專利名稱：細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白作為助分泌因子提高外源基因在畢赤酵母中分泌表達(dá)量的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白及其編碼基因的新用途，尤其涉及細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白及其編碼基因作為助分泌因子或助分泌基因以提高外源基因在畢赤酵母中分泌表達(dá)量中的新用途，屬于細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白或其編碼基因的用途領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
畢赤酵母(Pichia pastoris)是單細(xì)胞真核生物，既有類似原核生物的生長特征， 又有一般真核生物的細(xì)胞生物學(xué)特性，是目前最成功的外源基因真核表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有易于操作培養(yǎng)，高密度發(fā)酵水平很高，表達(dá)菌株穩(wěn)定，正確翻譯和翻譯后加工修飾更接近于高等真核生物等優(yōu)點。除此之外畢赤酵母極少分泌自身蛋白，在其培養(yǎng)液中除目的蛋白外，幾乎不含任何其它蛋白，這樣就使得目的蛋白的純化變得非常簡單，而且許多外源基因的分泌表達(dá)量可達(dá)到每升克級以上，因此利用該系統(tǒng)可以極大的降低目的蛋白的生產(chǎn)成本。但是，如果目的蛋白不能分泌到胞外，其產(chǎn)量一般不會高于細(xì)胞總蛋白量的 1%，并且目的蛋白的純化將變得非常復(fù)雜，蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本自然也會非常高。因此盡管科研人員非常希望利用畢赤酵母高效分泌表達(dá)外源基因，然而到目前為止仍然有許多基因 (尤其是那些在原始菌或細(xì)胞中不分泌表達(dá)的基因)不能在畢赤酵母中分泌表達(dá)或分泌表達(dá)量非常低，這個問題也成為限制該表達(dá)系統(tǒng)更廣泛應(yīng)用的一個關(guān)鍵因素。
有研究發(fā)現(xiàn)若蛋白在畢赤酵母中表達(dá)但不分泌，可以通過在蛋白質(zhì)N端融合一些蛋白質(zhì)標(biāo)簽來，表達(dá)提高目的蛋白的分泌量。已有的助分泌因子主要有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶 (glutathione-S-transf erase, GST),綠色突光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP), 硫氧還蛋白(thioredoxin),泛素(ubiquitin),纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cellulose binding domain, CE )，翻譯起始因子 IF2 的 Domainl,綠色突光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)以及來源于大腸桿菌的麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein,MBP)。這些蛋白質(zhì)標(biāo)簽可以提高一些特定蛋白質(zhì)在畢赤酵母中的分泌量。
細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白(Cytochromes heme binding domain, CHBD)為蛋白質(zhì)細(xì)胞色素b5 (cytochrome b5)中N端的一部分(N端100個氨基酸)。該蛋白質(zhì)廣泛存于高等動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，具有分子量小、可溶性大、穩(wěn)定性高等優(yōu)點，作為電子傳遞蛋白，可參與生物體組織中一系列重要的氧化還原反應(yīng)，如脂質(zhì)和類固醇的合成代謝等。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白的一種新用途；
本發(fā)明的另外一個目的是提供一種提高外源基因在畢赤酵母中分泌表達(dá)量的方法。
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
本發(fā)明通過試驗發(fā)現(xiàn)，將細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白(CHBD)編碼基因(SEQ IDNo. I)與外源基因進(jìn)行融合并轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)，能有效提高外源基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)量。進(jìn)一步的，本發(fā)明將細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因通過密碼子優(yōu)化、提高mRNA 二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性等措施得到優(yōu)化的細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因(CHBD-O) (SEQ ID No. 2)，將該優(yōu)化的細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因與外源基因進(jìn)行融合并轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)，能夠非常顯著的提高外源基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)量。
