專利名稱：：中和針對因子ⅷ的c1結(jié)構(gòu)域的抑制性抗體的抑制活性的抗獨特型抗體的制作方法中和針對因子VIII的Cl結(jié)構(gòu)域的抑制性抗體的抑制活性的抗獨特型抗體現(xiàn)有技術(shù)和引言本發(fā)明涉及針對因子vm抑制性抗體的單克隆抗獨特型抗體，所述因子vm抑制性抗體結(jié)合因子vni的ci結(jié)構(gòu)域，以及涉及產(chǎn)生這種單克隆抗獨特型抗體的細(xì)胞系，涉及這種單克隆抗獨特型抗體作為藥物的用途，以及更特別地，涉及其用于制造治療血友病A的藥物的用途。血友病A是與染色體X的異常相關(guān)的遺傳疾病，其在受影響的人中顯示了自身不能凝結(jié)。這種疾病是涉及凝結(jié)的蛋白質(zhì)因子vm(Fvm)蛋白的基因上突變的結(jié)果，其決定了血液中因子vm的完全缺乏，或者其部分不足。血友病A是影響血液凝固的最常見的功能不全在法國，5000人中l(wèi)名男性是患病的，其代表了患有血友病的患者的80%。另一種類型的血友病，血友病B,影響患血友病的20%的患者它起因于其他湊是結(jié)因子，稱為因子IX中的缺乏。血友病(A或B型)的當(dāng)前的治療包括l爭月永內(nèi)施用缺乏的或缺失的湊是結(jié)因子。在法國，用于治療血友病患者的因子vm可以以分級和生物技術(shù)法國實驗室(LaboratoireFran^aisduFractionnementetdesBiotechnologies)(LFB)或國際藥物實驗室提供的血液衍生的藥物的形式，或以通過遺傳工程方法制備的重組藥物的形式來獲得。編碼因子VIII的DNA已經(jīng)一皮有效地分離并在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)(Woodetal.,Nature(1984)312:330-337),它的氨基酸序列從cDNA推導(dǎo)出。分泌的因子VIII(FVIII)是分子量300KDa(2332個氨基酸)的糖蛋白，在內(nèi)部凝結(jié)途徑的活化中起到關(guān)鍵作用。無活性的Fvm由六個區(qū)域組成Al(殘基l國372)、A2(殘基373-740)、B(殘基741-1648)、A3(殘基1690-2019)、Cl(殘基2020-2172)和C2(殘基2173-2332),從N-末端到C-末端。在被分泌之后，F(xiàn)Vin作用于vonWillebrand因子(vWF),其保護(hù)FVm對抗血漿蛋白酶。FVIII在被凝血酶裂解時從vWF上解離。這種裂解引起了B結(jié)構(gòu)域的消除和異二聚體的形成。FVIII以這種形式在血漿中循環(huán)。這種異二聚體由重鏈(Al、A2)和輕鏈(A3、Cl、C2)組成。當(dāng)FVin注入到血友病患者中時，它與患者的血液循環(huán)中的vonWillebrand因子結(jié)合?；罨囊蜃覸III作為活化的因子IX的輔助因子起作用，加速因子X向活化的因子X的轉(zhuǎn)變?；罨囊蜃覺將凝血酶原轉(zhuǎn)變成凝血酶。然后凝血酶將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，發(fā)生凝結(jié)。因子VIII施用遭遇的主要問題是在患者中針對因子VIII的抗體的出現(xiàn)，稱為"抑制性抗體，，。這些抗體中和了因子VIII的促凝血活性，其在注入時就失活了。因而，施用的凝結(jié)因子在可以停止出血之前祐:石皮壞了，其導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，因而引起治療失效。進(jìn)一步的，某些遺傳學(xué)的非血友病患者可能發(fā)展出針對內(nèi)源因子vm的抑制物這稱為獲得性血友病。研究顯示了抗因子VIII免疫反應(yīng)是多克隆IgG型的，主要屬于lgG4和IgGl亞類，更罕見地屬于IgG2。IgG3亞類從不出現(xiàn)。輕鏈通常是Kappa型的。IgG4的過量呈遞對于具有長期的建立的抑制物的血友病患者是更顯著的。FVIII分子的C2和A2結(jié)構(gòu)域是免疫反應(yīng)的有幫助的目標(biāo)，盡管在某些情況下，檢測到針對A3結(jié)構(gòu)域的抗體。當(dāng)血友病患者的血漿穿過具有固定的FVIII的免疫吸附柱時，有可能純化總抗FVIII抗體?；厥盏臄?shù)量通常高于100ng/10mg總IgG(GillesJGetal.(1993)Blood;82:2452-2461)。已經(jīng)開發(fā)了動物模型來研究因子VIII的抑制物的形成；用人類重組因子VIII免疫的大鼠顯示了多克隆型的快速免疫反應(yīng)(Jarvisetal.,ThrombHaemost.1996Feb;75(2):318-25)。抗因子VIII抗體干擾因子vni的功能的機(jī)制有很多，包括干擾因子vm的蛋白水解裂解、干擾因子VIII與不同配體例如vonWillebrand因子(vWF)、磷脂(PL)、因子IX、活化的因子X(FXa)或APC(活化的蛋白C)的相互作用。例如，涉及去氨加壓素(desmopressin),去氨加壓素是刺激因子VIII的產(chǎn)生的合成激素，凝結(jié)促進(jìn)劑，例如凝血酶原復(fù)合物的濃縮物或活化的凝血酶原復(fù)合物的濃縮物，重組因子VIIa,血漿取出法和大量或中間數(shù)量的因子VIII的輸注。盡管如此，這些方法是非常昂貴和低效力的。由于這種免疫多克隆反應(yīng)的體內(nèi)分析的復(fù)雜性，針對因子vm的某些結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體已經(jīng)被某些科研小組分離。就此，已經(jīng)分離了IgG4kappa型的人類單克隆抗體LE2E9。這種抗體針對因子VIII的C1結(jié)構(gòu)域，并且抑制因子VIII的輔助因子活性和它與vonWillebrand因子的結(jié)合(Jacqueminetal.,(2000)Blood95:156-163)。以同樣的方法，分離了針對因子VIII的C2結(jié)構(gòu)域的人類單克隆抗體，稱為B02C11(IgG4kappa),從患有血友病A、具有抑制物的患者的記憶B細(xì)胞的庫產(chǎn)生(Jacqueminetal.,Blood1998Jul15;92(2):496-506)。B02C11識別因子VIII的C2結(jié)構(gòu)域，抑制它與vonWillebrand因子和與磷脂的結(jié)合。它完全地抑制天然的和活化的因子vm的促凝結(jié)活性。單克隆抗體的進(jìn)一步的實例是針對因子VIII的A2結(jié)構(gòu)域的BOIIB2抗體。BOIIB2抗體抑制99。/。的因子VIII活性。通過與A2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，它可以干擾并抑制FIXa的結(jié)合，它在FVIII的這個區(qū)域內(nèi)含有低親和性結(jié)合位點，因而抑制FIXa的酶活性。作用的第二種設(shè)想的途徑是干擾FVIII的異二聚形式(A2:A1和A3:C1:C2)與FVIII的異三聚形式(A2和A1和A3:C1:C2)之間的平衡，通過加速這些復(fù)合物的A2結(jié)構(gòu)域的解離，使得它們無功能。(A腿yeva麗etal.,(2004)BloodCoagulFibrinolysis.Mar.15(2):109-24.Review)。