專利名稱：早老素5抑制因子抗原表位、抗早老素5抑制因子抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。具體地，涉及一種早老素5抑制因子抗原表位、抗早老素5抑制因子抗體。本發(fā)明還涉及分別含有所述抗原表位或抗體的組合物、以及所述抗體在檢測(cè)早老素5抑制因子中的用途。
背景技術(shù)：
早老素5抑制因子(又稱Spr-5，酶分類號(hào)EC:1)是定位于水稻第四號(hào)染色體上的基因，早老素5抑制因子是一個(gè)組織特異性基因，在葉中有特異性表達(dá)。它所表達(dá)的早老素5抑制因子蛋白質(zhì)，其構(gòu)象與人基因KIAA0601所編碼的多胺氧化酶類似。水稻早老素5 抑制因子是位于葉綠體上的具有電子載體活性和氧化還原活性的蛋白酶，屬于氨基氧化酶家族。這個(gè)家族由各種各樣的氨基氧化酶組成，包括許多的多胺氧化酶(PAO)和各種黃素多巴胺氧化酶(MAO)。在植物、細(xì)菌和原生動(dòng)物中PAOs把亞精胺和精胺氧化成氨基丁縮醛、 雙氨基丙烷和過氧化氫，參與到多胺的分解代謝中。在其他生物中，大部分的早老素5抑制因子質(zhì)導(dǎo)致hop-Ι的低表達(dá)。早老素5抑制因子與抑制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體具有同源性，它的抑制活性需要功能性的早衰蛋白H0P-1，并通過非等位基因特異性使sel-12Egl表型低表達(dá)。水稻(Oryzae Sativa L.)是世界上最重要的糧食作物，也是單子葉植物的模式植物，它為全球近一半的人口提供食物。水稻基因組測(cè)序工作的成果極大地推動(dòng)了水稻相關(guān)研究的進(jìn)展，帶動(dòng)了水稻轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，目前一些研究功能基因組學(xué)的新技術(shù)如cDNA微陣列、基因芯片、基因表達(dá)系統(tǒng)分析、基因敲除等在分析基因表達(dá)、發(fā)掘基因資源上取的了很大進(jìn)展，很多與優(yōu)良性狀相關(guān)的基因被克隆并轉(zhuǎn)化應(yīng)用。在研究基因功能過程中，作為一種靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀的技術(shù)，蛋白質(zhì)印記(Western Blot)表現(xiàn)出了良好的效果。蛋白印跡(Western Blot)是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法，用于檢測(cè)經(jīng)電泳或斑點(diǎn)雜交后固定于膜上的蛋白質(zhì)。特異、穩(wěn)定的液態(tài)酶標(biāo)抗體和相應(yīng)的底物，保證了快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)；而避免了放射性物質(zhì)的使用，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)，對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。然而，迄今為止，在水稻生長(zhǎng)發(fā)育過程中表達(dá)的早老素5抑制因子基因的功能研究目前并不清楚。并且在現(xiàn)有技術(shù)中，通常制備的多克隆抗體特異性不高，用于檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)會(huì)存在準(zhǔn)確性不足的問題。另一方面，如果用早老素5抑制因子制備抗原的話，如果是采用重組表達(dá)的方法，步驟比較繁瑣，如果是采用化學(xué)合成的方法，全長(zhǎng)的氨基酸序列有492 個(gè)氨基酸，合成很困難，而且蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的重建是一個(gè)很困難的工作，再現(xiàn)與生物體內(nèi)相同的空間構(gòu)象仍然是現(xiàn)階段蛋白質(zhì)學(xué)研究的難點(diǎn)。一般來說抗原表位合成簡(jiǎn)易，準(zhǔn)確性高，成本低廉，空間構(gòu)象容易再現(xiàn)，因此有必要開發(fā)一種具有代表早老素5抑制因子本身的抗原表位(antigenic determinant, AD)(又稱抗原決定簇，是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán))來代替全長(zhǎng)蛋白。盡管目前已經(jīng)有用于預(yù)測(cè)抗原表位的軟件，例如ΒΕΡΙΤ0ΡΕ軟件，但是預(yù)測(cè)得到