由此，可將細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白作為助分泌因子或?qū)⒓?xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因或優(yōu)化的細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因作為助分泌基因應(yīng)用于提高外源基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)量。
本發(fā)明按照畢赤酵母的偏嗜性對細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白(CHBD)編碼基因進(jìn)行了優(yōu)化，通過在原始的CHBD或優(yōu)化后的CHBD-O標(biāo)簽的C端引入能在畢赤酵母中能被KeX2 蛋白酶識別的切割位點(EKREAEA) (SEQ IDNo. 5)，然后再加上外源基因得到融合基因，所表達(dá)的融合蛋白在分泌出胞外的過程中能被KeX2蛋白酶切割成野生型蛋白質(zhì)和CHBD助分泌因子，能夠更有效的提高外源基因的分泌表達(dá)量；由于該方法在外源蛋白質(zhì)的N端不增加多余的序列，因而不會影響分泌蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。
本發(fā)明通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域作為蛋白標(biāo)簽可以提高許多種蛋白質(zhì)(如甲基對硫磷水解酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶等)的分泌表達(dá)量，具有較好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種提高外源基因在畢赤酵母中分泌表達(dá)量的方法， 該方法包括以下步驟
將細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因或優(yōu)化的細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因與外源基因融合在一起，得到融合基因；將融合基因與酵母表達(dá)載體可操作性的連接在一起構(gòu)建得到含有所述融合基因的重組酵母表達(dá)載體；將所述重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)。
優(yōu)選的，將將細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因與外源基因融合之前，先將細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白的C端引入在畢赤酵母中能被KeX2蛋白酶識別的切割位點 (EKREAEA)，然后再加上外源基因。
作為本發(fā)明一個優(yōu)選的具體實施方案，本發(fā)明將細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白的C端引入在畢赤酵母中能被KeX2蛋白酶識別的切割位點(EKREAEA)，然后再加上甲基對硫磷水解酶(mph)編碼基因，得到融合基因CHBD-O-MPH ;將該融合基因與畢赤酵母表達(dá)載體 pPIC9相連接構(gòu)建得到重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-chbd-o-mph ;作為對照,本發(fā)明將甲基對硫磷水解酶基因與畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9相連接構(gòu)建得到重組畢赤酵母表達(dá)載體 pPIC9-mph ;將所構(gòu)建的重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-chbd-o_mph以及pPIC9_mph分別轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)；試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沒有融合細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白基因的 MPH在畢赤酵母表達(dá)時分泌量極低，其在畢赤酵母中表達(dá)分泌量極低，通過測量50個陽性克隆子，經(jīng)誘導(dǎo)后其上清平均酶活性為O. 02U/mL。而將助分泌因子(CHBD-O)融合至mph的 N-端后，挑取50個陽性克隆子，經(jīng)搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，CHBD-O-MPH的畢赤酵母重組菌株經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清平均能達(dá)到O. 31U/mL,因此該融合蛋白使MPH的畢赤酵母表達(dá)分泌量提高13倍，因此CHBD或CHBD-O助分泌因子可用于提高M(jìn)PH等外源基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)量。此外，融合蛋白表達(dá)后在分泌出胞外的過程中能被KeX2蛋白酶切割成野生型蛋白質(zhì)和CHBD助分泌因子質(zhì)，外源蛋白質(zhì)的N端不增加額外的序列，因而不會影響分泌蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。


圖I對硝基酚含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖2重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-chbd-o_mph、pPIC9-chbd_mph的圖譜。
圖3MPH、融合標(biāo)簽CHBD-MPH、融合標(biāo)簽CHBD-O-MPH畢赤酵母表達(dá)初篩菌株誘導(dǎo)上清酶活分布箱須圖；1 :畢赤酵母中單獨(dú)表達(dá)MPH的初篩菌株誘導(dǎo)48h后上清酶活分布；2 畢赤酵母中表達(dá)MPH的N端融合CHBD的初篩菌株誘導(dǎo)48h后上清酶活分布；3 :畢赤酵母中表達(dá)MPH的N端融合優(yōu)化的CHBD的初篩菌株誘導(dǎo)48h后上清酶活分布；