借助于這些新的工具，進(jìn)一步的、更新近的針對因子vm抑制物抗可變區(qū)相互作用的能力的抗體)(Samt-RimyJMetal.,(1999)VoxSang;77(suppl1):21-24)。小鼠抗獨特型抗體，稱為14C12,在文獻(xiàn)WO2004/014955中^^開，在體內(nèi)以劑量依賴性方式中和抗因子VIII目標(biāo)抗體(單克隆抗體B02C11)的抑制性質(zhì)，所述抗因子VIII目標(biāo)抗體針對因子vm的C2結(jié)構(gòu)域?？挂蜃觱m免疫反應(yīng)是多克隆的，還開發(fā)了針對因子VIII的A2結(jié)構(gòu)域的小鼠抗獨特型抗體(在專利申請F(tuán)R0508320中描述)。A2結(jié)構(gòu)域是43kD的結(jié)構(gòu)域，它的功能不是公知的，但已經(jīng)表明FXase/FX的轉(zhuǎn)化來抑制因子VIIIa的功能(Lollaretal.,JClmInvest.1994Jun;93(6):2497-504,Fayetal.,JBiolChem.1996;271(11):6027-6032)。然而，針對因子vm的免疫反應(yīng)是多克隆的，因而，意味著抑制性抗體是針對不同于A2和C2結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域的。實際上，即使抗因子VIII抗體的表位特異性的研究顯示大部分抑制物識別因子vm分子的有7限的區(qū)域，位于重鏈的A2結(jié)構(gòu)域和/或輕鏈的C2結(jié)構(gòu)域上，其他表位有時也被識別。實際上，來自患者的某些血漿含有能夠結(jié)合因子vm的輕鏈的C1結(jié)構(gòu)域的抗體(Moreauetal.,2000;95(11):3435-441;Jacqueminetal,.2000;95(1):156-162)。因而，總是需要進(jìn)一步的工具，容許中和針對因子vin的其他結(jié)構(gòu)域的其他因子vm抑制性抗體，以更完整地中和血友病患者的抗因子vni多克隆反應(yīng)。因而，申請人試圖開發(fā)用于治療血友病A的新的工具，其允許中和針對因子vin的ci結(jié)柄域的抑制性抗體。發(fā)明的詳細(xì)說明因而，本發(fā)明的第一個目標(biāo)涉及針對因子vin人類抑制性抗體的單克隆抗獨特型抗體，所述抑制性抗體是針對因子vm的ci結(jié)構(gòu)域，這種抗獨特型抗體具有所述抗體的每條輕鏈的至少一個CDR區(qū)域(互補(bǔ)決定區(qū))，其中肽序列與選自序列SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14的序列具有至少70%的同一性，并具有所述抗體的每條重4連的至少一個CDR區(qū)域，其中肽序列與選自序列SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:1l的序列具有至少70%的同一性。所涉及的CDR區(qū)域是CDR1和/或CDR2和/或CDR3區(qū)域。SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14的序列根據(jù)Kabat來定義[Kabatetal.,"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest",NIHPublication,91-3242(1991)]。在特別有益的實施方式中，與每種上述序列的同一性是至少80%,優(yōu)選的至少90%、95%、99%,更優(yōu)選的100%。同一性的百分比通過排列要比較的兩個序列并通過計算具有相同氨基酸的位置的數(shù)目，用這個數(shù)目除以序列的氨基酸的總數(shù)來計算。在任何情況下，這些序列差異完全不影響單克隆抗體對其目標(biāo)的親和性，或者它的功能。因子vni"抑制性抗體"或"抑制物"是指抑制因子vm的全部或部分促凝血活性的抗體，即，通過與之結(jié)合，特別是其表位位于因子vm上的抗因子viii抗體。有益地，本發(fā)明的抗體具有中和針對因子VIII的C1結(jié)構(gòu)域的抑制性抗體的至少20。/。、有益地至少30%、有益地至少40%、有益地至少50%、有益地至少60%、在更有益的方法中，至少70%、80%、90%、99%或100%的凝結(jié)抑制活性，所述抑制性抗體是本發(fā)明的抗獨特型單克隆抗體的目標(biāo)。中和抑制性抗體的凝結(jié)抑制活性的這種能力通過在例如"因子VIII發(fā)色團(tuán)測試"(Jacqueminetal.(1998)Blood92.494-506)的分一斤中測量存在抑制性抗體和抗獨特型抗體的情況下因子vni的活性來測定。"抗獨特型抗體"的表述是指針對目標(biāo)抑制性抗體的可變區(qū)的抗體。在本發(fā)明的特定的方面，本發(fā)明的抗獨特型抗體針對抑制性抗體，其中所述抗體的重鏈的可變區(qū)涉及種系DP-IO。這種抑制性抗體可以通過用因子vm或來自因子vm的的片段，更特別地用包含ci結(jié)構(gòu)域的全部或部分的片段來免疫，從人類(例如，來自含有抑制性抗體的患者血清)或其他動物物種，例如，來自非限制性的列表的小鼠、馬、山羊、非人靈長類獲得。有益地，本發(fā)明的抗獨特型抗體的目標(biāo)抑制性抗體識別處于天然結(jié)構(gòu)中的C1結(jié)構(gòu)域。有益地，本發(fā)明的抗獨特型抗體的目標(biāo)抑制性抗體不識別作為R2150H突變的相同的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的單克隆抗獨特型抗體是人類或動物來源的。此外，它可以使用多種不同的方法獲得。例如，產(chǎn)生抗獨特型抗體的細(xì)胞可以從具有抗因子vin抑制性抗體的患者的外周血淋巴細(xì)胞、或從健康人獲得。這些細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)永生化，并根據(jù)生產(chǎn)抗獨特型抗體的能力來選擇，以中和針對因子vin的抑制性抗體。生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗獨特型抗體的進(jìn)一步的方法是通過動物、有益地抗體、然后通過融合脾臟'淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)i包系，有益地為小鼠骨細(xì)胞培養(yǎng)物。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的抗獨特型抗體的輕鏈的每個CDR區(qū)域含有與分別確定為SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14的序列至少70%同一性的肽序列，所述抗體的每條重鏈的每個CDR區(qū)域含有與分別確定為SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO和SEQIDNO:11的序列至少70%同一性的肽序列。12的序列具有至少70%同一性的肽序列，本發(fā)明的抗體的每條輕鏈的CDR2區(qū)域含有與SEQIDNO:13的序列具有至少70%同一性的肽序列，本發(fā)明的抗體的每條輕鏈的CDR3區(qū)域含有與SEQIDNO:14的序列具有至少70%同一性的肽序列，本發(fā)明的抗體的每條重鏈的CDR1區(qū)域含有與SEQIDNO:9的序列具有至少70%同一性的肽序列，本發(fā)明的抗體的每條重鏈的CDR2區(qū)域含有與SEQIDNO:IO的序列具有至少70%同一性的肽序列，本發(fā)明的抗體的每條重鏈的CDR3區(qū)域含有與SEQIDNO:11的序列具有至少70%同一性的肽序列。