3的抗原表位中會(huì)有30%左右的非有效抗原表位，即不能特異性地代表抗原的抗原表位， 或者不能引發(fā)免疫應(yīng)答(Chang HT, Liu CH, Pai Tff. Estimation and extraction of B-cell linear epitopes predicted by mathematical morphology approaches. J Mol Recognit. 2008Nov_Dec；21(6) :431-41)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明人在通過BEPIT0PE軟件預(yù)測(cè)得到多個(gè)抗原表位序列的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)和不懈的努力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在預(yù)測(cè)的40個(gè)抗原表位中有一個(gè)抗原表位序列DNISLKNWDQEHVL(SEQID NO 3)是最有效的抗原表位，并且其具有良好的抗原特異性，并且制備了能與該蛋白酶特異免疫結(jié)合的抗體，該抗體具有足夠的靈敏性和準(zhǔn)確性。由此提供了下述發(fā)明本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種早老素5抑制因子抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，為了增加與載體的交聯(lián)性，在上述抗原表位的N末端添加了一個(gè)半胱氨酸(半胱氨酸提供二硫鍵與載體交聯(lián))，得到序列為 CDNISLKNWDQEHVL(SEQ ID NO 4)的抗原表位。半胱氨酸也可以加在多肽的C末端，得到序列為DNISLKNWDQEHVLC(SEQ ID NO 5) 的抗原表位。末端加1個(gè)半胱氨酸就可以了。如果在同一端加多個(gè)半胱氨酸，導(dǎo)致成本上升，而且會(huì)影響抗體的特異性，并且二硫鍵密度太大，而實(shí)際上也不需要這么多二硫鍵。另外不宜在N末端和C末端都加半胱氨酸，因?yàn)橐粋€(gè)抗原表位和一個(gè)載體結(jié)合，如果在兩端分別加1 個(gè)半胱氨酸，半胱氨酸與載體結(jié)合后，抗原表位少了游離端，反而不利于產(chǎn)生抗體。本發(fā)明的抗原表位可以通過常規(guī)的肽合成技術(shù)化學(xué)合成得到，也可以在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)得到；優(yōu)選的是化學(xué)合成。本發(fā)明的還一方面涉及一種組合物，其包含SEQ ID NO :3或SEQID NO :4或SEQ ID NO :5所示的早老素5抑制因子抗原表位，任選地，可以含有免疫佐劑，例如氫氧化鋁、弗氏完全佐劑、或者弗氏不完全佐劑等。本發(fā)明的還一方面涉及一種早老素5抑制因子抗原表位-載體復(fù)合物；其中，所述早老素5抑制因子抗原表位為SEQ ID NO 3或SEQID NO 4或SEQ ID NO 5所示的早老素 5抑制因子抗原表位，所述載體可以是鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)、BSA、或酪蛋白等。本發(fā)明的還一方面涉及一種抗早老素5抑制因子抗體，所述抗早老素5抑制因子抗體能夠特異性地結(jié)合SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示的早老素5抑制因子抗原表位。所述抗早老素5抑制因子抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。本發(fā)明的抗早老素5抑制因子多克隆抗體可以得自各種常規(guī)制備多克隆抗體的動(dòng)物，例如山羊，兔子，大鼠，小鼠等。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以根據(jù)SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或SEQ ID N0: 5所示的早老素5抑制因子抗原表位制備單克隆抗體，具體操作可以參見本領(lǐng)域的技術(shù)手冊(cè)，也可以參考文獻(xiàn)例 Naturel975Kohler & Milstein Vol 256，p495。本發(fā)明的還一方面涉及一種含有抗早老素5抑制因子多克隆抗體的血清(簡(jiǎn)稱多