箱外圓圈表示異常值，箱三條橫線代從下至上分別代表第一四分位數(shù)(初篩的重組畢赤酵母總體數(shù)目中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清酶活從低至高計數(shù)，1/4倍初篩菌株總體數(shù)目的酶活值為第一四分位線)，中位數(shù)(初篩的重組畢赤酵母中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清酶活數(shù)據(jù)中除異常值外其他酶活數(shù)的平均值)，第三四分位數(shù)(初篩的重組畢赤酵母總體數(shù)目中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清酶活從低至高計數(shù)，3/4倍初篩菌株總體數(shù)目的酶活值為第一四分位線)；箱外下橫線分別代表酶活數(shù)據(jù)分布狀態(tài)的最小值，箱外上橫線分別代表酶活數(shù)據(jù)分布狀態(tài)的最大值；箱面積越小，代表酶活值越集中。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。保護(hù)
I實驗材料
I. I菌株，質(zhì)粒，工具酶，試劑
大腸桿菌ToplO菌株和畢赤酵母GS115購自Invitrogen公司；質(zhì)粒pPIC9購自 Invitrogen公司；Fast Pfu購自全式金生物技術(shù)有限公司；Taq polymeras、DNA膠回收試劑盒購買自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白胨(Tryptone)和酵母提取物(Yeast extract)購買自英國Oxford公司；YNB購買自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；甲基對硫磷購于國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，Ikb的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)定購于鼎國公司，dNTP、DNA純化試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均定購于天根生化科技有限公司，瓊脂糖購于 Sigma公司，其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。
I. 2培養(yǎng)基及有關(guān)溶液的配制
LB培養(yǎng)基氯化鈉10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，用3M的氫氧化鈉調(diào)節(jié)至 PH7. O (固體培養(yǎng)基配制時添加I. 5%的瓊脂粉)，121° C，15min高壓蒸汽滅菌。
質(zhì)粒提取溶液I :50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl (pH8. O)，IOmM EDTA (pH8. O)。
質(zhì)粒提取溶液II :0. 2M氫氧化鈉，1%SDS,現(xiàn)用現(xiàn)配。
質(zhì)粒提取溶液III 5M乙酸鉀60. OmL，冰乙酸11. 5mL，水28. 5mL。
3M醋酸鈉(NaAc)緩沖液(pH 5. 2):量 600mL 的蒸餾水，稱取 408. 24g NaAC ·3Η20， 用冰醋酸調(diào)至pH 5. 2，定容至1L。
TAE (50 X) 242g Tris 堿，57. ImL 冰乙酸，IOOmL O. 5M EDTA (ρΗ8· O)，無菌水定容至IL0
YPD :蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L,酵母膏10g/L, 108° C, 30min高壓蒸汽滅菌。
BMGY培養(yǎng)基蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，磷酸二氫鉀11. 9g/L，磷酸氫二鉀3g/ L，甘油10mL/L，121° C，15min高壓蒸汽滅菌，待冷卻至室溫加入YNB 13. 4g/L，生物素 4Xl(T4g/L，0. 5% 的甲醇。
BMMY培養(yǎng)基蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，磷酸二氫鉀11. 9g/L，磷酸氫二鉀3g/ L，121° C，15min高壓蒸汽滅菌，待冷卻至室溫加入YNB13. 4g/L，生物素4X 10_4g/L，甲醇 5mL/L。
MD培養(yǎng)基瓊脂糖20g/L，葡萄糖20g/L，108° C，30min高壓蒸汽滅菌，冷卻后加入 YNB13. 4g/L，生物素 4X l(T4g/L。
SDS-PAGE 上樣緩沖液(2X) 100mM Tris-HCl (pH6. 8)、200mM 二硫蘇糖醇(DTT)、 4%SDS、0. 2%溴酚藍(lán)、10%甘油。
30%丙烯酰胺溶液29g丙烯酰胺，Ig N, N-亞甲叉丙烯酰胺，溶于IOOmL水。
Tris-甘氨酸電泳緩沖液25mM Tris 堿，250mM 甘氨酸(pH8. 3),0. 1%SDS。
考馬斯亮藍(lán)染液0. 24g考馬斯亮藍(lán)R250溶于90mL甲醇水(I: 1，v/v)和IOmL 冰乙酸。
脫色液90mL甲醇水(1:1, v/v)與IOmL冰乙酸混合至100mL。
實施例I pPIC9-chbd-mph、pPIC9-chbd-o_mph表達(dá)載體的構(gòu)建、在畢赤酵母中的表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量和酶學(xué)性質(zhì)分析
I、試驗方法
I. I細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CHBD)基因的優(yōu)化