在特別有益的方式中，與每種上述序列的同一性是至少80%，優(yōu)選的至少90%、95%、99%，更優(yōu)選的100%。有益地，本發(fā)明的單克隆抗獨特型抗體的每條輕鏈的可變區(qū)由與核酸序列SEQIDNO:16具有至少70%同一性的核酸序列編碼，所述單克隆抗獨特型抗體的每條重鏈的可變區(qū)由與核酸序列SEQIDNO:15具有至少70%同一性的核酸序列編碼。對于本發(fā)明來說，信號肽可以添加到序列SEQIDNO:15和SEQIDNO:16來分別產(chǎn)生例如SEQIDNO:l和SEQIDNO:2,其中本發(fā)明的抗體的活性或特異性都不受這種信號肽的影響。在特別有益的方式中，所述序列同一性是至少80%,優(yōu)選的至少95到99%。同一性的百分比通過排列要比較的2條序列并通過計算含有相同核苷酸的位置的數(shù)目，用這個數(shù)目除以序列的核苷酸的總數(shù)來計算。遺傳密碼簡并性產(chǎn)生了相同的氨基酸可以由不同的核苷酸的幾種三聯(lián)體來編碼的事實。在任何情況下，單克隆抗體對其目標(biāo)的親和性以及它中和目標(biāo)抑制性抗體的抑制活性的能力都完全不受這些序列差異的影響。在本發(fā)明的優(yōu)選的方面，所述單克隆抗獨特型抗體的每條輕鏈的可變區(qū)由核酸序列SEQIDNO:16編碼，所述單克隆抗獨特型抗體的每條重鏈的可變區(qū)由核酸序列SEQIDNO:15編碼。序列SEQIDNO:18具有至少70%同一性、有益地至少80%或90%、再更有益地至少99%同一性的序列。對于本發(fā)明來說，信號肽可以添加到例如序列SEQIDNO:17和SEQIDNO:18來分別產(chǎn)生SEQIDNO:3和SEQIDNO:4,其中本發(fā)10明的抗體的活性或特異性都不受這種信號肽的影響。在有益的方式中，本發(fā)明的抗體的每條重鏈可變區(qū)的肽序列是與序列SEQIDNO:3具有至少70%同一性、有益地至少80%或卯％、再更有益地至少99%同一性的序列。在特別有益的方式中，本發(fā)明的抗體的每條輕鏈的肽序列是與序列SEQIDNO:4具有至少70%的同一性、有益地至少80%或90%、再更有益地至少99%的同一性的序列，本發(fā)明的抗體的每條重鏈的肽序列是與序列SEQIDNO:3具有至少70%的同一性、有益地至少80%或90%、再更有益地至少99%的同一性的序列，優(yōu)選的，本發(fā)明的抗體的每條輕鏈的肽序列是序列SEQIDNO:4。優(yōu)選的，本發(fā)明的抗體的每條輕鏈的肽序列是序列SEQIDNO:3。從序列SEQIDNO:16推出的肽序列是序列SEQIDNO:18，從序列SEQIDNO:15推出的肽序列是SEQIDNO:17。優(yōu)選的，本發(fā)明的單克隆抗獨特型抗體的每條輕《連的可變區(qū)具有肽序列SEQIDNO:18,本發(fā)明的單克隆抗獨特型抗體的每條重鏈的可變區(qū)具有肽序列SEQIDNO:17。在優(yōu)選的方式中，本發(fā)明的抗獨特型抗體的目標(biāo)抑制性抗體是以登記號LMBP6165CB、由Collen研究基金會于2004年8月保藏在比利時孩i生物/質(zhì)粒保藏協(xié)作〗呆藏所(BCCM/LMBP),LaboratoriumvoorMoleculaireBiologie,UniversityofGhent,Technologiepark297,B-9052Zwijnaarede的抗體RHD5。這種抗體，以及它的核苦酸和肽序列在專利申請WO2005/106455中描述?？贵wRHD5是針對因子VIII的C1結(jié)構(gòu)域的人類單克隆IgGl抗體，最初從患有血友病A、即具有高水平抑制物的獲得性嚴(yán)重血友病A的患者的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。這個抗體屬于IgGl亞類，來源于種系DP-10。在因子VIII上所述抗體識別的表位是處于其天然結(jié)構(gòu)的C1結(jié)構(gòu)域，而不是與R2150H突變相同的結(jié)構(gòu)域。抗體RHD5可以抑制高達(dá)98%的因子VIII活性。一個或多個氨基酸被替換或刪除。這種替換或刪除可以位于分子中的任何位置。在幾個氨基酸被替換或刪除的情況下，可以考慮替換或刪高可能與本發(fā)明的抗獨特型抗體或與目標(biāo)抑制性抗體接觸的殘基的數(shù)目。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述抗獨特型抗體是小鼠抗體。有益地，這種小鼠單克隆抗獨特型抗體是IgGlkappa。優(yōu)選的，本發(fā)明的單克隆抗體是嵌合抗體。"嵌合抗體"的表述，要理解為它是指一種抗體，其中輕鏈和重鏈的可變區(qū)屬于與輕鏈和重鏈的恒定區(qū)不同的物種。因而，本發(fā)明的抗體還含有屬于非鼠物種的輕鏈和重鏈的恒定區(qū)。就此來說，能夠使用所有的非鼠哺乳動物科和種，特別是，例如，人、猴、鼠科(除了小鼠)、豬科、?？啤ⅠR科、貓科、犬科以及禽類。本發(fā)明的嵌合抗體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的重組DNA的標(biāo)準(zhǔn)才支術(shù)來構(gòu)建，更特別；也通過使用例如Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81.pp.6851-55(1984)所描述的"嵌合，，抗體構(gòu)建技術(shù)，其中利用重組DNA技術(shù)來使用人類免疫球蛋白的相應(yīng)區(qū)域替換來自非人哺乳動物的抗體的重鏈的恒定區(qū)和/或輕鏈的恒定區(qū)。在本發(fā)明的特定的方面，本發(fā)明的抗體是人類雜交抗體，也就是說嵌合抗體，它的恒定部分是人類的。本發(fā)明的這個實施方式允許降低抗體在人類中的免疫原性，從而改善它在向人治療性施用時的效力。有益地，本發(fā)明的抗體是人源化的抗體。這種抗體可以通過將非人物種的單克隆抗體的一個或多個CDR區(qū)域(互補(bǔ)決定區(qū))與人類框架區(qū)域(可變區(qū)的高度保守區(qū)域，稱為框架)相連來獲得，這種制造過程在本領(lǐng)域中已經(jīng)討論了(Jonesetal.,Nature(1986)321:522;Riechmannetal.,Nature(1988)332:323)。這種針對識別FVIII的C1結(jié)構(gòu)域的抑制性抗體的可變區(qū)的人源化抗體可以含有人類框架區(qū)域和序列SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14的一個或多個CDR區(qū)域。一種本發(fā)明的特定人源化的抗體是針對識別FVIII的C1結(jié)構(gòu)域的抑制性抗體的可變區(qū)的人源化抗體，其CDR區(qū)域是序列SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14的區(qū)域。在有益的方式中，本發(fā)明的單克隆抗獨特型抗體是2006年1月24日以登記號碼CNCMI-3559保藏在微生物培養(yǎng)物國家保藏所(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes)(CNCM,25rueduDocteurRoux,75724ParisCedex15)的雜交瘤18B6產(chǎn)生的抗體18B6。