4抗血清)，其通過使用SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5所示的抗原表位免疫動(dòng)物制得。本發(fā)明的還一方面涉及一種抗早老素5抑制因子多克隆抗體制備方法，包括將 SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示的早老素5抑制因子抗原表位作為抗原免疫動(dòng)物的步驟。任選地，所述免疫步驟可以加入佐劑，例如氫氧化鋁、弗氏完全佐劑、或者弗氏不完全佐劑，等等。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗早老素5抑制因子多克隆抗體制備方法，包括如下步驟1)將SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5所示的早老素5抑制因子抗原表位作為抗原免疫動(dòng)物；2)取血，離心收集多抗血清；和3)純化步驟2)中的多抗血清，得到抗早老素5抑制因子多克隆抗體。本發(fā)明的還一方面涉及一種組合物，其包含本發(fā)明的抗早老素5抑制因子多克隆抗體。本發(fā)明的還一方面涉及一種早老素5抑制因子檢測(cè)劑，其包含本發(fā)明的抗早老素 5抑制因子多克隆抗體。其中早老素5抑制因子的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)如下MDQPSNGFAAGGLFLRHIDGQNASPPSVIVIGGGISGIAAARALSNASFKVTLLESRDRLGGRVHTDYS FGCPIDMGASWLHGVCNENSLAPLIRLLGLRLYRTSGDNSVLYDHDLESYALFDKDGRQVPQEIVTKVGETFEKILK
ETVKVRAEHEDDMPLIQAISI VLDRNPHLKLDGLQYEVLQff CICRLEAWFATDV |DNISLKNWDQEHVL| rGGHGL
MVHGYDPVIKALAQDLDIHLNHRVTKIIQRYNKTIVCVEDGTSFVADAAIITVPLGVLKANIIKFEPELPDffKLSSI SDLGIGIENKIALRFNSVFWPNVEVLGRVAPTSNACGYFLNLHKATGHPVLVCMVAGRFAYEFEKLSDEESVNFVMS QLKKMLPGATEPVQYLVSRWGTDPNSLGSYSCDLVGKPADLYERFCAPVGNLFFAGEAACIDHSGSVHGAYSSGIVA AEDCRRHLSTQLGISDLFQVGKIIMREEMTEVMVPFQISRL(SEQ IDNO 1)其中，加邊框的序列為SEQ ID NO :3。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的抗早老素5抑制因子多克隆抗體在制備檢測(cè)早老素5抑制因子的藥物中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及一種檢測(cè)早老素5抑制因子的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的抗早老素5抑制因子多克隆抗體的步驟。具體地，包括如下步驟1)將待測(cè)樣品與本發(fā)明的抗早老素5抑制因子多克隆抗體孵育，使所述的抗早老素5抑制因子多克隆抗體與待測(cè)樣品中的早老素5抑制因子特異性結(jié)合，由此形成免疫復(fù)合物；和2)檢測(cè)是否存在免疫復(fù)合物。上述檢測(cè)早老素5抑制因子的方法可以檢測(cè)早老素5抑制因子的有無、對(duì)其進(jìn)行半定量(例如western blot方法)；在有早老素5抑制因子標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，還可以通過 ELISA方法對(duì)早老素5抑制因子進(jìn)行定量檢測(cè)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述早老素5抑制因子為水稻的早老素5抑制因子。 具體的，所述水稻為水稻93-11。發(fā)明的有益效果
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1)本發(fā)明提供的多克隆抗體，特異性和靈敏度高，具有很高的應(yīng)用價(jià)值；2)本發(fā)明提供的早老素5抑制因子抗原合成簡(jiǎn)易，準(zhǔn)確性高。本發(fā)明提供的抗原表位是經(jīng)軟件預(yù)測(cè)選出的抗原表位片段后化學(xué)合成的，片段短小，容易合成，空間構(gòu)象再現(xiàn)