對CHBD基因(全長300bp)(SEQ ID No. I)通過密碼子優(yōu)化、提高mRNA 二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性等措施得到SEQ ID No. 2所示的優(yōu)化的細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因。其中，對 65個堿基進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的GC含量由優(yōu)化前的50%下降到41. 33%，其在畢赤酵母中的密碼子適應(yīng)指數(shù)(Codon Adaptation Index,CAI)由優(yōu)化前的O. 69提高到O. 81。通過上述的密碼子的優(yōu)化手段有效提高了 CHBD基因翻譯的效率，最終顯著提高目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量。
CHBD基因優(yōu)化前轉(zhuǎn)錄出mRNA的吉布斯自由能為-90. 6，CHBD基因優(yōu)化后轉(zhuǎn)錄出 mRNA的吉布斯自由能為-78. lOkcal/mol，可見，優(yōu)化后的CHBD基因轉(zhuǎn)錄出mRNA的吉布斯自由能明顯提高，有利于維持mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)翻譯順利進(jìn)行，最終有效提高目的蛋白表達(dá)量。
I. 2 重組畢赤酵母表達(dá)載體 pPIC9-chbd-o_mph、pPIC9-chbd_mph 的構(gòu)建
將助分泌因子優(yōu)化的CHBD基因(SEQ ID No. 2) (CHBD-O)與mph基因(GenBank登錄號ACC63894)通過KeX2蛋白酶識別位點(SEQ ID No. 4)作為Linker進(jìn)行連接，并在基因的兩端設(shè)計酶切位點SnabI和Notl，得到一個完整的基因表達(dá)元件(SEQ ID NO. 6)，將該片斷進(jìn)行全基因合成，測序正確后，將其通過酶切位點SnabI和NotI連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9中，得到重組載體pPIC9-chbd-o_mph ；
按照同樣的方法，將未優(yōu)化的細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CHBD)基因(SEQID No. I)與 mph基因(GenBank登錄號ACC63894 )通過KeX2蛋白酶識別位點(SEQ ID No. 4)作為 Linker進(jìn)行連接，并在基因的兩端設(shè)計酶切位點SnabI和NotI，得到一個完整的基因表達(dá)元件(SEQ ID NO. 7)，將該片斷進(jìn)行全基因合成，測序正確后，將其通過酶切位點SnabI和 NotI連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9中，得到重組載體pPIC9-chbd-mph ；
重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-chbd-o_mph、pPIC9-chbd_mph的圖譜見圖2。
同時也通過酶切位點SnabI和NotI構(gòu)建了只有mph基因而沒有CHBD基因和 Linker序列的表達(dá)載體pPIC9_mph作為對照。
I. 3質(zhì)粒DNA的準(zhǔn)備
大量提取重組質(zhì)粒pPIC9-chbd-o_mph、pPIC9-chbd_mph 以及 pPIC9_mph,將質(zhì)粒進(jìn)行定量，保證DNA的量達(dá)到8 μ g以上。Bgl II線性化質(zhì)粒DNA，酶切體系見表I :
表I
重組質(zhì)粒IOOuL(IOug)IOXH Buffer40 μ LBgl II6μ LddH20255 μ L總體積400 μ L
將酶切體系置于37° C處理3h，加入1/10體積的3M NaAC (pH5. 2)，混勻。再加入混合液兩倍體積的冰浴無水乙醇，于-20° C放置30min后，12，OOOrpm離心IOmin, 75%乙醇洗滌兩次，真空冷凍抽干，溶水20 μ L，備用。
I. 4 GSl 15感受態(tài)制備
(I)挑取GS115單菌落到含20mL YPD液體培養(yǎng)基中，28° C搖床過夜培養(yǎng)。
(2)將過夜培養(yǎng)菌以1/100的接種量轉(zhuǎn)接至含IOOmL YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到OD600為I. 3-1. 5。
(3)將GS115菌液倒入兩個50mL的離心管中，4° C、3750rpm離心5min,棄離心后的上清。
(4)用等體積的冰預(yù)冷的去離子水重懸沉淀,4° C、3750rpm離心5min,棄離心后上清。
(5)用半體積的冰預(yù)冷的去離子水重懸沉淀,4° C、3750rpm離心5min,棄離心后上清。
(6)用1/10體積冰預(yù)冷的IM山梨醇輕柔重懸沉淀,4° C、3750rpm離心5min,棄離心后上清。
(7)用200 μ L預(yù)冷的IM山梨醇輕柔重懸沉淀，按每管80 μ L分裝成備用的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，保存于-70° C。
I. 5電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母
各取線性化的重組質(zhì)粒pPIC9-chbd-o_mph、pPIC9-chbd_mph 或 pPIC9_mph 約 8 μ g，各自加入一管分裝好的畢赤酵母感受態(tài)中，用槍頭輕柔攪動混勻于冰上靜置Imin 后，用移液槍轉(zhuǎn)移至洗干凈的直徑為O. 2cm的預(yù)冷電擊杯(BioRad)的底部，電擊儀電壓設(shè)置為2. 5kV,電容為25 μ F,電阻為400 Ω的程序進(jìn)行電擊操作。
電轉(zhuǎn)后，立即向電擊杯中加入ImL預(yù)冷的IM山梨醇，混勻后取200 μ L涂布MD平板，將平板倒置于30° C溫箱靜置培養(yǎng)。
I. 6酶活測定體系標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
甲基對硫磷水解酶(MPH)將甲基對硫磷農(nóng)藥水解為等摩爾的對硝基酚 (p-nitrophenol)及二乙基硫代磷酸酯，測定產(chǎn)物中的對硝基酚的含量即可計算出甲基對硫磷水解酶的酶活性。準(zhǔn)確稱取對硝基酚O. 0835g,先用少量95%乙醇溶解，然后用水定容至IOOmL,終濃度為6mM。如表2所示，將該6mM的母液用Tris-HCl (pH 8. O)稀釋成不同濃度的900 μ L體系，再加入10%TCA終止液，10%的Na2CO3顯色液，取200 μ L于96孔板中，用酶標(biāo)儀測量96孔板中樣品在405nm下吸光值，并繪制酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線。