單克隆抗獨特型抗體18B6的每條輕鏈的可變區(qū)由核酸序列SEQIDNO:16編碼，單克隆抗獨特型抗體18B6的每條重鏈的可變區(qū)由核酸序列SEQIDNO:15編碼。獲得雜交瘤18B6的方法在本文件的"實施例"小節(jié)中描述。本發(fā)明的單克隆抗獨特型抗體還涉及包含抗體18B6的片段的任何抗體，更特別地，包含抗體18B6的輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的任何抗體，或抗體18B6的輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的任何片4殳。"片段"的表述，是指F(ab')2片段或Fab'片段或Fab片段或CDR區(qū)域、或任何這些片段或區(qū)域的任何修飾的形式。在本發(fā)明的特定的實施方式中，本發(fā)明的單克隆抗獨特型抗體是F(ab')2片段或Fab'片段或Fab片段或CDR區(qū)域，或任何這些片段或區(qū)域的任何修飾的形式。使用木瓜蛋白酶的免疫球蛋白酶消化產(chǎn)生2個相同的稱為"Fab片段"(抗原結(jié)合的片段)的片段和Fc片段(可結(jié)晶部分)。Fc片段是免疫球蛋白的效應(yīng)物功能的支持。使用胃蛋白酶消化，產(chǎn)生F(ab')2片段，其中兩個Fab片段保持被兩個二硫鍵連接，F(xiàn)c片段被分成幾個肽。F(ab')2片段由兩個Fab'片段形成(一個Fab'片段由Fab和絞鏈區(qū)組成)，由相互鏈接的二硫鍵連接來形成F(ab')2。含有抗體的結(jié)合位點的這些片段，也可能喪失產(chǎn)生它們的完整抗體的某些性質(zhì)，例如，活化補(bǔ)體、或結(jié)合FcY受體的能力。然而，這些片段沒有喪失完整抗體中和抑制性抗體的能力。因而，本發(fā)明還涉及抗體18B6的F(ab')2、Fab'、Fab片,殳，或涉及CDR區(qū)域，或任何這些片段或區(qū)域的任何修飾的形式。特別地，這些片段保持了完整抗體中和RHD5抗體的能力。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是產(chǎn)生例如如上所述的抗體的穩(wěn)定的細(xì)胞系。本發(fā)明的穩(wěn)定的細(xì)胞系可以是人類或動物來源的。本發(fā)明的穩(wěn)定的細(xì)胞系可以來源于人類永生細(xì)胞。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實施方式中，這種細(xì)胞系可以來源于動物來源，例如小鼠的永生細(xì)胞。在本發(fā)明的這個實施方式中獲得的細(xì)胞系的優(yōu)選的實例是以編號I-3559保藏在CNCM的細(xì)胞系18B6。在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明的穩(wěn)定的細(xì)胞系是一種細(xì)胞系，其在基因組的期望的位點整合了容許本發(fā)明的抗體的表達(dá)的遺傳構(gòu)建體。獲得這種細(xì)胞的步驟是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。這種步驟可以應(yīng)用于任何類型的細(xì)胞，只要它們能夠維持在體外培養(yǎng)中。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染需要遺傳構(gòu)建體的整合，其可以通過同源重組或隨機(jī)地進(jìn)行。例如，在包含為細(xì)胞賦予抗生素抗性的感興趣的基因的遺傳構(gòu)建體中的陽性選擇盒的存在，證明了轉(zhuǎn)基因向細(xì)胞基因組中的插入。作為亞克隆步驟的結(jié)果，從本發(fā)明的抗體獲得長期的生產(chǎn)細(xì)胞系，例如18B6，其可以在體外培養(yǎng)中維持。表達(dá)本發(fā)明的抗體的穩(wěn)定的細(xì)胞系可以選自由人類細(xì)胞系、嚙齒動物細(xì)胞系，例如小鼠細(xì)月包系、SP2/0、YB2/0、IR983F、人類骨髓瘤例如Namalwa,或任何人類來源的其他細(xì)胞例如PERC6、CHO細(xì)胞系，特別地CHO-K-l、CHO-LeclO、CHO-Lecl、CHO畫Lec13、CHOPro-5、CHOdhfr-(CHODXBll,CHODG44)構(gòu)成的組，或是選自Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS曙7、293-HEK、BHK、K6H6、NS0、SP2/0-Ag14和P3X63Ag8.653的進(jìn)一步的細(xì)胞系。本發(fā)明的進(jìn)一步特別的主題是以登記號碼CNCMI-355W呆藏在微生物培養(yǎng)物國家保藏所(CNCM)的雜交瘤18B6。由雜交瘤18B6產(chǎn)生的單碼，由雜交瘤18B6產(chǎn)生的單克隆抗獨特型抗體的每條重鏈的可變區(qū)由核酸序列SEQIDNO:15編碼。雜交瘤18B6產(chǎn)生的抗體是抗體18B6，在本文件的"實施例"小節(jié)中描述了獲得雜交瘤18B6的方法。本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是編碼本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)的序列SEQIDNO:15的DNA片段，例如早先所描述的。這種DNA片段可以插入到允許多肽、優(yōu)選抗體的表達(dá)的載體中，所述抗體的重鏈可變區(qū)由核酸序列SEQIDNO:15編碼，其杏亍生的序列是序列SEQIDNO:17,以導(dǎo)入和維持在宿主細(xì)胞中。這種載體允許這種外源核酸片l殳在宿主細(xì)胞表達(dá)，因為它含有這種表達(dá)所必需的序列(啟動子、多聚腺苷酸序列、選擇基因)。這種載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以是腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、質(zhì)粒或噬菌體，這個列表不是限制性的。此外，可以^吏用任何哺乳動物，例如宿主細(xì)月包，其是表達(dá)本發(fā)明的多肽或抗體的細(xì)胞，例如SP2/0、YB2/0、IR983F、人類骨髓瘤例如Namalwa,或人類來源的任何其他細(xì)胞例如PERC6、CHO細(xì)胞系，特別地CHO-K-l、CHO-LeclO、CHO隱Lecl、CHO-Lec13、CHOPro曙5、CHOdhfr國(CHODXBll、CHODG44),或選自Wil國2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NS0、SP2/0-Ag14和P3X63Ag8.653的其他細(xì)胞系。本發(fā)明的進(jìn)一步的目標(biāo)是編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈可變區(qū)的序列SEQIDNO:16的DNA片段，例如早先所描述的。這種DNA片段可以插入到允許多肽、優(yōu)選抗體的表達(dá)的載體中，所述抗體的輕鏈可變區(qū)由核酸序列SEQIDNO:16編碼，其推定的肽序列是序列SEQIDNO:17，以導(dǎo)入和維持在宿主細(xì)胞中。