各易ο3)本發(fā)明提供的抗體制備方法簡(jiǎn)單，收獲量大。取合成的抗原1-ang免疫新西蘭大白兔，每隔14天加強(qiáng)免疫一次；第2次加強(qiáng)免疫后7天耳靜脈取血，離心收集多抗血清， 獲得大量的多克隆抗體。4)通過本發(fā)明獲得早老素5抑制因子蛋白多克隆抗體，除了可以用于檢測(cè)早老素 5抑制因子基因在植物中早老素5抑制因子蛋白表達(dá)以外，還應(yīng)用于研究早老素5抑制因子結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)的多個(gè)方面通過免疫熒光檢測(cè)，可以檢測(cè)早老素5抑制因子在轉(zhuǎn)基因植物中的分布；Western blot分析早老素5抑制因子在轉(zhuǎn)基因植物中是否表達(dá)；免疫熒光檢測(cè)可以確定蛋白表達(dá)的部位；確定表達(dá)的蛋白是在葉片、莖稈、種子、還在根部等.此外，在對(duì)水稻的研究中，本發(fā)明的多克隆抗體可應(yīng)用于水稻蛋白質(zhì)水平的科學(xué)研究中，也可以用于免疫共沉淀、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白芯片、免疫組化及細(xì)胞定位等實(shí)驗(yàn)中，此外還可能用于其它植物的相關(guān)研究。


圖1 使用抗早老素5抑制因子多克隆抗體對(duì)早老素5抑制因子在水稻不同組織的免疫印跡檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1 候選抗原表位的預(yù)測(cè)水稻早老素5抑制因子對(duì)應(yīng)的基因在GenBank中的基因ID是NP_001(^4219. 1。 讀碼框序列如下ATGGACCAGCCTTCTAATGGCTTCGCCGCCGGAGGTCTTTTTCTTCGTCACATTGATGGGCAAAATGCC TCTCCCCCTTCTGTCATTGTGATTGGTGGAGGGATTTCAGGCATTGCAGCTGCTCGTGCGCTGTCTAATGCTTCGTT TAAGGTCACACTATTAGAGTCACGGGACCGACTTGGTGGCCGTGTGCATACTGACTATTCTTTTGGCTGCCCAATTG ACATGGGAGCATCTTGGTTGCATGGTGTATGCAATGAGAATTCATTGGCACCACTGATTAGGTTGCTTGGCCTTAGA TTATATCGCACCAGTGGTGATAACTCTGTGCTATATGACCATGATCTGGAGAGCTATGCTCTCTTTGATAAGGATGG TCGTCAAGTTCCCCAGGAGATAGTGACAAAAGTCGGGGAAACATTTGAGAAAATTCTTAAGGAGACGGTGAAAGTAA GAGCTGAACATGAAGATGACATGCCTCTTATTCAAGCCATCTCAATTGTGCTTGACAGGAATCCACACCTAAAGCTT GATGGTTTGCAATATGAAGTACTGCAGTGGTGCATATGTAGGCTGGAGGCATGGTTTGCCACAGATGTGGATAATAT ATCTCTGAAAAATTGGGATCAGGAACATGTTCTTACTGGTGGCCATGGGCTTATGGTGCATGGTTATGATCCTGTTA TCAAAGCTCTCGCGCAAGATCTTGATATCCACCTGAACCACAGGGTTACCAAAATCATCCAGAGGTACAACAAAACT
6ATAGTATGTGTTGAAGATGGGACAAGCTTTGTTGCAGATGCTGCTATAATAACTGTCCCTCTTGGTGTACTTAAAGC AAATATCATCAAGTTTGAACCTGAGCTCCCAGATTGGAAGCTTTCATCAATATCTGATCTTGGTATTGGCATTGAGA ACAAAATAGCCCTCCGCTTCAATAGTGTATTTTGGCCAAATGTAGAAGTGCTAGGCAGGGTTGCCCCAACATCAAAT GCCTGCGGTTACTTTCTTAACCTTCACAAAGCCACAGGGCATCCGGTTCTTGTATGCATGGTAGCAGGAAGATTCGC ATATGAATTCGAGAAGCTATCCGATGAAGAATCCGTAAACTTTGTCATGTCTCAGCTCAAGAAAATGCTACCAGGAG CTACTGAACCGGTCCAGTATTTGGTTTCAAGGTGGGGAACCGACCCGAATTCGCTTGGTTCTTATTCCTGCGACCTT GTTGGGAAGCCAGCTGACTTGTATGAAAGATTCTGTGCTCCGGTGGGCAACCTGTTTTTCGCTGGGGAGGCCGCCTG