cttgcgctat cagatgagcc taggtcggat tagctagttg240gtgaggtaat ggctcaccaa ggcgacgatc cgtaactggt ctgagaggat gatcagtcac300actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa360tgggcgaaag cctgatccag ccatgccgcg tgtgtgaaga aggtcttcgg attgtaaagc420actttaagtt gggaggaagg gtacttacct aatacgtgag tattttgacg ttaccgacag480aataagcacc ggctaactct gtgccagcag ccgcggtaat acagagggtg caagcgttaa540tcggaattac tgggcgtaaa gcgcgcgtag gtggttcgtt aagttggatg tgaaatcccc600gggctcaacc tgggaactgc atccaaaact ggcgagctag agtatggtag agggtggtgg660aatttcctgt gtagcggtga aatgcgtaga tataggaagg aacaccagtg gcgaaggcga720ccacctggac atgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat780accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc aactagccgt tgggagcctt gagctcttag840tggcgcagct aacgcattaa gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca900
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<223>用于擴(kuò)增假單孢菌RRj228基因的PCR擴(kuò)增引物fD1<400>2agagtttgat ggctcag 17<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增假單孢菌RRj228基因的PCR擴(kuò)增引物rP2<400>3acggctacct tgttacgact t 21<210>4<211>17<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增假單孢菌RRj228基因的pUC/M13的PCR擴(kuò)增正向引物<400>4gttttcccag tcacgac 17<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增假單孢菌RRj228基因的pUC/M13的PCR擴(kuò)增反向引物<400>5gcggataaca atttcacaca gg2權(quán)利要求
1.一種假單孢菌RRj228(Pseudomonas sp.RRj228)，該菌株含有由1號序列所代表的rDNA序列，該菌株的保藏編號為KCTC10812BP。
2.一種微生物制劑，該微生物制劑含有如權(quán)利要求1所述的假單孢菌RRj228作為有效成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的微生物制劑，其中，所述制劑為替代化肥的有機(jī)肥料。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的微生物制劑，其中，所述制劑用于促進(jìn)植物生長。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的微生物制劑，其中，所述制劑用于抑制病原體生長。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的微生物制劑，其中，所述制劑還含有假單孢菌RRj228的次級代謝物作為有效成分。
7.一種土壤管理或植物培育方法，該方法通過用如權(quán)利要求2-6中任意一項(xiàng)所述的微生物制劑處理土壤或植物來進(jìn)行土壤管理或植物培育。
全文摘要
本發(fā)明涉及由1號序列所代表的假單孢菌RRj228，在農(nóng)作物的種植過程中，該菌株通過定殖于植物根系內(nèi)外而替代化肥來促進(jìn)植物生長。本發(fā)明也涉及含有假單孢菌RRj228或由其產(chǎn)生的次級代謝物的環(huán)境親和性微生物制劑。
文檔編號C05F11/00GK1876805SQ20051007503
公開日2006年12月13日 申請日期2005年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月7日
發(fā)明者姜渭金, 全元泰, 樸琪都, 金旼兌, 樸昌榮, V·切博塔里 申請人:韓國農(nóng)村振興廳