這種載體允許這種外源核酸片段在宿主細(xì)胞表達(dá)，因為它含有這種表達(dá)所必需的序列(啟動子、多聚腺苷酸序列、選擇基因)。這種載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以是腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、質(zhì)粒或噬菌體，這個列表不是限制性的。此外，可以使用任何哺乳動物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，其是表達(dá)本發(fā)明的多肽或抗體的細(xì)胞，例如SP2/0、YB2/0、IR983F、人類骨髓瘤例如Namalwa,或人類來源的任何其他細(xì)胞例如PERC6、CHO細(xì)胞系，特別是CHO-K-l、CHO-LeclO、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHOPro-5、CHOdhfr-(CHODXBll、CHODG44),或選自Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NS0、SP2/0-Ag14和P3X63Ag8.653的其他細(xì)胞系。本發(fā)明的進(jìn)一步的目標(biāo)是藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗體和至少一種賦形劑和/或至少一種藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選的，本發(fā)明的藥物組合物中含有的單克隆抗獨特型抗體是抗體18B6、來自18B6的片段或區(qū)域、或包含18B6的可變區(qū)或CDRs的嵌合抗體或人源化抗體，以及在本文件中早先描述的那些。本發(fā)明的藥物組合物可以浮皮配制入可以被要治療的患者耐受任何賦形劑。這種賦形劑的實例包括水、鹽水溶液、Rmger，s溶液、葡萄糖溶液，以及任何其他適合的水性生理溶液。賦形劑也可以含有少量的添加劑，例如，提高等滲性和組合物的穩(wěn)定性的物質(zhì)。這種賦形劑包括磷酸鹽緩沖液、碳酸氫鹽緩沖劑和Tris緩沖液。這種賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。標(biāo)準(zhǔn)制劑可以是用于注射的液體形式，或固體制劑，其可以在施用之前重懸浮在適合的液體中。用于制備本發(fā)明的藥物組合物的有用的載體有益地具有提高治療組合物在動物或患者中的半衰期的功能，或允許活性成分的控制釋放的功能。這種載體可以是能夠以正常速度散布藥物的、或僅在某些環(huán)境中散布藥物的有機(jī)和合成的聚合物、以及進(jìn)一步的化合物，也可以是脂質(zhì)體，這個列表不是限制性的。有益地，本發(fā)明的藥物組合物，此外至少包含針對抑制性抗體的域。這種其他的抗體可以是針對抑制性抗體的抗獨特型抗體，所述抑制性抗體結(jié)合因子VIII的Al、或A3、或B、A2或C2結(jié)構(gòu)域。實際上，發(fā)展出抑制性抗體的、患有血友病A的患者最經(jīng)常地展現(xiàn)幾種類型的抑制性抗體。此外，不同類型的抑制性抗體的數(shù)量和性質(zhì)是不固定的，在患者的生命期中可以改變。因而，同一患者的不同的抑制性抗體針對因子VIII的不同結(jié)構(gòu)域，特別有益的不是使用一種、而是使用針對不同抑制性抗體的幾種類型的抗獨特型抗體來治療患者。優(yōu)選的，所述藥物組合物包含針對結(jié)合因子VIII的C2結(jié)構(gòu)域的抑制性抗體、和/或結(jié)合因子VIII的A2結(jié)構(gòu)域的抑制性抗體的單克隆抗獨特型抗體，以及本發(fā)明的單克隆抗體。實際上，A2和C2結(jié)構(gòu)域是抗因子vm免疫反應(yīng)的主要目標(biāo)。因而，包含針對結(jié)合因子vm的ci結(jié)構(gòu)域的獨特型抗體的混合物的藥物組合物，允許中和患者中存在的至少70%、有益地至少80%或90%的全部抑制性抗體。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物包含抗體14C12(在比利時協(xié)作微生物保藏所以編號LMBP5878CB保存)和/或抗體30Dl(在CNCM以編號I-3450保藏)。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式中，所述藥物組合物包含以編號I-3510在CNCM保藏的嵌合抗體14C12,和/或衍生自抗體30D1的嵌合的或人源化的抗體，其是包含抗體30D1的可變區(qū)的抗體。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是本發(fā)明的抗體作為藥物的用途。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是本發(fā)明的抗體用于制造藥物的用途。有益地，這種藥物被用于在患有血友病、包含針對因子VIII的Cl結(jié)構(gòu)域的抑制性抗體的患者中降低和/或防止和/或治療出血。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是本發(fā)明的抗體用于制造用于治療A型血友病的藥物的用途。有益地，這樣治療的A型血友病是具有抑制物的血友病。用本發(fā)明的抗體治療的這種類型的血友病可以是先天的或獲得性的。通過中和抑制性抗體，本發(fā)明的抗體使得通過向患者注射因子VIII的治療是有效的，因為因子vm的活性不再被抑制性抗體抑制。結(jié)構(gòu)域的抑制性抗體的體外或體內(nèi)抑制活性的用途?？梢赃M(jìn)行這種過向所述患者重新注射處理過的血液。本發(fā)明的進(jìn)一步的目標(biāo)涉及包含本發(fā)明的抗體、優(yōu)選的抗體18B6的藥物。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是所述抗體用于吸附抑制性抗體的用途，例如，用以純化因子vni抑制性抗體。最后，本發(fā)明的進(jìn)一步的目標(biāo)是本發(fā)明的抗體用于檢測和/或純化因子vm抑制性抗體的用途。進(jìn)行這種檢測方法和純化的一般過程是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。舉例來說，可以提及的是使用含有珠子的免疫純化柱，所述珠子具有嫁接到它們表面上的本發(fā)明的抗體。僅被抗體識別的分子將自身吸附到所述珠子上。其他的將穿過所述柱。為了回收所述分子，提高的溶劑離子強(qiáng)度是足夠的。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面和益處將在以下實施例中描述，其將#皮認(rèn)為是例示而不是限制本發(fā)明的范圍。附圖1:對于4只小鼠的抗獨特型抗體與RHD5結(jié)合的提高(平均值)。附圖2:抗獨特型抗體18B6與不溶的抗體RHD5的直接結(jié)合。附圖3:抗體RHD5與不溶的重組FVIII(recFVIII)的結(jié)合的抑制作用。附圖4:18B6對RHD5的中和。實施例實施例1:針對因子vm的Cl結(jié)構(gòu)域的人單克隆抗體的產(chǎn)生("抗Cl抗體")根據(jù)在文件Jacquemmetal.(1998),Blood92,496畫506和專利申請WO2005/016455中描述的搡作，以下在此描述的人類淋巴樣干細(xì)胞系通過患有獲得性血友病A、發(fā)展了對因子VIII的免疫反應(yīng)的患者的B淋巴細(xì)胞的永生化來獲得。