表2對硝基酚含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
權(quán)利要求
1.細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白作為助分泌因子在提高外源基因在畢赤酵母(Pichiapastoris)分泌表達(dá)量中的應(yīng)用；其中，所述細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白的氨基酸序列為SEQID No. 3 所示。
2.優(yōu)化的細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQIDNo. 2所示。
3.一種融合基因，其特征在于含有SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
4.細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因或權(quán)利要求2所述優(yōu)化的細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因作為助分泌基因在提高外源基因在畢赤酵母(Pichia pastoris)分泌表達(dá)量中的應(yīng)用。
5.按照權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，包括將細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因或優(yōu)化的細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因與外源基因融合得到融合基因；將融合基因轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)。
6.按照權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的融合是將細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白的C端引入能在畢赤酵母中能被KeX2蛋白酶識別的切割位點，然后再加上外源基因；其中，所述切割位點的氨基酸序列為SEQID No. 5所示，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ IDNo. 4所示。
7.按照權(quán)利要求1、4、5或6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的外源基因是甲基對硫磷水解酶編碼基因。
8.一種提高外源基因在畢赤酵母(Pichia pastoris)中分泌表達(dá)量的方法，包括將細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因或權(quán)利要求I所述優(yōu)化的細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因與外源基因融合在一起得到融合基因；將融合基因與酵母表達(dá)載體可操作性的連接在一起構(gòu)建得到重組酵母表達(dá)載體；將重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)。
9.按照權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述的融合是將細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白的C端引入在畢赤酵母中能被KeX2蛋白酶識別的切割位點，然后再加上外源基因；其中，所述切割位點的氨基酸序列為SEQ IDNo. 5所示，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID No. 4所示。
10.按照權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述的外源基因是甲基對硫磷水解酶編碼基因；所述的酵母表達(dá)載體是畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白作為助分泌因子提高外源蛋白在畢赤酵母中分泌的用途。將細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因按畢赤酵母密碼子偏好進(jìn)行優(yōu)化并與外源基因進(jìn)行融合得到融合基因，將融合基因轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)能顯著提高外源基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)量。由此，本發(fā)明提供了細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白作為助分泌因子或其編碼基因作為助分泌基因的新用途。此外，融合有細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因的融合基因所表達(dá)的融合蛋白在分泌出畢赤酵母細(xì)胞外的過程中能被KeX2蛋白酶切割成野生型蛋白質(zhì)和細(xì)胞色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，使外源蛋白質(zhì)的N端不增加額外的序列，不影響分泌蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。
文檔編號C12N15/81GK102977206SQ20121046948
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者田 健, 伍寧豐, 初曉宇, 黃璐, 王平 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所