CATCGATCACTCTGGGTCCGTGCATGGAGCTTATTCTTCAGGCATTGTTGCTGCAGAGGATTGCCGAAGGCATCTGT CGACGCAGCTAGGCATCTCCGACCTTTTCCAGGTTGGGAAGATTATCATGAGGGAGGAGATGACTGAAGTCATGGTC CCCTTCCAGATATCCAGGCTGTGA(SEQ ID NO 2)所編碼的水稻早老素5抑制因子全長(zhǎng)序列如下MDQPSNGFAAGGLFLRHIDGQNASPPSVIVIGGGISGIAAARALSNASFKVTLLESRDRLGGRVHTDYS FGCPIDMGASWLHGVCNENSLAPLIRLLGLRLYRTS⑶NSVLYDHDLESYALFDKDGRQVPQEIVTKVGETFEKILK
ETVKVRAEHEDDMPLIQAISIVLDRNPHLKLDGLQYEVLQWCICRLEAWFATDV |DNISLKNWDQEHVL| TGGHG
LMVHGYDPVIKALAQDLDIHLNHRVTKIIQRYNKTIVCVEDGTSFVADAAIITVPLGVLKANIIKFEPELPDWKLSS ISDLGIGIENKIALRFNSVFWPNVEVLGRVAPTSNACGYFLNLHKATGHPVLVCMVAGRFAYEFEKLSDEESVNFVM SQLKKMLPGATEPVQYLVSRWGTDPNSLGSYSCDLVGKPADLYERFCAPVGNLFFAGEAACIDHSGSVHGAYSSGIV AAEDCRRHLSTQLGISDLFQVGKIIMREEMTEVMVPFQISRL(SEQ IDNO :1，其中加框的序列為 SEQ ID NO 3)早老素5抑制因子來源于水稻(Oryzae Sativa L.)，具有序列表中的SEQ ID NO: 1序列；及與序列表中SEQ ID NO :1序列中任意連續(xù)14個(gè)氨基酸的相似性大于80%的多肽片段。然后根據(jù)SEQ ID NO :3，用ΒΕΡΙΤ0ΡΕ軟件對(duì)水稻早老素5抑制因子基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原表位的預(yù)測(cè)。本實(shí)施例中使用了 ΒΕΡΙΤ0ΡΕ軟件提供的五種方法Mandard、 KarpIus> Emini> Amphiphi> Pellequer,以及這五禾中方法的綜合方法 cons_Sta_Kar_Emi_ Amp_Pel，所有參數(shù)選擇默認(rèn)。具體方法可以參考Odorico M, Pellequer J L. BEPITOPE predicting the location of continuous epitopes and patterns in proteins[J]. J Mol Recognit，2003，16(1) :20-22 —共預(yù)測(cè)得到了 40個(gè)候選的抗原表位，在TIGR水稻數(shù)據(jù)庫(kù)上篩選肽段結(jié)構(gòu)，選出抗原表位峰值較高的片段DNISLKNWDQEHVL(SEQ ID NO :3)。然后該片段在水稻蛋白質(zhì)庫(kù)(RAP-DB數(shù)據(jù)庫(kù)，網(wǎng)址http//rapdb. dna. affrc. go.jp/)進(jìn)行唯一性檢索(蛋白序列比對(duì))，確定了該片段在水稻蛋白質(zhì)庫(kù)中的唯一性。實(shí)施例2 抗原表位的化學(xué)合成實(shí)施例1中得到的候選抗原表位的兩端沒有半胱氨酸，為了實(shí)現(xiàn)與載體的交聯(lián)， 合成的序列需加入半胱氨酸，因此要合成的多肽序列為⑶NISLKNWDQEHVL(SEQ ID NO :4)。對(duì)SEQ ID NO 4所示的多肽序列進(jìn)行化學(xué)合成(由吉爾生化公司合成)，得到早老素5抑制因子的抗原表位。實(shí)施例3 抗原表位-KLH復(fù)合物的制備采用戊二醛連接法，將實(shí)施例2中合成的抗原表位的N端與交聯(lián)載體蛋白-鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)交聯(lián)，得到抗原表位-KLH復(fù)合物。