產(chǎn)生單克隆抗C1RHD5抗體的細(xì)胞系以登記號LMBP6165CB、由Collen研究基金會于2004年8月保藏在比利時微生物/質(zhì)粒保藏協(xié)作保藏戶斤(BCCM/LMBP),LaboratoriumvoorMoleculaireBiologie,UniversityofGhent,Technologiepark297,B-9052Zwijnaarede,Belgium。RHD5抗體的重鏈可變區(qū)的核苦酸序列是序列SEQIDNO:5,RHD5抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列是序列SEQIDNO:6。相應(yīng)于序列SEQIDNO:5的肽序列是序列SEQIDNO:7,相應(yīng)于序列SEQIDNO:6的肽序列是序列SEQIDNO:8。任選的，展現(xiàn)需要的性質(zhì)的抗體可以通過免疫動物來產(chǎn)生。在這種情況下，人類因子VIII與佐劑注射到小鼠中。通過融合脾臟淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系來獲得單克隆抗人類抗體。鑒定產(chǎn)生抗因子VIII抗體的細(xì)胞上清液，并通過限制稀釋來克隆。這種方法的一般性說明可以在CurrentProtocolsinImmunology,Chapter2,JohnWiley&Sons,Inc,1994中找到。以下描述了展現(xiàn)期望的性質(zhì)的抑制物的進(jìn)一步選擇。實施例2:抗獨特型抗體18B6的產(chǎn)生I.小鼠免疫四只6周齡Balb/c雌性小鼠用懸浮在完全弗氏佐劑(ACF)(第一次免疫)中的、然后懸浮在弗氏不完全佐劑(AIF)中的10(agFVIIIRHD5抗體的人類抗Cl結(jié)構(gòu)域在爪墊中皮下地注射(SC)三次。第一次放血(放血0)在免疫之前(出血天O(DO))進(jìn)行，然后如下進(jìn)4于注射和方文血Dl:注射N。1(存在完全弗氏佐劑的情況下10|ugRHD5抗體)D15:放血N。1D16:注射N。2(在存在弗氏不完全佐劑的情況下10i!gRHD5抗體)D28:放血N。2D29:注射N。3(在存在弗氏不完全佐劑的情況下10|ugRHD5抗體)D44:放血N。3II.小鼠的免疫反應(yīng)的評估為了評估不同的放血中抗RHD5抗體的存在，進(jìn)行直接結(jié)合的ELISA分析。為此，3pg/ml的RHD5抗體或?qū)φ誌gGl進(jìn)行不溶解化，50pg/孔，un甘氨酸緩沖液，在4。C過夜(甘氨酸緩沖液二0.1M甘氨酸、0.17MNaCl，pH9.2)。用PBS/Tween進(jìn)行三次洗滌(PBS=140.0mMNaCl,2.6mMKC1,1.4mMKH2P04,8.1nMNa2HP04.2H20,pH7.4)。系統(tǒng)在室溫下(RT)使用IOOiul/孔的Magic緩沖液(Magic緩沖液二50mMTris、0.17MNaCl、1%BSA,pH7.2)保持飽和30分鐘。后來，放出的血液在Magic緩沖液中稀釋到1/10、1/100、1A000和1/10000,在室溫下孵育2小時(50ili1/孔)。然后，在PBS/Tween中進(jìn)行3次洗滌。隨后，系統(tǒng)與HRP(辣根過氧化酶)(Bio-Rad)標(biāo)記的llug/ml山羊多克隆小鼠抗lgG抗體在室溫系孵育2小時(50ili1/孑L)(在Magic緩沖液中稀釋)。然后，系統(tǒng)用PBS/Tween洗滌3次，用發(fā)色團(tuán)(鄰-苯基二胺)進(jìn)行顯示，獲得的顏色的強(qiáng)度使用具有相應(yīng)于波長490/650nm的濾光器的讀出器讀取(讀出器EmaxMolecularDevithese,Sunnyvale,CA)。使用對照IgGl獲得的光密度的結(jié)果:<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表1使用RHD5獲得的光密度的結(jié)果:<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表2獲得的結(jié)果在附圖l中描繪。結(jié)論每只小鼠正確地應(yīng)答并與RHD5Fab片段的注射類似地起反應(yīng)。在任意的方式中，選擇小鼠n°4來進(jìn)行融合。III.融合和篩選進(jìn)行小鼠n。4的脾臟淋巴細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0的細(xì)胞的融合。以對于本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的途徑進(jìn)行融合(J.G.Gillesetal.,Blood(2004)103:2617-23;P.Cornelis,<〈Lesanticorpsmonoclonaux,RevueIRE,vol.7,N。4,1983)。根據(jù)有限稀釋的原則將細(xì)胞在含有次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco，sModifiedEagleMedium)中連續(xù)地擴(kuò)增，在直接結(jié)合ELISA分析中檢測測試為陽性的克隆，例如早先在II點中描述的那樣。結(jié)合的特異性通過不溶解的具有非相關(guān)特異性、在實驗室中生產(chǎn)的人類IgGl抗體來確認(rèn)。為了確定雜交瘤穩(wěn)定性，以從200pl到5ml的不同培養(yǎng)基體積在克隆擴(kuò)增期間重復(fù)表位篩選測試(測試1到3)。測試1=在200的孔中測量測試2=在1ml的孔中測量測試3=在5mL的瓶中測量在不同的表位篩選期間獲得的結(jié)果在以下表格中概述<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表3IV.使用培養(yǎng)物上清液的抑制作用分析如在表3中所示，使用培養(yǎng)物上清液進(jìn)行抑制作用的測試。進(jìn)行這種分析來乂人克隆中選擇抗獨特型抗體，其精確地識別定位于RHD5Ab的抗體決定簇水平上的表位決定簇。在ELISA分析中測試所述抗獨特型在甘氨酸緩沖液中2嗎/ml的重組因子VIII(recFVIII)(Baxter)，50)Lil/孔進(jìn)行不溶解化，在室溫下保持2小時。0.6jug/ml終濃度的RHD5抗體(或不相關(guān)的IgGl)與Magic緩沖液中稀釋度1/1、1/2和1/4的培養(yǎng)物上清液預(yù)孵育2小時。反應(yīng)孔用PBS/Tween緩沖液洗滌3次，然后用100jal/孔的Magic緩沖液飽和(在室溫下30分鐘)。以后，培養(yǎng)物上清液與50)ul的RHD5(或不相關(guān)的IgGl)(在室溫下2小時，Magic緩沖液)孵育，然后，進(jìn)行3次洗滌。通過添加50)al/孔的Magic緩沖液中l(wèi)iLig/ml的小鼠多克隆人類抗IgGHRP標(biāo)記的(SouthernBiotechnology)抗體的溶液，檢測與不溶的recFVIII結(jié)合的RHD5抗體。用PBS/Tween進(jìn)行三次連續(xù)的洗滌，然后用發(fā)色團(tuán)(OPD鄰-苯基二胺)進(jìn)行顯示，獲得的顏色的強(qiáng)度使具有相應(yīng)于波長490/650nm的濾光器的讀出器讀取(讀出器EmaxMolecularDevithese,Sunnyvale,CA)。結(jié)論如表3所示，11個克隆能夠特異性地抑制與不溶解的recFVIII結(jié)合的RHD5抗體。(N.B.:陰性值，表示結(jié)合抗體決定簇的外部區(qū)域的可能性，或者反映培養(yǎng)物上清液中不足的Ab濃度。然而，對于陽性的數(shù)目，才艮據(jù)以下的測試淘汰陰性孔)。V.使用培養(yǎng)物上清液的功能測試RHD5抗體抑制性活性(抗因子VIII)的中和的測量在Magic緩沖液中，在37。C,以llug/ml的濃度將RHD5抗體與在抑制作用測試期間選擇的不同克隆的上清液孵育(稀釋3倍、6倍、12倍和24倍)。在30分鐘之后，添加0.5U/mL終濃度的FVinKogenate(Bayer),在37。C進(jìn)行互補(bǔ)孵育30分鐘。樣品在Magic緩沖液中稀釋30X,然后根據(jù)廠家的i兌明書添加產(chǎn)色DADE測試的試劑(因子VIII產(chǎn)色的,DadeBehringGmbh,Marburg,Germany)。如在表3中所示，10個克隆能夠中和RHD5Ab的抑制性活性。選擇抗體18B6來按以下過程使用，作為結(jié)果和中和曲線的函數(shù)。VI.選擇的18B6抗RHD5克隆的擴(kuò)大生產(chǎn)在DMEM培養(yǎng)基中生產(chǎn)抗獨特型抗體18B6。這種生產(chǎn)繼之以在蛋白G親和柱上純化(其允許抗體的純化、然后濃縮，因而進(jìn)一步確定獲得的抗獨特型抗體特異性)。純化18B6:以8.48mg/ml產(chǎn)生8mlVII.特異性評估根據(jù)與II和IV點中描述的相同方案使用ELISA評估各個制品。1.ELISA分析抗獨特型抗體18B6與不溶的抗體RHD5的直接結(jié)合抗獨特型抗體18B6與不溶的抗體RHD5的直接結(jié)合在附圖2中說明。曲線顯示了，抗體18B6與RHD5的結(jié)合是劑量依賴性的。2.ELISA分析抗體RHD5結(jié)合不溶的重組FVIII的抑制作用。根據(jù)IV點中描述的方案測量RHD5抗體結(jié)合不溶的重組FVIII的抑制作用。使用的RHD5的濃度等于2|ug/ml。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表4結(jié)果在附圖3中示出。在2.5的RHD5/18B6摩爾比下獲得了RHD5結(jié)合FVIII的50。/。抑制，而等摩爾的比例抑制92%的這種結(jié)合。3.功能測試RHD5抗體抑制性活性(抗FVIII)的中和的測量方案與V點中描述的相同，最終的RHD5濃度0.4|ug/ml,純化的抗獨特型抗體的曲線從4到0.002i!g/ml終濃度。結(jié)果在以下的表5中給出抗-Id濃度(pg/ml)中和(％)489.51.3381.20.4454.30.14827.40.049110.01658.80,00556.70.001838.90扁66.70扁20表5結(jié)果在附圖4中說明。以等摩爾的RHD5/18B6比例獲得了RHD5抑制活性的50%中和。4.使用"表面胞質(zhì)團(tuán)共振Biacor"方法的抗獨特型抗體18B6的結(jié)合動力學(xué)測量利用PharmaciaBiosensorBIAcore(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,Sweden)通過使用"表面胞質(zhì)團(tuán)共振Biacore"方法評估了抗獨特型抗體18B6對抑制物RHD5抗體的結(jié)合動力學(xué)。RHD5抗體固定在CM5探針的活化的表面上?？躬毺匦涂贵w18B6浸入固定在探針表面的不同的RHD5濃度中。測定締合和解離常數(shù)Ka(M-1S-1)=4.26x103Kd(S-l)=1.45xl0-5KD:M.3.4x10-95.抗獨特型抗體18B6亞類的表征為了確定抗體18B6的子集，使用Roche的IsoStrip系統(tǒng)(比色條帶)?？贵w18B6被鑒定為IgGlKappa。顆.抗體18B6的序列為了進(jìn)行測序，使用QuickPrepMicromRNA純化試劑盒25(AmershamPharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)分離產(chǎn)生抗獨特型抗體18B6的雜交瘤的mRNA。使用第一鏈cDNA合成試劑盒(AmershamPharmaciaBiotech)合成cDNA。編碼重鏈(VH)和輕鏈(VL)的cDNA使用與小鼠中潛在存在的不同基因家族相應(yīng)的特異性引物通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來擴(kuò)增。通過QIAquickGel提取試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)從1.5。/o的瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，用pGEM-TEasy載體系統(tǒng)(Promega,Madison,WI)克隆。陽性菌落的質(zhì)粒DNA通過HighPurePlasmid分離i式劑盒(RocheDiagnostics,Mannheim,Germany)分離,用Seqenase(USBiochemical,Cleveland,OH)雙向；也測序。IX.18B6抗體的特別的性質(zhì)抗體18B6完全地抑制RHD5抗體結(jié)合它的抗原，因子VIII。RHD5抗體帶有與18B6的互補(bǔ)的獨特型。抗體與抗原的結(jié)合涉及與多個氨基酸相應(yīng)的6到12個埃2(angstroms2)的相互識別的對接，其通過氫鍵、疏水性或極性引力和范德華(VanderWals)橋相互締合。在功能水平上，當(dāng)抗體完全地抑制抗體與抗原的結(jié)合時，這意味著抑制性抗體帶有抗原的"內(nèi)部圖像"，也就是說，模擬抗原的3-D結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)。雖然18B6抗體的一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)顯示了與因子VIII的C1結(jié)構(gòu)域的低同一性，18B6抗體的二級結(jié)構(gòu)與FVIII的C1結(jié)構(gòu)域的二級結(jié)構(gòu)的比較、RHD5抗體的抗原性目標(biāo)、18B6的三維建才莫表明，通過與C1結(jié)構(gòu)域的3-D結(jié)果重疊，18B6的輕鏈(VL)的可變部分呈現(xiàn)了C1結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部圖4象。這種觀察賦予了18B6抗體特別的、新的和不可預(yù)見的性質(zhì)。換句話說，通過用抗體例如RHD5的免疫產(chǎn)生類似于18B6的抗體的任何努力事實上沒有產(chǎn)生與18B6相同的抗體。2權(quán)利要求1.