具體實(shí)施步驟如下將5mg合成多肽加入7mg KLH中，邊震蕩邊緩慢加入新鮮配制的3g/L戊二醛溶液 lml，室溫孵育池。以pH8. 5的硼酸緩沖液透析Mh，得到抗原表位-KLH復(fù)合物。實(shí)施例4 多抗血清的制備取Ι-aiig實(shí)施例3中制備的抗原表位-KLH復(fù)合物，免疫新西蘭大白兔，每隔14天加強(qiáng)免疫一次；第2次加強(qiáng)免疫后7天，耳靜脈取血，分離血清(5000rpm離心IOmin)，收集上清，測(cè)效價(jià)。同時(shí)按照相同的步驟，用抗原表位(SEQ ID NO 4)作為對(duì)照。具體步驟如下取l-2mg實(shí)施例3中制備的抗原表位-KLH復(fù)合物與等量的完全福氏佐劑充分乳化，形成油水包，于兔頸部和背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)約100 μ g。2周后加強(qiáng)免疫，劑量同前，用不完全福氏佐劑充分乳化后，于兔背部皮下多點(diǎn)注射；以后隔2周加強(qiáng)免疫1次；從第2次加強(qiáng)免疫開始，每次免疫7天后，經(jīng)耳靜脈取血測(cè)定抗體的效價(jià)。其中，耳靜脈取血進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)(ELI SA法)的步驟如下在96孔板上，每孔加入50μβ/πι1磷酸酪氨酸ΙΟΟμ 1，4°C過夜后，進(jìn)行包被，洗滌。 將按照前述方法制備的耳靜脈血的多抗血清稀釋為1 100，1 500,1 2500,1 3200， 1 12800,1 25600，每孔各加100μ 1，37°C保溫30min，洗滌。各加入1 100稀釋的羊抗兔Ig酶結(jié)合物100μ 1，37°C保溫30min，洗滌。加入TMB (3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺)100 μ 1， 20min后，加2mol/l的H2SO4終止反應(yīng)經(jīng)過2次加強(qiáng)免疫后，效價(jià)檢測(cè)的結(jié)果如下多抗血清(抗原表位-KLH復(fù)合物免疫)> 25600 (抗原表位-KLH復(fù)合物有免疫原性的最大稀釋倍數(shù)是51200)；裸肽免疫(抗原表位，SEQ ID NO 4)得到的多抗血清> 800(僅僅由抗原表位組成的裸肽具有免疫原性的最大稀釋倍數(shù)是800)。上述結(jié)果已經(jīng)符合要求，遂于末次加強(qiáng)免疫7天后頸動(dòng)脈放血，收集血樣。將收集的血樣在3-4°C下靜置3-4小時(shí)，然后5000rpm離心10分鐘，收集血清，得到多抗血清(耳靜脈檢測(cè)效價(jià)符合要求后，頸動(dòng)脈取的血樣不必再檢測(cè)效價(jià))。無菌分裝保存于-80°C備用。實(shí)施例5 抗早老素5抑制因子多克隆抗體(多抗)的制備將實(shí)施例4中制備的多抗血清進(jìn)行純化，制得多克隆抗體(多抗)。將抗原表位DNISLKNWDQEHVL(SEQ ID NO 4)多肽與溴化氰活化的kpharose 4B 偶聯(lián)，制備多肽親和層析柱。將制備的多抗血清加入到以上制備的層析柱中，放置于4°C孵育過夜后，洗脫抗體，即得到抗早老素5抑制因子多克隆抗體(多抗)。實(shí)施例6 多抗對(duì)早老素5抑制因子的特異性檢驗(yàn)選取水稻93-11不同發(fā)育階段和不同部位的組織，提取總蛋白質(zhì)，用Bradford法測(cè)定樣品水稻總蛋白含量，每個(gè)樣品分別上樣為苗期地上部上樣量7 yL ；分蘗期葉片上樣量8 μ L ；孕穗期劍葉上樣量7 μ L ；開花期劍葉上樣量6 μ L ；成熟期劍葉上樣量 6 μ L ；苗期地下部上樣量6 μ L ；分蘗期莖上樣量10 μ L ；開花期穗子上樣量3 μ L ；成熟期種子上樣量5μΚ，利用制備的eEF-ld多克隆抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)(圖1)。
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總蛋白質(zhì)樣品的制備用液氮研磨上述新鮮水稻組織至粉末狀，分裝到預(yù)冷離心管中，每300 μ 1粉末加入800 μ 1蛋白質(zhì)裂解液(62. 5mmol/L ρΗ7· 4Tris · HC1，10%甘油， 2% SDS,20mmol/LNaF,2mmol/L EDTA，lmmol/L PMSF,5% β -巰基乙醇)，迅速混勻并置于冰上，冰水混合物中孵育10分鐘，約每2分鐘震蕩混勻1次。4V，12000r/min離心15分鐘。取上清，轉(zhuǎn)移到新的離心管中，-70°C保存。得到水稻總蛋白。Western 印記免疫反應(yīng)western bloting為將提取的水稻蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，用制備的抗體室溫孵育3h，TTBS(2mmol/L Tris · HClpH7. 6，13. 6mmol/LNaCl,0. 