一種針對因子VIII人類抑制性抗體的單克隆抗獨特型抗體，所述抑制性抗體針對因子VIII的C1結(jié)構(gòu)域，其特征在于所述抗體的每條輕鏈的至少一個CDR區(qū)域(互補(bǔ)決定區(qū))含有與選自序列SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14的序列具有至少70％同一性的肽序列，以及其中所述抗體的每條重鏈的至少一個CDR區(qū)域含有與選自序列SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11的序列具有至少70％同一性的肽序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其特征在于所述抗體的每條輕鏈的每個CDR區(qū)域含有分別與序列SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14具有至少70%同一性的肽序列，以及其中所述抗體的每條重鏈的每個CDR區(qū)域含有分別與序列SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO和SEQIDNO:11具有至少70%同一性的肽序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的任一項的抗體，其特征在于所述抗體的每條輕鏈的可變區(qū)由與核酸序列SEQIDNO:16具有至少70%同一性的核酸序列編碼，以及其中所述抗體的每條重《連的可變區(qū)由與核酸序列SEQIDNO:15具有至少70%同一性的核酸序列編碼。4.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項的抗體，其特征在于所述抗體的每條輕鏈的可變區(qū)由核酸序列SEQIDNO:16編碼，以及其特征在于所述抗體的每條重鏈的可變區(qū)由核酸序列SEQIDNO:15編碼。5.根據(jù)前迷權(quán)利要求的任一項的抗體，其特征在于其每條輕鏈的可變區(qū)的肽序列是展現(xiàn)了與序列SEQIDNO:18至少70%的同一性的序列，以及其每條重鏈的可變區(qū)的肽序列是展現(xiàn)了與序列SEQIDNO:17的至少70%的同一性的序列。6.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項的抗體，其特征在于從序列SEQIDNO:16推出的肽序列是序列SEQIDNO:18,以及其特征在于從序列SEQIDNO:15推出的肽序列是序列SEQIDNO:17。7.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項的抗體，其特征在于所述抑制性抗體是抗體RHD5(以編號LMBP6165CB保藏在保藏所BCCM/LMBP)。8.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項的抗體，其特征在于所述抗獨特型抗體是小鼠抗體。9.根據(jù)權(quán)利要求8的抗體，其特征在于所述抗獨特型抗體是IgGlkappa。10.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項的抗體，其特征在于所述抗體是嵌合抗體。11.根據(jù)權(quán)利要求10的抗體，其特征在于所述抗體是人類雜交抗體。12.根據(jù)權(quán)利要求1到9的任一項的抗體，其特征在于所述抗體是人源化的抗體。13.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項的抗體，其特征在于它選自由F(ab')2片段、Fab'片段、Fab片段、CDR區(qū)域和這些片段或區(qū)域的任一個的任何修飾的形式。14.根據(jù)前述權(quán)利要求1到9的任一項的抗體，其特征在于它能夠由以登記號碼CNCM1-3559保藏在微生物培養(yǎng)物國家保藏所(CNCM)的雜交瘤18B6產(chǎn)生。15.—種產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1到13的任一項的抗體的穩(wěn)定細(xì)胞系。16.才艮據(jù)權(quán)利要求15的穩(wěn)定細(xì)胞系，選自由SP2/0、YB2/0、IR983F、人類骨髓瘤Namalwa、PERC6、細(xì)胞系CHO，特別是CHO-K畫l、CHO-LeclO、CHO-Lecl、CHO-Lec13、CHOPro畫5、CHOdhfr陽、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt畫4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NSO、SP2/0-Ag14和P3X63Ag8.653構(gòu)成的組。17.以登記號碼CNCM1-3559保藏在樣i生物培養(yǎng)物國家保藏所(CNCM)的雜交瘤18B6。18.—種針對因子vm人類抑制性抗體的單克隆抗獨特型抗體，所述抑制性抗體針對由登記號碼CNCM1-3559保藏在農(nóng)i生物培養(yǎng)物國家保藏所(CNCM)的雜交瘤18B6產(chǎn)生的因子VIII的Cl結(jié)構(gòu)域。19.一種展現(xiàn)序列SEQIDNO:15的DNA片段，所述序列SEQIDNO:15編碼根據(jù)權(quán)利要求1到14的任一項的抗體的重鏈可變區(qū)。20.—種展現(xiàn)序列SEQIDNO:16的DNA片段，所述序列SEQIDNO:16編碼根據(jù)權(quán)利要求1到14的任一項的抗體的輕鏈可變區(qū)。21.—種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求l到14的任一項的抗體，和至少一種賦形劑和/或至少一種藥學(xué)上可接受的載體。22.根據(jù)權(quán)利要求21的組合物，特征在于它包含針對抗FVIII抗體的至少一種抗獨特型抗體，所述抗FVIII抗體針對因子VIII的不同于Cl結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域。23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的任一項的組合物，其中它包含4十對抗FVIII抗體和/或針對因子VIII的A2結(jié)構(gòu)域的抗體的抗獨特型抗體，所述抗FVIII抗體針對因子VIII的C2結(jié)構(gòu)域。24.根據(jù)權(quán)利要求l到14的任一項的抗體的用途，用于制造藥物。25.根據(jù)權(quán)利要求l到14的任一項的抗體的用途，用于制造用于治療A型血友病的藥物。26.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述A型血友病是具有抑制物的血友病。27.根據(jù)權(quán)利要求l到14的任一項的抗體的用途，用于體外中和針對因子VIII的Cl結(jié)構(gòu)域的抑制性抗體的抑制活性。28.根據(jù)權(quán)利要求1到14的任一項的抗體的用途，用于因子VIII抑制性抗體的體外檢測和/或純化。29.—種包含根據(jù)權(quán)利要求1到14的任一項的抗體的藥物。全文摘要本發(fā)明涉及針對結(jié)合因子VIII的C1結(jié)構(gòu)域的因子VIII抑制性抗體的抗獨特型單克隆抗體，還涉及產(chǎn)生這種抗獨特型單克隆抗體的細(xì)胞系，涉及所述抗獨特型單克隆抗體作為藥物的用途，以及更特別地涉及它用于制造用于治療血友病A的藥物的用途。文檔編號C07K16/42GK101522718SQ200780013605公開日2009年9月2日申請日期2007年2月26日優(yōu)先權(quán)日2006年2月24日發(fā)明者C·貝倫斯,J·-G·吉勒斯,J·-M·圣-雷米,M·G·杰奎明申請人:Lfb生物科技公司