1% Tween 一 20)洗膜 3 次，每次 5min，之后加入羊抗兔二抗室溫孵育lh，TTBS洗膜3次，每次5min，加ECL Plus檢測(cè)液檢測(cè)，暗室曝光5min.免疫反應(yīng)檢測(cè)到苗期(地上部)、分蘗期(葉片)、孕穗期(劍葉)、開花期(劍葉)、成熟期(劍葉)五個(gè)時(shí)期的葉片樣品中與理論中的35KD分子量相接近的條帶，該蛋白質(zhì)在不同組織中有特異性表達(dá)。需要說明的是，盡管水稻全蛋白中可能有很多分子量與其相似的蛋白，但是與多抗特異性結(jié)合的就只有早老素5抑制因子一個(gè)。關(guān)于特異性的預(yù)測(cè)SEQ ID NO :4 經(jīng)過 http://rice.plantbiology.msu.edu/blast.shtml (與實(shí)施例 1 中的http://rapdb. dna. affrc. go. jp/作用相同，目的是再次檢驗(yàn)唯一性)的檢查，確定此多肽序列特異，該序列在水稻總蛋白中唯一確定早老素5抑制因子。盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式
已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
權(quán)利要求
1.一種早老素5抑制因子抗原表位，其由SEQ ID NO 3或SEQID NO 4或SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列組成。
2.一種組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的早老素5抑制因子抗原表位，任選地，還含有用于免疫的佐劑。
3.一種早老素5抑制因子抗原表位-載體復(fù)合物，其中，所述早老素5抑制因子抗原表位為權(quán)利要求1所述的早老素5抑制因子抗原表位，所述載體選自鑰孔戚血藍(lán)素、BSA、以及酪蛋白。
4.一種抗早老素5抑制因子抗體的制備方法，包括使用權(quán)利要求1的早老素5抑制因子抗原表位或者權(quán)利要求2的組合物或者權(quán)利要求3的復(fù)合物的步驟；任選地，所述抗早老素5抑制因子抗體是單克隆抗體或者多克隆抗體；具體地，所述制備方法包括如下步驟1)將權(quán)利要求1所述的早老素5抑制因子抗原表位或者權(quán)利要求2的組合物或者權(quán)利要求3的復(fù)合物免疫動(dòng)物得到的血樣進(jìn)行離心，得到多抗血清；和2)純化步驟1)中的多抗血清，得到抗早老素5抑制因子多克隆抗體。
5.一種多抗血清，其由權(quán)利要求1的早老素5抑制因子抗原表位或者權(quán)利要求2的組合物或者權(quán)利要求3的復(fù)合物免疫動(dòng)物制得。
6.一種抗早老素5抑制因子抗體，其能夠特異地結(jié)合權(quán)利要求1所述的早老素5抑制因子抗原表位，任選地，其為多克隆抗體或者單克隆抗體。
7.一種組合物，其包含權(quán)利要求6所述的抗早老素5抑制因子抗體。
8.一種早老素5抑制因子檢測(cè)劑，其包含權(quán)利要求6所述的抗早老素5抑制因子抗體。
9.權(quán)利要求6所述的抗體在制備檢測(cè)早老素5抑制因子的藥物中的用途。
10.一種檢測(cè)早老素5抑制因子的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求6所述的抗早老素5抑制因子多克隆抗體的步驟；具體地，所述早老素5抑制因子為水稻的早老素5抑制因子。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及早老素5抑制因子抗原表位、抗早老素5抑制因子抗體及其用途。具體地，所述早老素5抑制因子抗原表位具有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的序列。本發(fā)明還涉及一種抗早老素5抑制因子多克隆抗體，所述多克隆抗體與上述抗原表位特異性結(jié)合。所述多克隆抗體具有高的特異性和效價(jià)。本發(fā)明還涉及所述多克隆抗體的制備方法和用途、含有該多克隆抗體的組合物、以及檢測(cè)早老素5抑制因子的方法。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102206252SQ20101052030
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月25日
發(fā)明者劉斯奇, 史曉儒, 尹成園, 朱健輝, 韓宇寧 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司